рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев

Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев - раздел Биология, Калинин Виталий Леонидович. Репликация Генома...

Калинин Виталий Леонидович. Репликация генома

 

СОДЕРЖАНИЕ

 

ГЛАВА 1. ДНК-полимеразы

Биосинтез ДНК. Общие определения

Бактериальные ДНК-полимеразы

ДНК-полимераза I E.coli

ДНК-полимераза II E.coli

ДНК-полимераза III E. coli

Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев

ДНК-полимераза a

ДНК-полимераза b

ДНК-полимераза g

ДНК-полимеразы d и e

ДНК-полимеразы археев

Скользящие зажимы ДНК-полимераз и их погрузчики

1.4.1. Скользящие зажимы – факторы процессивности ДНК-полимераз

Погрузчики скользящего зажима

Белки ААА+

g-Комплекс погрузчика зажима ДНК-полимеразы III E. coli

ЛИТЕРАТУРА

ГЛАВА 2. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ БЕЛКИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК

ДНК-геликазы

Общая характеристика геликаз

Свойства репликативной ДНК-геликазы DnaB E. coli

ДНК-геликаза репликативной вилки у эукариотов

Механизм действия гексамерных ДНК-геликаз

Погрузка гексамерных ДНК-геликаз на ДНК

Cопряжение гидролиза НТФ с транслокацией по онДНК

Расплетание днДНК

Белки, связывающие однонитевую ДНК

Праймазы

ДНК-лигазы

ДНК-топоизомеразы

ЛИТЕРАТУРА

ГЛАВА 3. Инициация репликации хромосомной ДНК

3.1. Инициация репликации хромосомы E. coli

Белок-инициатор DnaA

Минимальная область начала репликации oriC y E.coli

Этапы инициации репликации на ОНР oriC

Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli

3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

Этапы пути инициации репликации на ОНР у дрожжей

Инициация репликации у высших эукариотов

Белковые компоненты и путь инициации репликации

Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов

Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

ЛИТЕРАТУРА

 

 

ГЛАВА 1. ДНК-полимеразы

 

Биосинтез ДНК. Общие определения

ДНК, служащая первичным носителем генетической информации, является линейным или кольцевым гетерополимером, состоящим из 4 дезоксирибонуклеотидов… Под биосинтезом ДНК в широком смысле слова понимается ферментативное удлинение… Синтез ДНК катализируется ферментами, относящимися к общему классу нуклеотидилтрансфераз, которые вызывают перенос…

A. ДНК дНТФ

  5’   5’

H O

|

a HO-P=O

5’ |

Bs+1 О

|

O CH2

|

H OH 3’

 

 

B.

Рис. 1.1.

А. Элементарная стадия в процессе роста цепи ДНК, катализируемой ДНК-полимеразами и обратными транскриптазами (Bn-1, Bn и Bn+1 – основания n-1, n и n+1, считая с 5’-конца растущей линейной нити ДНК).

В. Промежуточное (переходное) состояние в механизме ДНК-полимеразной реакции, катализируемой двумя катионами Mg2+ (нумерация остатков аспарагиновой кислоты D для ДНК-полимеразы I Escherichia coli)

 


связывания двух катионов 2-валентныхТаблица 1.1

Классификация ДНК-полимераз

Семейство ДНК-полимеразы Консервативные области* Функции
А С
А ДНК-полимеразы I бактерий, ДНК-полимераза фага Т7 DhhxEh hHhhxЕ Репарация, репликация
В ДНК-полимераза II E. coli, ДНК-полимеразы фагов Т4 и RB69, ДНК-полимеразы a, d, e и z эукариотов, ДНК-полимераы В археев DххSLIPS YGDTDS Репликация, репарация
С ДНК-полимеразы III бактерий     Репликация, репарация
D ДНК-полимеразы D эуриархеев     Репликация, репарация
X ДНК-полимеразы b, k, m и s эукариотов DSSC-GhQHhhGHDVDFLLT hHDhLhTRRVDLV Репарация
Y ДНК-полимеразы IV и V E. coli, ДНК-полимеразы i и REV1 эукариотов     Синтез через повреждения ДНК

*- выделены кислые аминокислотные остатки активного центра; h – гидрофобные аминокислотные остатки

 

 

– только у эукариотов(табл. 1.1). Несмотря на низкую степень гомологии между ДНК-полимеразами из разных семейств, все они содержат во многих случаях одни и те же группы консервативных аминокислотных остатков (области А и С), в которые входят два или чаще три кислых остатка аспарагиновой и глутаминовой кислот, необходимые для связывания двух катионов 2-валентных металлов, которые металлов, которые участвуют в каталитическом механизме, представленном на рис. 1.1А. Сайт-направленный

мутагенез подтвердил, что эти консервативные кислые остатки абсолютно необходимы для полимеразной активности. Такие же сочетания существенных кислых аминокислотных остатков содержатся и в активных центрах обратных транскриптаз и РНК-полимераз. Таким образом, механизм катализа с участием 2 катионов Mg2+, координируемых остатками асп и глу, является универсальным для ферментов биосинтеза полинуклеотидов ДНК и РНК.

Кроме полимеразной активности, многие ДНК-полимеразы обладают экзонуклеазными активностями. Большинство ДНК-полимераз имеет (3’®5’)-экзонуклеазную активность, которая удаляет из вновь синтезированной нити последний включенный остаток на 3’-конце, укорачивая растущую цепь на один нуклеотид и освобождая 5’-дНМФ. Эта реакция очень специфична и требует присутствия 3’-ОН-группы в дезоксирибозе последнего нуклеотида цепи ДНК. Она идет наиболее эффективно, если последний включенный нуклеотид является «ошибочным» и не комплементарен соответствующему основанию матрицы. Такая реакция используется для исправления (коррекции) ошибок, допущенных ДНК-полимеразой в процессе синтеза ДНК (гл. 00).

Механизм (3’®5’)-экзонуклеазной активности формально аналогичен механизму самой полимеразной реакции и состоит в нуклеофильной атаке гидроксильного иона ОН- на (3’,5’)-фосфодиэфирную связь при участии двух катионов 2-валентных металлов (Mg2+, Mn2+ или Zn2+). Эти катионы связываются с консервативными кислыми остатками асп (или глу) в экзонуклеазном активном центре (рис. 1.2). Молекула воды, координационно связанная с катионом металла А, образует атакующий анион ОН-, который занимает правильное положение относительно мишенной фосфодиэфирной связи в переходном комплексе. В этом комплексе атом Р расщепляемой связи находится в центре треугольной бипирамиды, апикальные положения которой занимают атакующий гидроксильный анион и 3’-ОН-группа предпоследнего нуклеотида растущей нити ДНК. Катион металла В стабилизирует уходящую 3’-OH-группу этого остатка и помогает установлению правильных углов связей О-Р-О в симметричном переходном комплексе.

Рис. 1.2. Переходное состояние в (3’®5’)-экзонуклеазной реакции, катализируемой ДНК-полимеразой I E. coli.

Главными лигандами двух катионов Mg2+ являются остатки D424 и D501. Роль карбоксильной группы Е357 как лиганда катиона металла является менее существенной, но этот остаток необходим для экзонуклеазной активности. Расположенный рядом с активным центром остаток Y497 может участвовать в установлении правильного положения субстрата

 

Гораздо реже встречается (5’®3’)-экзонуклеазная активность, которая характерна, например, для бактериальных ДНК-полимераз I. Они обладают уникальной способностью начинать синтез ДНК in vitro на однонитевом разрыве (ОР, или «ник» на лабораторном жаргоне) в днДНК, имеющем смежные свободные 3’-гидроксильный и 5’-фосфатный концы, и используют 3’-ОН-конец в месте разрыва для удлинения нити ДНК. По мере синтеза нового сегмента ДНК он вытесняет гомологичный 5’-сегмент нити из дуплекса («синтез ДНК со смещением нити», displacement synthesis). Смещенный сегмент ДНК последовательно разрушается под действием (5’®3’)-экзонуклеазной активности полимеразы (рис. 1.4). В процессе деградации освобождаются преимущественно (в 80% случаев) 5’-мононуклеотиды – продукты гидролиза ближайшей к 5’-концу фосфодиэфирной связи. Однако могут освобождаться и олигонуклеотиды, т.к. фермент способен расщеплять фосфодиэфирные связи на расстоянии до 10 н. от 5’-фосфатного конца в области ОР. Строго говоря, (5’®3’)-экзонуклеазу ДНК-полимераз следует называть 5’-нуклеазой. Эта активность может гидролизовать не только нить ДНК, но и РНК, спаренную с комплементарной нитью ДНК, т.е. действовать как РНКаза Н. 5’-нуклеазная активность ДНК-полимераз используется в процессах репарации и для удаления праймеров РНК из отстающей нити (гл. 3). При согласованном синтезе-расщеплении ДНК-полимеразами I in vitro происходит простое перемещение ОР по нити ДНК в направлении 5’®3’ (рис. 1.3). Этот феномен называется «переносом ОР» (nick translation). Он часто используется для введения радиоактивной метки в днДНК in vitro.

В бактериальных и фаговых 5’-экзонуклеазах обнаружены 9 консервативных кислых аминокислотных остатков асп или глу. Сайт-направленный мутагенез показал, что многие из них существенны для нуклеазной активности. Это позволило предположить, что 5’-нуклеазная реакция, подобно полимеразной и (3’®5’)-экзонуклеазной реакциям, катализируется двумя катионами 2-валентных металлов, координационно связанными с карбоксильными группами остатков асп и глу. Однако рентгеноструктуктурный анализ нескольких родственных 5’-нуклеаз не позволил однозначно установить положения связанных с активным центром катионов металлов и геометрию их лигандов.

Рис. 1.3. Схема процесса переноса ОР, катализируемого ДНК-полимеразой I.

I – полимеразный домен ДНК-полимеразы, II – 5’-нуклеазный домен

 

Процессы синтеза ДНК, катализируемые ДНК-полимеразами, разделяются на репаративные и репликативные. Репаративный синтез ДНК используется для заполнения однонитевых брешей в днДНК, образующихся во время эксцизионной репарации, коррекции ошибочно спаренных оснований или рекомбинационной репарации. Рассмотрим этот процесс на примере нуклеотидной эксцизионной репарации (рис. 1.3). Репаративные эндонуклеазы (эксцинуклеазы) узнают поврежениеповреждение (например, циклобутановый пиримидиновый димер) в нити ДНК и разрезают ее на определенных расстояниях с 3’- и 5’-стороны от повреждения с образованием ОР. Фрагмент ДНК, расположенный между этими ОР и содержащий повреждение, должен быть освобожден из дуплекса, чтобы создать однонитевую матрицу ДНК для репаративного синтеза. Для этого используется расплетание нитей днДНК, катализируемое специализированными ферментами – ДНК-геликазами (см. гл. 2), например, ДНК-геликазой UvrD E. coli. В ДНК возникает однонитевая брешь длиной 13 н. в случае бактерий и 29 н. в случае эукариотов. Она служит посадочной площадкой для связывания с онДНК ДНК-полимераз, включая те, которые не могут инициировать синтез ДНК на ОР. ДНК-полимеразы используют 3’-ОН-конец нити ДНК в бреши в качестве сайта инициации (затравки) для репаративного ресинтеза и удлиняют этот конец, последовательно копируя матрицу неповрежденной нити и заполняя пробел. Синтез часто останавливается перед противоположным 5’-концом ДНК в бреши, и в ДНК остается ОР со смежными 3’-гидроксильным и 5’-фосфатным концами. Воссоединение этих концов ДНК-лигазами (гл. 2) восстанавливает целостность репарируемой нити.

Рис. 1.4. Репаративный синтез ДНК в процессе нуклеотидной эксцизионной репарации.

1 – инцизия поврежденного участка нити ДНК эксцизионными эндонуклеазами, 2 – расплетание сегмента нити ДНК между ОР ДНК-геликазой и освобождение этого сегмента из дуплекса, 3 – репаративный ресинтез однонитевой бреши ДНК.

I – эксцизионная эндонуклеаза, II – ДНК-геликаза, III – ДНК-полимераза

 

Репликация ДНК состоит, как правило, в образовании двух дочерних копий днДНК всех компонентов генома (хромосом и эписом или плазмид). При репликации синтезируются две новые нити, комплементарные нитям родительского дуплекса ДНК. В результате каждый родительский дуплекс замещается двумя дочерними, состоящими из одной родительской и одной вновь синтезированной нитей. Репликация является полуконсервативной, т.к. консервативными единицами являются одиночные нити родительской днДНК. Главные ДНК-полимеразы, на долю которых приходится большая часть репликативного синтеза ДНК, иногда называют ДНК-репликазами. Остальные ДНК-полимеразы играют вспомогательную роль в репликации ДНК и/или участвуют в репаративном синтезе. Их иногда называют репаративными ДНК-полимеразами, но этот термин не является строгим.

Процесс репликации состоит из трех последовательных стадий: инициации (начала синтеза ДНК) , элонгации (ростьа цепи ДНК) и терминации (окочанияокончания синтеза). Репликация обычно начинается в одном или многих специфических сайтах генома, которые называются областями начала репликации (ОНР, или ori от origin). Область, в которой репликация ДНК останавливается, называется область окочанияокончания репликации (terminus). Эти контрольные элементы определяют единицу репликации ДНК, называемую репликоном. Первой существенной стадией в инициации репликации является локальное раскрывание (расплетание) двойной спирали ДНК, дающее ДНК-полимеразам доступ к одиночным матричным нитям ДНК. Сами ДНК-полимеразы неспособны вызывать раскрывание дуплекса во внутренних участках, хотя при репаративном синтезе со смещением нити могут проявлять ограниченную способность расплетать расположенную перед ними днДНК на ОР или однонитевых брешах. Существование специализированных ОНР повышает эффективность репликации ДНК, создавая места для сборки состоящих из многих белков комплексов репликативного синтеза ДНК, или реплисом. В сборке этих комплексов важную роль играют специфические ДНК-белковые и белок-белковые взаимодействия. Первичное открывание дуплекса ДНК обычно вызывается специфическим белком-инициатором, обладающим способностью узнавать нуклеотидную последовательность ОНР. Оно облегчается особенностями структуры ДНК ОНР (например, негативной суперспирализацией ДНК или присутствием в ОНР «легкоплавких» участков ДНК) и некоторыми вспомогательными белками (например, связывающими онДНК белками типа SSB).

Первичное раскрывание дуплекса создает предпосылки для образования репликативной вилки (точки ДНК, в которой комплементарные нити расходятся и дают ДНК-полимеразам возможность синтезировать ДНК). В установлении репликативной вилки важную роль играет погрузка на разошедшиеся нити ДНК-геликаз – ферментов, использующих энергию гидролиза НТФ для однонаправленной транслокации по нити ДНК и плавления дуплекса. На некоторых ОНР погрузка ДНК-геликазы осуществляется на обе разошедшиеся нити. Это приводит к образованию двух репликативных вилок, перемещающихся по дуплексу ДНК в разных направлениях, так что репликация ДНК является двунаправленной. На других ОНР устанавливается только одна репликативная вилка, и начинается однонаправленная репликация.

В отличие от РНК-полимераз, ДНК-полимеразы и обратные транскриптазы не могут инициировать синтез ДНК de novo, т.е. синтезировать первый динуклеотид из двух дНТФ. Они нуждаются для инициации в затравке, или” праймере” (primer). Во время репаративного синтеза ДНК-полимеразы элонгируют уже установившуюся нить ДНК, свободный 3’-OH-конец которой и служит затравкой. Роль праймера в репликации ДНК обычно играют короткие цепи РНК. Лишь некоторые фаговые и вирусные ДНК-полимеразы (например, у фага f29 Bacillus subtilis или аденовирусов) могут использовать для инициации репликации белковые праймеры, в которых боковые гидроксильные группы остатков тирозина, серина или треонина играют такую же роль акцептора дНТФ, как 3’-OH-группа на конце полинуклеотидной цепи. Ретровирусы могут использовать в качестве затравки для инициации обратной транскрипции готовые природные тРНК клеток хозяина. В остальных случаях затравки РНК необходимо синтезировать de novo. Наиболее часто синтез праймеров катализируется специальным классом ДНК-зависимых РНК-полимераз, так называемыми праймазами. Однако у бактерий иногда (например, при инициации репликации некоторых плазмид) затравка РНК может синтезироваться обычной РНК-полимеразой. У эукариотов в синтезе митохондриальной ДНК также участвует не стандартная праймаза, а митохондриальная РНК-полимераза. Праймазы вовлекаются в инициацию новых цепей ДНК геликазами, расположенными в репликативных вилок. Образовавшийся комплекс, содержащий геликазу и праймазу, называется праймосомой.

В зависимости от частоты и распределения событий синтеза праймеров процессы репликации ДНК разделяются на непрерывные и полунепрерывные. При непрерывной репликации комплементарные нити дочерней ДНК синтезируются по-очереди (рис. 1.5, А). Вначале образуется праймер для копирования нижней нити родительского дуплекса. ДНК-полимераза элонгирует этот праймер, ведя синтез со смещением верхней родительской нити до конца матрицы нижней нити. Затем происходит независимая репликация смещенной матрицы верхней нити, инициированная второй затравкой. Так реплицируются по механизму вращающегося кольца ДНК некоторых фагов и бактериальных плазмид и эукариотическая митохондриальная ДНК, а также молекулы линейной ДНК аденовирусов.

Рис. 1.4. Репаративный синтез ДНК в процессе нуклеотидной эксцизионной репарации.

1 – инцизия поврежденного участка нити ДНК эксцизионными эндонуклеазами, 2 – расплетание сегмента нити ДНК между ОР ДНК-лигазой и освобождение этого сегмента из дуплекса, 3 – репаративный ресинтез однонитевой бреши ДНК.

I – эксцизионная эндонуклеаза, II – ДНК-геликаза, III – ДНК-полимераза

Рис. 1.5. Непрерывная (А) и полунепрерывная (В) репликация ДНК.

Родительские нити ДНК изображены сплошными черными линиями, вновь синтезированные нити – прерывистыми красными линиями, а праймеры РНК – зелеными кружками. Тонкие красные стрелки указывают направление роста вновь синтезируемых нитей ДНК, а толстая красная стрелка – направление движения репликативной вилки. На рис. В красными цифрами обозначены ведущая нить (1) и отстающая нить (2)

 

При полунепрерывной репликации одна из дочерних нитей элонгируется непрерывно из одного праймера, использованного при инициации (рис. 1.6, В). Эта нить ДНК называется ведущей. Полимеризация непрерывной нити идет в том же направлении, в котором перемещается по дуплексу родительской ДНК репликативная вилка. Нить дочерней ДНК, комплементарная ведущей, называется отстающей. Синтез отстающей нити происходит одновременно с синтезом ведущей нити, но в направлении, противоположном движению репликативной нити. Такой синтез не может быть непрерывным, т.к. ДНК-полимеразы перемещаются по матричной нити ДНК только в одном направлении 3’®5’. Отстающая нить создается из дискретных коротких цепей ДНК, синтезируемых на матрице для этой нити в результате перемещения ДНК-полимеразы в стандартном направлении. Эти короткие цепи называются фрагментами Оказаки. Каждый из таких фрагментов должен инициироваться заново из праймеров РНК, синтезируемых праймазой. При полунепрерывной репликации для завершения синтеза отстающей нити требуется участие «репаративной» системы, которая удаляет праймеры РНК, заполняет образующиеся бреши и соединяет друг с другом короткие отрезки вновь синтезированной ДНК. В процессе полунепрерыной репликации участвуют сложные многокомпонентные машины репликации, называемые реплисомами. Сборку и работу этих машин у прокариотов и эукаритов мы рассмотрим с гл. 2-3. Однако вначале необходимо остановиться на свойствах основных типов ДНК, полимераз, участвующих в репликации и репарации.

 

 


Бактериальные ДНК-полимеразы

Характеристики главных типов бактериальных ДНК-полимераз наиболее детально изучены на примере E. coli (табл. 1.2). Всего у кишечной палочки существуют 5 разных ДНК-полимераз. Мы рассмотрим вначале только три из них, отложив характеристику двух «склонных к ошибкам» ДНК-полимераз до гл. 00.

 

Таблица 1.2

ДНК-полимеразы E. coli

ДНК-полимеразы Ген Положение на карте, мин Продукт Число остатков Мол. масса кД Функция
ДНК-полимераза I (A) polA 87,2 PolI Репарация, репликация
ДНК-полимераза II (B) polB 1,4 PolII Репарация, мутагенез
  Главная репликативная ДНК-полимераза III (C)   dnaE 4,4 a, PolIII Каталитическая субъединица
dnaN 83,6 b, PolIII Скользящий зажим
dnaQ 5,1 e, PolIII (3’®5’)-экзонуклеазная субъединица
dnaX 10,6 t, PolIII g, PolIII Структурная субъединица
Комплекс g-комплекса погрузчика зажима
holA 14,4 d, PolIII
holB 24,9 d’, PolIII
holC 96,6 c, PolIII
holD 99,3 y, PolIII
holE 41,5 q, PolIII Компонент минимального фермента

 

 

1.2.1. ДНК-полимераза I E.coli

 

Из всех ДНК-полимераз E. coli наиболее высокий внутриклеточный уровень (~ 400 молекул на клетку) имеет ДНК-полимераза I, кодируемая существенным геном polA. Она состоит из одной субъединицы длиной 928 остатков, которую можно разделить на три домена (рис. 1.6). N-концевую треть молекулы занимает (5’®3’)-экзонуклеазный домен, в центре расположен самый короткий (3’®5’)-экзонуклеазный домен, а самый большой полимеразный домен находится на С-конце. При ограниченном протеолизе ДНК-полимеразы I расщепление на границе между первыми доменами дает малый N-концевой 5’-нуклеазный фрагмент и большой С-концевой фрагмент, который называется кленовским фрагментом. Последний сохраняет 3’-нуклеазную и полимеразную активность и часто используется для синтеза ДНК in vitro.

(3’®5’)-экзонуклеазный домен, ответственный за корректорскую активность ДНК-полимеразы I, не является обязательным и отсутствует у бактерий из родов Thermus и Rickettsia. Остальные два домена жизненно важны для клеток и обеспечивают участие ДНК-полимеразы I в процессах репарации и удаления рибонуклеотидной части фрагментов Оказаки в отстающей нити. Поэтому делеция гена polA летальна для E. coli, а нелетальные мутации понижают в 10 раз скорость соединения фрагментов Оказаки и повыщаютповещают чувствительность клеток к агентам, повреждающим ДНК.

 

Рис. 1.6. Доменная с

труктура ДНК-полимеразы I E.coli.

A – взаимное расположение доменов. I – 5’-нуклеазный домен, II – (3’®5’)-экзонуклеазный домен, III – ДНК-полимеразный домен. Стрелка соответствует кленовскому фрагменту ДНК-полимеразы I.

B – мотивы полимеразного домена, консервативные среди бактериальных ДНК-полимераз I.

Эти мотивы имеют следующие консенсусные последовательности: 699hhhhDhhxEhx712 (A), 754RpxxKxxxhGhhY766(B) и 876hhxhHDЕhxxЕ888 (С) - , где h – гидрофобный остаток, х – произвольный остаток, р – преимущественно R (нумерация остатков ДНК-полимеразы I E. coli)

 

Полимеразные домены различных ДНК-полимераз I и ДНК-полимеразы фага Т7 очень похожи друг на друга и содержат 6 консервативных участков, среди которых три аналогичны консервативным мотивам А, В и С главного семейства В эукариотических ДНК-полимераз и играют наиболее важную роль во время синтеза ДНК. Мотивы А и С ДНК-полимеразы I E. coli содержат кислые остатки асп705 и асп882 соответственно, связывающие катионы Mg+ в каталитическом активном центре (см. рис. 1.1В), а мотив В включает инвариантный положительно заряженный остаток (арг758) и ароматический остаток (тир766). Эти три мотива являются элементами полости, с которой связывается включающийся дНТФ в активном полимеразном центре.

-

Рис. 1.7. Модель трехмерной структуры полимеразного домена ДНК-полимеразы I E.coli.

Указаны положения, в которых начинаются консервативные мотивы А, В и С

 

 

Рентгеноструктурный анализ кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli впервые обнаружил специфическую архитектуру полимеразного домена, который по форме напоминает кисть правой руки (рис. 1.7) и состоит из пространственных доменов «ладони» (palm), «большого пальца» (thumb) и «пальцев» (fingers). Аналогичную трехмерную организацию имеют и все изученные экспериментально полимеразные домены других ДНК-полимераз и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека. Можно предположить, что так же организованы и полимеразные домены большинства ДНК-полимераз. Наиболее консервативна топология домена ладони, состоящего из b-слоя, фланкированного двумя a-спиралями. В домене ладони расположены консервативные мотивы А и С. Домены большого пальца и пальцев у ДНК-полимеразы I E. coli образованы a-спиралями, причем спираль О домена пальцев совпадает с мотивом В. У других ДНК-полимераз организация этих доменов гораздо менее консервативна. Хотя домен больших пальцев остается преимущественно a-спиральным, но тонкие детали его топологии неодинаковы. Еще более велики различия доменов пальцев. В целом, для архитектуры полимеразного домена характерно существование внутренней полости для связывания матрицы-затравки ДНК и входящего дНТФ, основанием которой является домен ладони.

На примере бактериальной ДНК-полимеразы I мы рассмотрим последовательные изменения конформации этой полости во время полимеразного каталитического цикла. Эти рентгеноструктурные данные были получены для нескольких свободных бактериальных полимераз и их комплексов с ДНК в присутствии и в отсутствие дНТФ. Вероятно, такие же изменения происходят во время работы других ДНК-полимераз. «Рабочий цикл» состоит из 4 последовательных стадий: 1) связывания ДНК-полимеразы с матрицей-затравкой ДНК; 2) связывания с комплексом полимераза-ДНК подходящего дНТФ, комплементарного первому остатку матрицы; 3) нуклеофильной атаки, приводящей к образованию фосфодиэфирной связи; 4) освобождения пирофосфата. Первые две стадии протекают очень быстро, и общую скорость полимеризации лимитирует стадия 3 или предшествующее ей изменение конформации.

Первая стадия сопровождается конформационными изменениями домена большого пальца, который поворачивается в сторону домена ладони. Одновременно изменяется положение спиралей Н1 и Н2 на конце большого пальца, которые сближаются с днДНК. В результате из домена большого пальца и прилежащей части домена ладони образуется цилиндрический канал диаметром 30 Å, охватывающий дуплекс ДНК. В нем аминокислотные остатки ДНК-полимеразы контактируют с ДНК по малой канавке. Взаимодействия с ДНК полимеразой вызывают изменения конформации как в днДНК (изгиб на расстоянии 3 п.н. от праймерного конца), так и однонитевой затравке, первый нуклеотид которой поворачивается на угол >90о, а следующие основания – на 180о. Этот переход матричной нити в S-образную конфигурацию смещает первый матричный нуклеотид с оси дуплекса ДНК, на которой вместо него оказывается остаток тир766 спирали О домена пальцев.

Второе изменение конформации происходит после связывания дНТФ и в основном затрагивает домен пальцев и смежную область домена ладони. Домен пальцев поворачивается в сторону 3’-конца затравки, а его О-спираль с мотивом В вращается на 40о в сторону двух остатков асп каталитического центра. В результате сайт связывания дНТФ переходит из «открытой» формы в «закрытую». Первый остаток матрицы возвращается на ось днДНК, вытесняя с нее остаток Y766, сохраняющий стэкинг-взаимодействие с этим матричным нуклеотидом. В «закрытой» форме входящий дНТФ образует уотсон-криковскую пару с первым матричным основанием. В стабилизации этой пары участвуют также взаимодействие ароматических колец остатков фен и тир с мотиве В с азотистым основанием дНТФ и гидрофобные взаимодействия боковых цепей остатков или и глу с дезоксирибозой. Положительно заряженный остаток арг758 мотива В взаимодействует с отрицательно заряженным трифосфатом дНТФ, а остатки асп705 и асп882 активного центра в домене ладони при участии двух катионов Mg2+ устанавливают правильную геометрию трифосфата дНТФ, необходимую для нуклеофильной атаки 3’-концом затравки (см. рис. 1.1В). Таким образом, замкнутая структура белка, удерживающая в правильной конфигурации пару дНТФ-матричное основание, создается конформационными изменениями ДНК полимеразы в соответствии с моделью ииндуцированногоиндуцированного соответствия.

После включения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК полимераза возвращается в «открытую» форму, транслоцируется к следующему положению матрицы и освобождает пирофосфат. В освобождении пирофосфата важную роль играет взаимодействие остатков арг и лиз в О-спирали с a- и b-фосфатными группами. Изменение положения этих основных остатков во время перехода в открытую форму способствует удалению пирофосфата из каталитического центра и предотвращает обратную реакцию пирофосфоролиза ДНК.

 

ДНК-полимераза II E.coli

ДНК-полимераза II (PolII), кодируемая геном polB (dinA), является единственной из ДНК-полимераз E. coli, относящимся к полимерзному семейству В, в… Хотя ДНК-полимераза II открыта в 1970-е годы и давно охарактеризована…  

ДНК-полимераза III E. coli

Главной репликативной ДНК-полимеразой E. coli является многосубъединичный комплекс ДНК-полимеразы III (PolIII). Самая большая каталитическая… Большую часть молекулы белка DnaE (рис. 1-8) занимает полимеразный домен,… N-концевая область DnaE (остатки 1-210) состоит из N- и С-доменов (остатки 1-70 и 80-210 соответственно), гомологичных…

Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев

Основные характеристики пяти наиболее хорошо изученных эукариотических ДНК-полимераз приведены в табл. 1.3. Четыре из этих ДНК-полимераз являются ядерными ферментами и участвуют в репликации и/или репарации хромосомной ДНК, а пятая расположена в митохондриях и отвечает за репликацию митохондриальной ДНК. Особенности остальных эукариотических ДНК-полимераз, участвующих преимущественно в синтезе напротив повреждений ДНК, будут рассмотрены в гл. 00.

 

ДНК-полимераза a

Главная ДНК-полимеразная субъединица (субъединица А) этого комплекса имеет мол. массу 165 кД (р165) у дрожжей S. cerevisiae и 180 кД (р180) у…

Таблица 1.3

Главные эукариотические ДНК-полимеразы

  Более того, даже синтезированные при ее участии фрагменты Оказаки желательно… На N-конце ДНК-полимеразы a расположен домен (остатки 1-330), не существенный для полимеразной активности и сборки…

ДНК-полимераза b

ДНК-полимераза b (Polb) млекопитающих является самой маленькой из известных эукариотических ДНК-полимераз и относится к семейству Х, к которому… С-концевой домен (31 кД) обладает полимеразной активностью, которая способна…

ДНК-полимераза g

У многоклеточных эукариотов, но не у дрожжей, Polg является гетеродимером и, кроме субъединицы р140, содержит малую вспомогательную субъединицу с… мтДНК постоянно находится в окислительном окружении внутри митохондрий и…  

ДНК-полимеразы d и e

  B A. Рис. 1.14. Схема доменной организации больших субъединиц эукариотических ДНК-полимераз d (А) и e (В).

ДНК-полимеразы археев

По ультраструктуре клеток представители третьего домена живых организмов археи (Archaea) похожи на бактерии и относятся к прокариотам. Их… Оба субдомена археев имеют мономерные ДНК-полимеразы семейства В с мол. массой… ДНК-полимераза PolD состоит из большой каталитической субъединицы DP2 с мол. массой ~ 130-140 кД, обладающей…

Скользящие зажимы ДНК-полимераз и их погрузчики

1.4.1. Скользящие зажимы – факторы процессивности ДНК-полимераз   Особый класс субъединиц холоферментов ДНК-полимераз образуют белки-зажимы (clamps), которые связываются с другими…

Погрузчики скользящего зажима

Кольца олигомерных форм белков DnaN и PCNA являются очень стабильными. Так, константа диссоциации димера DnaB не превышает 50 нМ, а период…   Белки ААА+

Литература

1. Льюин Б. «Гены», М., Мир, 1987, с. 396-431.

2. Brush G.S., Kelly T.J. Mechanisms for replicating DNA // In “DNA Replication in Eukariotic Cells”, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1996, pp. 1-43.

3. Alberts B. DNA replication and recombination // Nature, v. 421, 431-435, 2003.

4. Bollum F.J. Therminal deoxynucleotidyl transferase // In “The Enzymes”, v. 10, p.145-171, 1974.

5. Marians K. Prokaryotic DNA replication // Ann. Rev. Biochem., v. 61, 673-719, 1992.

6. Joyce C.M. Polymerase structures and function: variation on a theme? // J. Bacteriol., v. 177, 6321-6329, 1995.

7. Steitz T.A. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms // J. Biol. Chem., v. 274, 173985-17398, 1999.

8. Brautigam C.A., Steitz T.A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes // Curr. Opin. Structural Biol., v. 8., 54-63, 1998.

9. Jäger J., Pata J.C. Setting a grip: polymerases and their substrate complexes // Curr. Opin. Structural Biol., v. 9., 21-28, 1999

10. Patel P.H., Suzuki M., Adman E., Shinkai A, Loeb L.A. Prokaryotic DNA polymerase I: evolution, structure, and “base flipping” mechanism for nucleotide selection // J. Mol. Biol., v. 308, 823-837, 2001 .

11. Михайлов В.С. ДНК-полимеразы эукариот // Мол. биол., т. 33, 567-580, 1999.

12. Stuckl M., Stagljar I., Jonsson Z.O., Hűbscher U. A coordinated interplay: proteins with multiple functions in DNA replication, DNA repair, cell cycle / checkpoint control, and transcription // Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., v. 65, 261-299, 2001.

13. Hűbscher U., Maga G., Spadari S. Eukaryotic DNA polymerases // Ann. Re. Biochem., v. 71, 000-000, 2002.

14. Budd M.E., Campbell J.I. Interrelationships between DNA repair and DNA replication // Mutat. Res., v. 451, 241-255, 2000

15. Foiani M., Lucchini G., Plevani P. The DNA polymerase a - primase complex couples DNA replication, cell cycle progression and DNA damage response // Trends Biochem. Sci., v. 22, 424-427, 1997

16. Burgers P.M.J. Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and repair // Chromosoma, v. 107, 218-227, 1998.

17. Burgers P.M.J., Koonin E.V. et al. Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature // J. Biol. Chem., v. 276, 43487-43490, 2001.

18. Aravind L., Koonin E.V. Phosphoesterase domains associated with DNA polymerases of .different origins // Nucl. Acids Res., v. 26, 3746-3752, 1998.

19. Cahn I.K.O., Ishino Y. Archaeal DNA replication: identifyng the pieces to solve a puzzle // Genetics, v. 152, 1249-1267, 1999.

20. Hingorani M.M., O’Donnell M. Sliding clamps: a (tail)ored fit // Curr. Biol., v. 10, R25-R29, 2000.

21. Tsurimoto T. PCNA, a multifunctional ring on DNA // Biochem. Biophys. Acta, v. 1443, 23-39, 1998.

22. Lopes de Saro F.J., O’Donnell M. Interaction of the b sliding clamp with MutS, ligase and DNA polymerase I // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 98, 8376-83802, 2001.

23. Dalrymple B.P., Kongsuwan K., Wijffels G., Dixon N.E., Jennins P.A. A universal protein-protein interaction motif in the eubacterial DNA replication and repair systems // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 98, 11627-11632, 2001.

24. Mossi R., Hűbscher U. Clamping down on clamps and clamp loader. The eukaryotic replication factor C // Eur. J. Biochem., v. 254, 209-216, 1998.

25. Trakselis M.A., Benkovic S.J. Intricacies in ATP-dependent clamp loading: variation across replication systems // Structure, v. 9, 999-1004, 2001.

26. Ellison V., Stillman B. Opening of the clamp: an intimate view of an ATP-driven biological machine // Cell, v. 106, 655-660, 2001.

27. Neuwald A.F., Aravind L., Spouge J.L., Koonin E.V. AAA+: a class of chaperone-like ATPases associated with assembly, operation, and disassembly of protein complexes // Genome Res., v. 9, 27-43, 1999.

28. Vale R.D. AAA proteins: lords of the ring // J. Cell Biol., v. 150, F13-F19, 2000.

 

 

 

Глава 2. Вспомогательные белки репликации ДНК

ДНК-геликазы

 

Общая характеристика геликаз

ДНК-геликазы являются моторными белками, сопрягающими гидролиз НТФ с дестабилизацией водородных связей в дуплексах ДНК. ДНК-геликазы могут… Почти все ДНК-геликазы предпочитают инициировать расплетание in vitro…  

Рис. 2.1. Схема субстрата ДНК для определения полярности ДНК-геликаз

 

Все ДНК-геликазы образуют олигомерные активные структуры, преимущественно димеры или гексамеры из одинаковых или (гораздо реже) разных субъединиц. Даже такая ДНК-геликаза, как белок Rep E. coli, в свободном состоянии находящийся в мономерной форме, при связывании с ДНК образует димеры и активна в димерной форме. Главные ДНК-геликазы, участвующие в репликации ДНК, являются гексамерными ферментами.

Компьютерный анализ ДНК-геликаз из различных организмов обнаружил короткие консервативные аминокислотные последовательности, названные “геликазными мотивами”, и позволил разбить эти ферменты на три суперсмейства (SF-1, SF-2 и SF-3) и одно небольшое семейство (F-4). Число таких консервативных мотивов составляет от 3 у суперсемейства 3, в которое в основном входят вируксные геликазы, до 7 у суперсемейств 1 и 2. Два из этих мотивов необходимы для связывания и гидролиза НТФ. Они встретились и ранее у связывающих АТФ белков (в частности, у АТФаз) и были названы мотивами Уокера (J. Walker) типов А и В.

Мотив А с консенсусной последовательностью GK(T/S) образует так называемую Р-петлю в сайте связывания АТФ. Особенно важен остаток лизина (K), боковая аминогруппа которого контактивует с b-фосфатом связанного комплекса Mg2+-АТФ и стабилизирует переходное состояние во время катализа. Мотив В содержит инвариантный остаток аспарагиновой кислоты (D), рядом с которым у некоторых суперсемейств расположен второй кислый остаток глутаминовой кислоты (E) в мотиве DExH. Остаток асп координационно связывает ассоциированный с АТФ катион Mg2+ и активирует атакующую фосфодиэфирную связь молекулу воды. Эти два мотива АТФазного центра абсолютно необходимы, но не достаточны для геликазной активности. Роль остальных геликазных мотивов не определена однозначно. Некоторые из них могут связывать адениновое кольцо АТФ или g-фосфатную группу НТФ. Другие консервативные мотивы геликаз могут участвовать в ассоциакции ДНК-геликаз с сахарофосфатным остовом или основаниями ДНК или в передаче индукциованных НТФ или НДФ конформационных изменений к сайту связывания с ДНК в геликазе.

Поиски белков, имеющих консервативные геликазные мотивы, в базах данных полностью секвенированных геномов показал, что около 1% генов у всех организмов кодирует потенциальные геликазы. В частности, в геноме E. coli cодержится около 50 таких генов. Свойства и функции главных ДНК-геликаз E. coli приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1

Главные ДНК-геликазы E. coli

Фермент Ген Положение на генетической карте (мин) ММол.масса (кД) Поляр- ность Структура Функции Cемей- ство
Геликаза I traI F-плазмида 194,1 5’®3’ олигомер конъюгативный синтез ДНК SF-1
Геликаза II uvrD 82,1 3’®5’ димер репарация, рекомбинация SF-1
Геликаза III rep 72,8 3’®5’ димер (на ДНК) репликация фагов с онДНК SF-1
Геликаза IV helD 78,0 3’®5’ ? рекомбинация, репарация  
DnaB dnaВ 52,4 5’®3’ гексамер главная геликаза репликации ДНК F-4
PriA priA 81,7 3’®5’   репликация SF-2
RuvB ruvB 37,2 5’®3’ двойной гексамер рекомбинация (геликаза холиде- евских стыков) ААА+
RecQ recQ   68,4 3’®5’ гексамер(?) рекомбинация SF-2
RecG recG 76,4 3’®5’ и 5’®3’ ? рекомбинация, репликация  
RecBCD recB recC recD 129,0 66,0 днДНК с тупыми концами гетеро- тример   рекомбинация, репарация SF-1
UvrAB uvrA uvrB 103,8 76,1 5’®3’ гетеротри- мер А2В нуклеотидная эксцизионная репарация SF-2
Rho* rho 47,0 5’®3’ гексамер терминация транскрипции F1- АТФ-аза

· * - РНК-геликаза

 

Эти геликазы участвуют во всех основных процессах метаболизма ДНК и проявляют определенную специализацию. Так, геликаза, состоящая из субъединиц A и B эксцинуклеазы UvrABC специализируется на нуклеотидной эксцизионной репарации, а образующая двойные гексамеры геликаза RuvB катализирует одну из важнейших стадий рекомбинации – миграцию ветвей ДНК в так называемых холидеевских структурах. Среди этих ферментов наиболее важной для процессов инициации и элонгации в репликации ДНК является ДНК-геликаза DnaB.

 

Свойства репликативной ДНК-геликазы DnaB E. coli

ДНК-геликаза DnaB имеет длину 471 аминокислотный остаток (мол. масса 52,4 кД) и кодируется геном dnaB (92-ая мин генетической карты). Количество… Белок DnaB входит в геликазное семейство F-4, к которому относятся также… N-концевой домен I имеет преимущественно a-спиральную структуру и участвует в белок-белковых взаимодействиях. С этой…

1 22 138 174 345 471

N I II III IV C

                   
         


H1 H1a H2 H3 H4

DnaG DnaA

 

Рис. 2.2. Схема организации функциональных областей ДНК-геликазы DnaB E. coli.

I – маленький N-концевой домен 12 кД, II – гибкий линкер, III+IV – большой С-концевой домен 33 кД, III – домен АТФазной активности, IV – домен взаимодействия с ДНК.

Н1, Н1а, Н2, Н3 и Н4 – консервативные домены геликаз семейства F-4. Указаны главные области взаимодействия с белком DnaА и праймазой DnaG

 

Только N-концевой домен DnaB изучен с высоким разрешением методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР. 3-мерная структура всего белка пока установлена лишь методом криоэлектронной микроскопии с разрешением ~20 A. Эти данные показали, что в гексамере белка DnaB субъединицы образуют кольцо диаметром 12,5-14 нм и высотой 5,7 нм. Кольцо имеет центральное отверстие диаметром 3-4 нм, через которое может проийти нить онДНК. Аналогичные размеры имеют и кольца многих других гексамерных ДНК-геликаз. Существуют две взаимопревращающиеся формы кольца DnaB: “треугольник” с 3-кратной симметрией С3 и “пропеллер” с 6-кратной симметрией С6 (рис. 2.3). Взаимопревращение этих форм зависят от белок-белковых взаимодействий и, в частности, от способности N-концевых доменов I смежных субъединиц образовывать димеры. Домены I всех субъединиц расположены на одной и же поверхности основания кольца, а в самом кольце каждая из субъединиц взаимодействует только с 2 ближайшими соседями (рис. 2.4, А).

Структура комплексов белка DnaB с онДНК и вилочными субстратами ДНК изучена методом резонантного флуоресцентного переноса энергии. Эти данные показали, что онДНК действительно проходит через центральный канал гексамера DnaB, а не наматывается на её поверхности. Они позволили предложить модель связывания DnaB с ДНК в репликативной вилке (рис. 2.4, В). “Передняя” часть белка DnaB, обращенная в сторону расплетаемого дуплекса ДНК, образована большими С-концевыми областями всех 6 субъединиц, с которыми взаимодействует участок днДНК длиной не более 2-3 п.н. Две расплетенные нити ДНК на “переднем” краю разделяются друг от друга: 5’-нить попадает в центральный канал кольца DnaB, а 3’-нить “исключается” за пределы гексамера. Во внутреннем канале кольца DnaB

Рис. 2.3. Электронномикроскопические изображения двух гексамерных форм ДНК-геликазы DnaB E. coli: с 3-кратной (слева) и 6-кратной (справа) симметрией

 

Рис. 2.4. Модели гексамера геликазы DnaB E. coli.

А. Домены белка DnaB: 1- глобулярный N-концевой домен I, 2 – линкерный участок II, 3 – удлиненная С-концевая область доменов III и IV.

В. Предполагаемая структура комплекса белка DnaB с вилочным стыком в ДНК. Показано, как 3’-нить онДНК исключается из центрального канала гексамера, а 5’-нить связывается с одной из субъединиц в центральном канале.Стрелкой указано направление движения белка DnaB по ДНК

 

участок расположен участок 5’-нити длиной ~20 н., который, возможно, частично взаимодействует с канавкой в субъединице DnaB, находящейся в данный момент времени в активном состоянии со связанным АТФ (см. стр. 00). 5’-конец 5’-нити ДНК выходит из отверстия кольца через “заднюю” часть, образованную малыми N-концевыми доменами субъединиц DnaB, взаимодействующими с праймазой. Такая организация комплекса благоприятна для прямой передачи расплетенной 5’-нити в качестве матрицы для синтеза РНК-праймеров фрагментов Оказаки.

 

ДНК-геликаза репликативной вилки у эукариотов

Общее число различных ДНК-геликаз даже у низших эукариотов гораздо больше чем у бактерий. Так, в геноме дрожжей S. cerevisiae около 200 открытых… В настоящее время считается, что такой эукариотической репликативной… Дрожжевые белки MCM2-MCM7 высокогомологичны друг другу в центральной области длиной ~200 аминокислотных остатков (рис.…

Механизм действия гексамерных ДНК-геликаз

  Погрузка гексамерных ДНК-геликаз на ДНК Для многих кольцевых ДНК-геликаз доказано, что нить онДНК, по которой транслоцируется связанная геликаза, проходит…

1 10 70 245

N I II C

I – область взаимодействия с белком DnaB, II – мотивы связывания АТФ  

Рис. 2.11. Гипотетические модели активного расплетания днДНК гексамерными геликазами.

А. Модель клина.

В. Торсионная модель.

С. Модель деспирализации двойной спирали ДНК.


Белки, связывающие однонитевую ДНК

Однонитевые участки ДНК, появляющиеся в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК, могут быстро превращаться в нуклеопротеиновые комплексы,… Название SSB является недостаточно корректным и четким, т.к. существуют многие… Стабилизация онДНК является первым общим свойством всех белков SSB, которые защищают онДНК от деградации под действием…

А.

1 21 254 301

I II III

B.

1 115 165 177

I II III

C.

1 181 290 301 422 432 616

RPA1 DBD-A DBD-B DBD-C

Pola

p53

RPA2

1 43 171 270

RPA2 DBD-D

RPA1

RPA3

1 121

Рис. 2.12. Домены связывающих онДНК белков.

А. Белок gp32 фага Т4.

I – домен, ответственный за кооперативность связывания с онДНК, II – минимальный домен связывания с онДНК, III – домен взаимодействия с другими белками.

В. Белок SSB E. coli.

I – домен связывания с онДНК, олигомеризации и кооперативности, II – домен статистического клубка, участвующий во белок-белковых взаимодействиях, III – участок гомологии с кислой областью на С-конце gp32.

C. Эукариотический белок RPA.

Указаны положения сайтов связывания с онДНК (DBD) субъединицах RPA1 и RPA2 и контактных участков белок-белковых взаимодействий

 

Белок SSB E. coli кодируется существенным геном, расположенным на 92-ой мин генетической карты и имеющим SOS-индуцибельный промотор. Температурочувствительные мутации ssb летальны при непермиссивной температуре, при которой они останавливают репликацию ДНК. Кроме того, мутации повышают чувствительность клеток к повреждающим ДНК агентам и вызывают аномалии рекомбинации и дефект по индукции SOS-системы. Физиологически активной формой белка SSB является тетрамер, число копий которого на клетку равно 300-350. Этого количества достаточно, чтобы покрыть белком SSB участок длиной 1400 н. на репликативную вилку. Белок SSB имеет длину 177 остатков и мол. массу 18,9 кД и состоит из 3 доменов (рис. 2.12, В). Наиболее важной является N-концевая область (остатки 1-105), являющаяся доменом связывания с ДНК. Она содержит также аминокислотные остатки, существенные для взаимодействия мономер-мономер в тетрамере SSB и для кооперативности связывания SSB с онДНК. Домен II, состоящий из остатков 106-165, находится в конформации статистического клубка и не содержит заряженных остатков. После связывания SSB с онДНК этот домен становится более чувствительным к протеолизу. Это показало, что домен II доступен для взаимодействия с другими белками, и осуществляет функции белок-белковых взаимодействий. Последние 12 остатков на С-конце белка SSB очень похожи на кислую С-концевую область белка gp32. У обоих белков протеолитическое удаление С-концевых остатков изменяет кинетику связывания с ДНК и повышает способность дестабилизировать днДНК. Эта область SSB также важна для взаимодействия с другими белками, участвующими в метаболизме ДНК.

Эукариотический белок RPA является гетеротримерным и состоит из 3 разных субъединиц: RPA1, RPA2 и RPA3. Гены этих белков у человека расположены соответственно в хромосомах 17, 1 и 7, а сами субъединицы имеют длину 616, 270 и 121 аминокислотных остатков (мол. массы » 70, 29 и 14 кД). Эти белки гомологичны белкам Rfa1, Rfa2 и Rfa3 субъединиц гетеротримерного фактора RFA S. cerevisiae. У дрожжей гены всех 3 субъединиц связывающего онДНК белка абсолютно необходимы для жизнеспособности. Все субъединицы человеческого белка RPA требуются для репликации ДНК вируса SV40 in vitro.

Cубъединица RPA1 (рис. 2.12, С) может связываться с онРНК самостоятельно, но этого недостаточно для поддержания репликации ДНК. Эта субъединица является главной в гетеротримерном комплексе RPA. Её N-концевой домен (NTD) является наиболее важным участком во взаимодействиях с другими белками, хотя некоторые из этих белков имеют дополнительный сайт взаимодействия и на С-конце RPA1. RPA1 связывается с такими белками систем репликации ДНК, как большой Т-антиген вируса SV40, узнающий вирусную область инициации репликации, и с ДНК-полимеразой a - праймазой. Во взаимодействиях с этими белками участвуют N- и С-концевые области RPA1. Кроме того, RPA1 ассоциируется с активаторами транскрипции, имеющими кислые домены активации (например, с белком VP16 вируса простого герпеса и клеточным белком р53), а также с белком XP-G репарации ДНК. Домен взаимодействия с р53 расположен только в N-концевой области RPA1. Эти взаимодействия могут играть роль в привлечении RPA к сайтам репликации и репарации.

Субъединица RPA1 содержит также 3 из 4 доменов связывания RPA с онДНК: DBD-A (остатки 181-290), DBD-B (остатки 300-422) и DBD-C (остатки от 432 до ~560). Между этими доменами расположены гибкие линкерные области. При связывании с онДНК тандема доменов DBD-А и DBD-В каждый из них контактирует с 3 н., а промежуточные 2 н. онДНК приходятся на междоменную область. Четвертый слабый участок связывания с онДНК (домен DBD-D) расположен в центре субъединицы RPA2 и занимает более пРоловины этой молекулы (остатки 43-171). Самая маленькая субъединица RPA3 прямо не связывается с онДНК и её функции неизвестны. Предполагается, что С-концевая область RPA2 служит мостиком между RPA1 и RPA3. В тримеризации RPA участвуют три С-концевые a-спирали субъединиц RPA. Тримеризация RPA наиболее существенна для взаимодействия RPA с длинными субстратами онДНК (> 24 н.), а не с короткими олигонуклеотидами (10 н.).

Рассмотрим молекулярные аспекты взаимодействия связывающих онДНК белков с их “субстратами” онДНК. Все белки кооперативно ассоциируются с онДНК, но возможны два типа кооперативного связывания. При “неограниченной” кооперативности белок образует на онДНК длинные кластеры, в которых каждая молекула белка взаимодействует с ближайшими соседями по обе стороны от неё. В предельном случае при параметре кооперативности w®¥ белок полностью покрывает онДНК. Для “ограниченной” кооперативности характерно образование на ДНК “бусинок” - отдельных ограниченных групп кооперативно ассоциированных белковых молекул. Различные моды кооперативного связывания могут избирательно использоваться в процессах репликации, рекомбинации и репарации. Детальные механизмы образования контактов с онДНК неодинаковы для разных типов связывающих онДНК белков. Их можно рабить на два класса.

Белок SSB E. coli, являющийся в растворе стабильным тетрамером, связывается с онДНК в форме тетрамера с константой ассоциации 108-1010 М-1. Для белка SSB возможны три моды связывания с ДНК, в которых он покрывает участки онДНК длиной 35±2, 56±3 и 65±3 н. Эти моды названы соответственно (SSB)35, (SSB)56 и (SSB)65. Для моды (SSB)35 характерна неограниченная кооперативность. В моде (SSB)63 проявляется ограниченная кооперативность, при которой “бусинки” на онДНК соответствуют “октамерам” – кооперативно взаимодействующим смежным тетрамерам SSB. Мода (SSB)65 преобладает при низкой (< 0,01 M NaCl), а мода (SSB)35 – при высокой (> 0,2 M NaCl) ионной силе. При физиологических значениях ионной силы существует равновесная смесь этих двух мод связывания. Уже в 80-е годы в качестве рабочей модели взаимодействия белка SSB с онДНК была предложена следующая схема (рис. 2.13). В моде (SSB)35 только две из 4 субъединиц каждого тетрамера SSB взаимодействуют с онДНК, а в модах (SSB)56 и (SSB)65 в ассоциации с онДНК участвуют все 4 субъединицы. Во всех случаях онДНК связывается с поверхностью асимметричных субъединиц SSB и наматывается на поверхность белковой сердцевины тетрамера с образованием структуры, очень похожую на нуклеосому. В моде (SSB)65 два смежных тетрамера ассоциированыы друг с другом в октамер, на который намотан участок он ДНК длиной ~145 н. На участках длиной ~30 н. между двумя соседними октамерами SSB онДНК свободна от белка. Образование нуклеосомоподобной структуры в моде (SSB)65 сопровождается уменьшением контурной длины онДНК на 75%.

]

Рис. 2. 13. Модель предполагаемой организации комплексов белка

с онДНК.

I – мода связывания (SSB)35, II – моды связывания (SSB)56 и (SSB)65

 

Эта модель ещё не полностью доказана экспериментально. Только в 1997 г. методом рентгеностструктурного анализа с разрешением 2,9 А удалось установить структуру минимального домена связывания с онДНК, состоящего из остатков 1-135 белка SSB E. coli. Оказалось, что мономерная форма этого домена имет очень асимметричную форму, похожую на уголок (рис. 2.14, А). По своей структуре мономер SSB относится к большой группе белков с укладкой типа ОВ (оligomer binding – связывание олигомеров), связывающихся с олигонуклеотидами и олигосахаридами. Укладка ОВ является вариантом широкораспространенной укладки “греческого ключа”. В “основании” уголка SSB расположены a-спираль из остатков 61-70 и несколько b-нитей (нити 1-5). Из этого основания выступает сильно вытянутая петля L45 остатков 82-101, образующая b-шпильку 451-452.

В тетрамерах белка SSB объединяются b-нити оснований из всех 4 субъединиц SSB с образованием 6-нитевых b-плоскостей. Шпильки петель L45 смежных димеров, расположенных над или под плоскостью, попарно взаимодействуют друг с другом. В результате тетрамер SSB приобретает симметричную форму, похожую на эллипсоид вращения (рис. 2.14, В). На поверхности тетрамера расположены ароматические остатки трп54, трп88 и фен60, участвующие в стэкинг-взаимодействиях с основаниями онДНК, а также положительно заряженные остатки лиз62 и лиз73, важные для связывания с остовом онДНК (рис. 2.14, С).Взаимодействие с остатками, поставляемыми каждым из мономеров тетрамера SSB и переход от одного мономера к другому, вероятно, определяют геометрию наматывания онДНК на поверхность тетрамера. Однако в комплексах типа (SSB)56 и (SSB)65 она пока не установлена. Если в комплексах с SSB онДНК упаковывается на поверхности, то в комплексах с фаговым белком gp32 и эукариотическим белком RPA она, скорее, размещается во впадинах или каналах.

 

 
 

Рис. 2.14. Структура минимального домена связывания с онДНК (остатки 1-135) белка ` SSB E. coli.

A – мономерная форма, В – тетрамерная форма, С - распределение аминокислотных остатков, важных для связывания онДНК, на поверхности белка

 

Активной формой белка gp32 фага Т4 является мономер, который связывает участок онДНК длиной 6-7 н. Ассоциация gp32 с онДНК происходит с очень высокой, но не бесконечно большой кооперативностью, так что этот белок образует очень длинные кластеры на онДНК, но не покрывает её полностью. Связывание gp32 увеличивает контурную длину онДНК. Рентгеноструктурный анализ (разрешение 2,2 А) комплекса тетрануклеотида онДНК с минимальным связывающим онДНК доменом gp32 (остатки 22-239) показал, что этот домен содержит пять a-спиралей и восемь b-нитей. Домен состоит из трех субструктур: нижнего субдомена I, координационно связывающего Zn2+ с одним остатком гистидина и 3 остатками цистеина, верхнего субдомена II, имеющего структуру 5-нитевого b-слоя, и соединяющей их области из одной a-спирали и двух b-нитей. В домене связывания онДНК имеется положительно заряженная центральная «щель» с гидрофобными карманами для связывания оснований ДНК. Карманы содержат существенные ароматические аминокислотные остатки тир и фен, поставляемые b-нитями субдоменов I и II. Эта полость наиболее прочно связывает участок онДНК длиной 2-3 н. Связанная онДНК находится в растянутой конформации, в которой расстояние между соседними основаниями равно 5 Å, а не 3,4 Å, как в стандартной В-форме ДНК.

Очень похожий механизм ассоциации с онДНК обнаружен и для эукариотического белка RPA. Хотя самая большая субъединица RPA1 может самостоятельно связывать онДНК, физиологически активной является гетеротримерная форма. RPA связывается с онРНК в определенной полярности и имеет три основные моды ассоциации. В главной моде, имеющей высокое сродство к онДНК, но низкую кооперативность, тример RPA маскирует участок онДНК длиной 30 н. Вторая мода менее стабильна и, вероятно, является предшественником первой. В ней белок RPA проявляет более низкое сродство и более высокую кооперативность. Переход между этими двумя модами является физиологически важным событием для расплетания ДНК и происходит через промежуточное состояние, в котором RPA связывается с 13-14 н. в онДНК.

 

Рис. 2.15. Структура комплекса минимального домена связывания онДНК белка gp32 фага Т4.Указаны положения связанного катиона Zn2+, 3’-конца олигонуклеотида онДНК и нескольких ароматических аминокислотных остатков, существенных для связывания он ДНК

 

Структура минимального домена связывания с онДНК, состоящего из двух доменов (DBP-A и DBP-B) субъединицы RPA1 (остатки 181-422), и его комплекса с онДНК определена с разрешением 2,5 Å. В свободном состоянии домены А и В, соединенные гибким линкером (остатки 291-299), имеют укладку типа ОВ, важным признаком которой является 5-нитевой b-слой, сворачивающийся в b-бочку. В отсутствие ДНК тандем домеров А и В может находиться в двух разных конформациях: менее компактной и более компактной (рис. 2.16, А и В). Тандемная ориентация укладок ОВ становится ещё более компактной и значительно стабилизируется в присутствии онДНК (рис. 2.16, С). В комплексе с DBD1-DBD2 онДНК располагается во внутреннем канале белка диаметром ~17 Å. Каналы связывания онДНК в доменах А и В ориентированы в одном направлении, так что ДНК переходит из одного домена в другой по прямой линии. В образовании этих каналов важную роль играют вытянутые петли L12, которые образуют b-шпильки, как в белке SSB, и охватывают ДНК, подобно пальцам. В связыввании онДНК участвуют стэкинг с двумя ароматическими остатками (двумя остатками фен в домене А и остатками фен и трп в домене В) и водородные связи между аминокислотными остатками белка и основаниями и фосфатными группами онДНК. Домен А образует больше контактов с онДНК, чем домен В. Каждый из этих доменов взаимодействует с 3 н. онДНК и ещё 2 н. приходятся на долю линкера между доменами. Таким образом, структура комплекса с доменами DBP-A и DBP-B полностью объясняет моду связывания RPA c участком онДНК длиной 8 н.


Рис. 2.16. Структура тандема доменов DBP-A и DBP-B субъединицы RPA1 белка RPA.

А и В – две альтернативные конформации доменов в отсутствие ДНК, С – комплекс белка с онДНК

 

Для объяснения двух других мод связывания RPA необходимо привлечь ещё два домена (DBP-С на С-конце RPA1 и DBP-D в середине RPA2), которые, предположительно, также имеют укладку типа ОВ. Сборка моды связывания с 30 н. онРНК может происходить в несколько этапов (рис. 2.17). Первый из них состоит в связывании доменов DBP-A и DBP-B с участком длиной 8 н. Этот процесс инициируется доменом А, которые имеет более высокую активность и гибкость т первым ассоциируется с 5’-концом онДНК. Затем к нему присоединяется домен DBP-B. Последовательное связывание доменов А и В объясняет известную полярность (5’®3’) ассоциации RPA c онДНК. В результате первичного связывания тандема А+В белок RPA переходит из глобулярной формы (рис. 2.17, А) в более вытянутую (рис. 2.17, В). Изменение конформации сбъединицы RPA1 дает возможность связаться с онДНК следующему домену DBP-С, которые вместе с линкером между доменами В и С также должен занимать на онДНК участок длиной 5 н. В результате белок RPA переходит в промежуточную моду связывания с 13-15 н. На заключительном этапе присоединяется домен DВР-D из второй субъединицы RPA, связывающийся с 3’-стороны от DBP-С (рис. 2.17, D). Квартет доменов А, В, С и D, каждый из которых (вместе с линкером) занимает не более 5 н. на онДНК, образует сердцевину (18-20 н.) моды связывания RPA с 30 н. онДНК. Недостающие 10-12 н. в этой моде, вероятно, приходятся на долю N-концевого домена (NTD) RPA1 и области RPA2 за пределами домена DBP-D.

Рис. 2.17. Последовательные этапы сборки мод связывания белка RPA c участком онДНК длиной 30 н.

Домены DВР-А - DВР-D белка RPA изображены в виде ладоней, а онДНК – в виде стрелки

 

 

Праймазы

Синтез затравок РНК в процессе образования фрагментов Оказаки при репликации ДНК (преимущественно в отстающей нити) катализируется праймазами –… Праймаза DnaG E. coli кодируется существенным геном dnaG (67-ая мин… N-концевая область I c консервативным мотивом 1 содержит мотив цинкового пальца или ленты (положения 40-65) типа…

N I II III IV C

1 2 3 4 5 6

RNAP Toprim

I – домен связывания с ДНК, II – центральный каталитический домен, III - линкерный домен, IV – домен взаимодействия с другими белками. 1-6 – консервативные участки бактериальных и фаговых праймаз, RNAP – участок…  

ДНК-лигазы

ДНК-лигазы катализируют образование фосфодиэфирной связи в однонитевом разрыве (ОР) днДНК между смежными 3’-гидроксильным и 5’-фосфатным концами… Прототипом бактериальных ДНК-лигаз является продукт гена ligA (ранее lig),… У млекопитающих идентифицированы 4 разных типа ДНК-лигаз, содержащихся в ядерных экстрактах клеток. Главной функцией…

ЕрА

(+ 5’-р-ДНК на 5’-конце ОР)

Арр-ДНК (+ Е)

(+ ДНК-3’-OH на 3’-конце ОР)

ДНК-р-ДНК + рА

лигированная ДНК

O

t

Общий интермедиат Lys-eN+H2-P--СН2

EрA O- A

О

ОН OH

Рис. 2.20. Механизм лигирования ОР ДНК ДНК-лигазами двух классов. Представлена структура общего ковалентного интермедиата ЕрА

 

 

Несмотря на различия ДНК-лигаз двух разных классов, они выполняют близкие функции и могут замещать друг друга. Так, условно-летальный мутант E. coli, дефектный по НАД-зависимой лигазе LigA, полностью комплементируется активным фрагментом ДНК-лигазы I человека, а ДНК-лигаза LigA E. coli в свою очередь поддерживает митотический рост мутантов дрожжей с делециями генов CDC9 и LIG4, дефектных по АТФ-зависимым ДНК-лигазам I и/или IV. Однако бактериальная лигаза не исправляет дефект этих мутантов по экспцизионной репарации. Вероятно, для комплементации репаративного дефекта необходимы специфические взаимодействия ДНК-лигазы с родственными репаративными ферментами.

Рассмотрим более детально строение ДНК-лигаз и механизм последней стадии катализируемых ими реакций на примере НАД-зависимой ДНК-лигазы Tfi из термофильной бактерии Thermus filiformis – первой ДНК-лигазы, для которой методом рентгеноструктурного анализа установлена 3-мерная структура. Этот фермент, как и все ДНК-лигазы, имеет модульную организацию и состоит из 4 основных доменов (рис. 2.21). Он имеет длину 667 аминокислотных остатков (мол. м. 75,9 кД).

Рис. 2.21. Структура ДНК-лигазы Tfi из T. filiformis.

А. Домены и консервативные мотивы ДНК-лигазы Tfi. 1а – субдомен связывания НАД+, 1b – субдомен аденилирования, 2 – домен связывания олигонуклеотидов с укладкой ОВ, 3 – домен с цинковым пальцем и мотивом HhH спираль-шпилька-спираль, 4 – домен гомологии с белком BRCT; I, III, IV, V и VI – консервативные мотивы суперсемейства нуклеотидилтрансфераз.

B. Трехмерная структура ДНК-лигазы Tfi. Указано положение отдельных доменов

 

Самым большим является N-концевой домен 1, состоящий из двух субдоменов. На самом конце находится субдомен 1а длиной 73 остатка, являющийся сайтом связывания кофактора НАД+. Субдомен 1b (остатки 73-317) образован 3 антипараллельными b-слоями и несколькими фланговыми a-спиралями и является доменом аденилирования. Субдомен 1b содержит остаток лиз116 активного центра, подвергающийся аденилированию. Следующий домен 2 является доменом связывания олигонуклеотидов, т.к. он имеет укладку связывания олигомеров ОВ, похожую на укладку взаимодействия с онДНК у связывающих он ДНК белков. Домены 1 и 2 содержат все 5 консервативных мотивов нуклеотидилтрансфераз и вместе образуют минимальный домен ДНК-лигазы, достаточный для каталитической активности, т.к. в их пределах расположены все каталитически существенные аминокислотные остатки и остатки, необходимые для специфического связывания ДНК-лигазы с ОР ДНК. Домены 1 и 2 физически взаимодействуют друг с другом, что вызывает значительное повышение аденилирующей активности домена 1. Для такого взаимодействия необходимо сильное изменение конформации белка со смещением С-концевой части домена 2 в сторону домена 1.

Домен 3 (остатки 403-581) является вторым «некаталитическим» контактным участком, обеспечивающим связывание ДНК-лигазы с ДНК. Он образован 2 сегментами белка. Область остатков 403-429 содежит 4 консервативных остатка цистеина, образующих цинковый палец типа Сys4, а смежная область остатков 429-581 включает 4 копии мотива спираль-шпилька-спираль. Обе структуры часто используются белками для взаимодействия с ДНК. На самом С-конце ДНК-лигазы Tfi расположен необычный домен 4, или BRCT, гомологичный C-концевому домену эукариотического белка BRCA1, ассоциированного с раком молочной железы. Он состоит из 4-нитевого параллельного b-слоя и трех a-спиралей и имеется у очень многих лигаз. Домен 4 очень подвижен в так называемой «открытой» конформации ДНК-лигазы и сближен с N-концевым доменом 1а в «закрытой» конформации, в которой лигаза принимает тороидальную форму. Предполагается, что домен 4 играет в лигазе роль ворот, регулирующих связывание и освобождение днДНК. Подобно белку PCNA, в закрытой конформации ДНК-лигаза может образовывать скользящий зажим на ДНК и двигаться по ДНК до тех пор, пока она не встретит ОР. Аналогичную доменную структуру имеет ДНК-лигаза LigA E. coli, а в лигазе LigB отсутствуют два остатка цистеина цинкового пальца и весь С-концевой домен BRCT.

Известная 3-мерная структура ДНК-лигазы Tfi позволила предложить следующую гипотетическую схему (рис. 2.22), которая, вероятно, является общей для многих типов ДНК-лигаз. В исходном состоянии (А) лигаза находится в закрытом неактивном состоянии и неспособна связываться с ДНК. Аденилирование под действием НАД+ или АМФ (стадия I) переводит лигазу в открытое активированное состояние (В), в котором она неспецифически связывается с днДНК, вновь переходит в закрытое состояние С (стадия II) и транслоцируется по днДНК до тех пор, пока не встретит ОР в одной из нитей. Узнавание ОР в ДНК (стадия III) сопровождается изгибанием ДНК и изменением конформации белка на контактной поверхности между доменами 1 и 2. В результате 5’- и 3’-концы ОР оказываются в щели между этими доменами и сближаются с аденилированным остатком лиз116. Это обеспечивает деаденилирование белка и перенос АМФ на 5’-конец разорванной нити (стадия IV). В этом состоянии лигаза связывает катионы Mg2+, необходимые для атаки 3’-гидроксильной группы нити ДНК на активированный АМФ 5’-конец онДНК (стадия V). В результате происходит воссоединение ОР, освобождение неорганического фосфата pi и изменение конформации лигазы с переходом в открытую форму (F). Лигированная ДНК освобождается от ДНК-лигазы, которая возвращается в исходное неактивное закрытое состояние А (стадия VI).

 

Рис. 2.22. Модель каталитического цикла ДНК-лигазы Tfi.

I – аденилирование, II –связывание с ДНК, III – узнавание ОР и изгибание ДНК, IV – изменение конформации и деаденилирование фермента, V – воссоединение ОР и переход в открытую форму, V – освобождение ДНК.

1-4- домены ДНК-лигазы (см. рис. 2.21), 5 – ДНК с ОР; рi – неорганический фосфат. Стрелками указано положение связанной ДНК и АМФ в аденилированном ферменте

 

Рассмотрим более детально молекулярный механизм последней стадии лигирования – деаденилирования интермедиата ДНК-АМФ и образования фосфодиэфирной связи между концами ОР (рис. 2.23). В общих чертах, эта реакция протекает с участием 2-валентных катионов металлов так же, как и стадия полимеризации, катализируемой ДНК-полимеразами (см. 1.00). В механизме участвуют два катиона Mg2+, координационно связанные с карбоксильными группами остатков глу281, асп283 и асп118 в домене 1 ДНК-лигазы Tfi. Эти три остатка образуют отрицательно заряженный карман, расположенный рядом с аденилируемым остатком лиз116. Аденилированный интермедиат ДНК-АМФ в лигировании соответствует включаемому в ДНК 5’-дНТФ в реакции синтеза ДНК. В активный центр ДНК-лизазы Tfi входит также положительно заряженный остаток арг196, которые на предыдущей стадии узнавания ОР в ДНК мог электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженным 5’-фосфатным концом ДНК. Аналогичную архитектуру активного центра, вероятно, имеют все ДНК-лигазы.

 

Рис. 2.23. Модель активного центра ДНК-лигазы Tfi на заключительной стадии IV (рис. 2.21) воссоединения ОР.

 

 

ДНК-топоизомеразы

 

Рис. 2.24. Образование (+)-супервитков перед рекликативной вилкой и прекатенанов позади неё в процессе репликации и появление структуры «куриной лапы» после остановки репликативной вилки и разборки реплисомы


Таблица 2.2

Свойства и функции ДНК-топоизмераз

Рис. 2.25. Механизмы стадий расщепления и лигирования нити ДНК…  

ЛИТЕРАТУРА

 

1. Matson S.W. DNA helicases of Escherichia coli // Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., v. 40, 289-326, 1991

2. Lohman T.M. Helicase-catalyzed DNA unwinding // J. Biol. Chem., v. 268, 2269-2272, 1993

3. West S.C. DNA helicases: new breeds of translocating motors and molecular pumps // Cell, v. 86, 177-180, 1996

4. Lohman T.M., Bjornson K.P. Mechanism of helicase-catalyzed DNA unwinding // Ann. Rev. Biochem., v. 65, 169-214, 1996

5. Patel S.S., Picha K.M. Structure and function of hexameric helicases // Ann. Rev. Biochem., v. 69, 651-697, 2000

6. Hall M.C., Matson S.W. Helicase motifs: the engine that powers DNA unwinding // Mol. Microbiol., v. 34, 867-877, 1999

7. Kersey S.E., Labib K. MCM proteins: evolution, properties, and role in DNA replication // Biochim. Biophys. Acta, v. 1398, 113-136, 1998

8. Tye B.K., Sawyers S. The hexameric eukaryotic MCM helicase: building symmetry from nonidentical parts // J. Biol. Chem., v. 275, 34833-34836, 2000

9. Labib K., Diffley J.F.X. Is the MCM2-7 complex the eukaryotic DNA replication fork helicase? // Curr. Opin. Genet/ Devel., v. 10, 64-70, 2001

10. von Hippel P.H., Delagoutte E. A general model for nucleic acids helicase and their “coupling” within macromolecular machines // Cell, v. 104, 177-190, 2001

11. Chase J.W., Williams K.R. Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication // Ann. Rev. Biochem., v. 55, 103-136, 1986.

12. Lohman T.M, Bujalowski W., Overman L.B. E. coli single strand binding protein: a new look at helix-stabilizing proteins // Trends Biochem. Sci., v. 13, 250-255, 1988.

13. Wold M.S. Replication protein A: a heterodimeric, single stranded DNA-binding protein required for eucaryotic DNA metabolism // Ann. Rev. Biochem., v. 66, 61-92, 1997.

14. Raghunathan S., Ricard C.S., Lohman T.M., Waksman G. Crystal structure of the homo-tetrameric DNA binding domain of Escherichia coli single-stranded DMA binding protein determined by multiwavelength x-ray diffraction on the selenomethionine protein at 2.9-A resolution // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 94, 6652-6657, 1997.

15. Shamoo Y., Friedman A.M., Parsons M.R., Konigsberg W.H., Steitz T.A. Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA // Nature, v. 376, 362-366, 1995.

16. Bochkareva E., Belegu V., Korolev S., Bochkarev A. Structure of the major single stranded DNA-binding domain of replication protein A suggests a dynamic mechanism for DNA binding // EMBO Journal, v. 20, 612-618, 2001.

17. Griep M.A. Primase structure and function // Indian J. Biochem. Biophys., v. 32, 171-178, 1995.

18. Arezi B., Kuchta R.D. Eucaryotic DNA primase // Trens Biochem. Sci., v. 25, 572-576, 2000.

19. Frick D.N., Richardson C.C. DNA primases // Ann. Rev. Biochem., v. 70, 39-80, 2001.

20. Aravind L., Leipe D.D., Koonin E.V. Toprim – a conservative domain in type IA and II topoisomerases, DnaG-type primases, OLD family nucleases and RecR proteins // Nucl. Acids Res., v. 26, 4205-4213, 1998.

21. Lehman I.R. DNA ligase: structure, mechanism, and function // Science, v. 186, 790-797, 1974

22. Lindahl T., Barnes D.E. Mammalian DNA ligases // Ann. Rev. Biochem., v. 61, 285-281, 1992.

23. Doherty A.J., Suh S.W. Structural and mechanistic conservation in DNA ligases // Nucleic Acids Res., v. 28, 4051-4058, 2000

24. Shuman S., Schwer B. RNA capping enzyme and DNA ligase: modular architecture and functional implications // Mol. Microbiol., v. 17, 405-410, 1995.

25. Lee J.Y., Chang C., Song H.K. et al. Crystal structure of NAD+-dependent DNA ligase: modular architecture and functional implications // EMBO Journal, v. 19, 1119-1129, 2000.

26. Postow L., Crisona N.J., Peter B.J., Hardy C.D., Cozzarelli N.R. Topological challenges to DNA replication // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 98, 8219-8236, 2001.

27. Wang J.C. DNA topoisomerases // Ann. Rev. Biochem., v. 65, 635-692, 1996

28. Berger J.M. Structure of DNA topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 3-18, 1998

29. Champoux J.J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism // Ann. Rev. Biochem., v. 70, 369-413, 2001.

30. Tse-Dinh Y.-C. Bacterial and archeal type I topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 19-27, 1998.

31. Levine C., Hiasa H., Marians K.J. DNA gyrase and topoisomerase IV: biochemical activities, physiological roles during chromosome repkication, and drug sensitivities // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 29-43, 1998.

32. Nitiss J.L. Investigating the biological functions of DNA topoisomerases in eukariotic cells // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 63-81, 1998.

 

ГЛАВА 3. Инициация репликации хромосомной ДНК

 

 

3.1. Инициация репликации хромосомы E. coli

Белок-инициатор DnaA

Белок DnaA играет ключевую роль в инициации репликации хромосомы у многих бактерий. Он последовательно выполняет 3 главные функции: 1) узнает… У E. coli белок DnaA имеет длину 467 остатков (рис. 3.1) и состоит из 4… Все белки DnaA имеют модульную структуру. Первые 86 остатков DnaA образуют домен олигомеризации, состоящий из…

Минимальная область начала репликации oriC y E.coli

Область начала репликации (ОНР) oriC является уникальным местом инициации нормальной двунаправленной репликации хромосомы E. coli и расположена на… Бактериальные ОРС содержат сайты GATC, остатки А в которых специфически… Минимальная ОНР oriC состоит из 2 модулей. Правые 2/3 занимает модуль взаимодействия с белком DnaA. В этой области…

AT L M

       
 
   
 

gt gatctcttattag gatcgcactgccc tgtggataa caaggatccggcttttaa

ca ctagagaataatc ctagcgagacggg acacctatt gttcctaggccgaaaatt

R R1

 
 


gatcaacaacctggaaaggatcattaac tgtgaatga tcggtgatcctggaccgtataagctgg

ctagttgttggacctttcctagtaattg acacttact agcctctaggacctggcatattcgacc

IHF R5(M)

gatcagaatgagggg ttatacaca actcaaaaactgaacaacagttgttc tttggataa ct ctagtctttctcccc aatatgtgt tgagtttttgacttgttgtcaacaag AaACCTATT ga  

R4

 

 

Рис. 3.2. Минимальная область начала репликации oriC E. coli.

Вертикальными линиями отмечены границы минимальной области ori. Cайты GATC изображены прописными буквами, а блоки DnaA (R1-R5) -подчеркутыми прописными буквами и указана их ориентациия (строчными буквами в этих блоках отмечены отклонения от консенсусной последовательности 5'-ТТАТССАСА). Курсивом с подчеркиванием обозначены сайты связывания белков IHF и Fis. Двусторонние стрелки отмечают положения АТ-богатых областей (АТ-участка и 13-меров L, M и R). Подчеркнутыми жирными буквами набраны сайты связывания DnaA-АТФ и стрелками указана их ориентация

Этапы инициации репликации на ОНР oriC

Для инициации репликации в ОНР oriC необходимо, чтобы матрица ДНК находилась в сверхскрученной кольцевой форме. Первой стадией инициации является…  

Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli

Контроль инициации репликации хромосомы в области oriC имеет два аспекта. Прежде всего, репликация инициируется в фиксированный момент клеточного… Второй аспект регуляции состоит в том, что каждая копия ОНР oriC в данной… · Секвестрирование oriC

Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

В 16 хромосомах S. cerevisiae содержатся от 250 до 400 ОНР. Все изученные элементы ARS у дрожжей, имеющие модульную структуру, состоят из доменов А… Домен В в ARS состоит из 3 элементов. Ближайший к ACS элемент В1 образует… В прототипный элемент ARS1 иногда включают и третий домен С, расположенный по другую сторону от ACS и упакованный в…

Сайт связывания комплекса ORC

 

Рис. 3.5. Организация прототипной области начала репликации ARS1

S. cerevisiae.

Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации двунаправленной репликации хромосомной ДНК. Приведена последовательность комплементарной нити сайта ACS

 

Таблица 3.1

Сравнение субъединиц комплекса ORC из разных эукариотов

Cубъединица ORC Мол. масса (кД) Консерватизм*
S. cere- visiae Drosophila Xenopus Идентич- ность (%) Гомология (%)
               

* - Приведены средние значения идентичности и гомологии между белками S. cerevisiae, дрозофилы и человека

Связанный с ДНК комплекс ORC защищает участок ДНК длиной около 50 п.н. Для связывания с ARS требуется координированное действие 5 из 6 субъединиц ОRС и не нужна лишь самая маленькая субъединица Orc6. Предварительные данные об архитектуре комплекса ORC на ДНК ARS получены с использованием сшивки химическими агентами и УФ-светом. Показано, что субъединицы Orc1, Orc2 и Orc4 взаимодействуют только с верхней нитью последовательности ACS в большой канавке ДНК, а субъединица Orc5 контактирует со смежным элементом В1 (рис. 00). Такая асимметрия связывания с нитями ДНК характерна и для многих других белков, участвующих в инициации репликации. Комплекс ORC может рассматриваться как белок-инициатор – аналог DnaA. Однако он занимает ОНР во время клеточного цикла постоянно, а не только в фазе S. Очевидно, что простого связывания ORC с ОНР недостаточно для инициации репликации. Комплекс ORC играет лишь роль “посадочной площадки” на ДНК, необходимой для последовательной вербовки на ДНК других компонентов аппарата инициации репликации.

 

Рис. 3.6. Архитектура комплекса ORC c ДНК ARS.

1-6 – субъединицы Orc1-Orc6. Двусторонними стрелками изображены взаимодействия белков Orc друг с другом и с основаниями элементов ACS и В1области начала репликации ARS

 

Этапы пути инициации репликации на ОНР у дрожжей

Погрузка геликазы МСМ на ORC-ARS в начале фазы G1 завершает образование “предрепликативного комплекса”, в котором ОНР получила “лицензию на… Одним из субстратов для Cdc28-Clb является белок Cdc6, который сыграл свою…  

Рис. 3.7. Этапы пути инициации репликации ДНК у дрожжей

 

 

Рис. 3.8. Схема участия белков МСМ, ДНК-полимеразы a - праймазы и белков Cdc45 и

RPA в инициации репликации на эукариотической области ori

 

После образования двунаправленных репликативных вилок геликаза МСМ и белок Cdc45 выходят из контакта с комплексом ORC и перемещаются вместе с репликативной ДНК-полимеразой. На ДНК ARS остается только пострепликативный комплекс, содержащий ORC – как и в начале пути инициации репликации. Такие комплексы существуют в течение митоза и ранней фазы G1 на копиях ARS в обеих дочерних хромосомах.

 

Инициация репликации у высших эукариотов

3.3.1. Белковые компоненты и путь инициации репликации   Гомологи большинства белков S. cerevisiae, участвующих в описанном выше пути инициации репликации (Orc1-Orc6, Cdc6,…

А.

 

90 40 60 165 330 65 190 (п.н.)


Область I область II область III

 

 

В.

 

orib orib’ orig

17 5 23 (т.п.н.)

 
 


DHFR зона активности ori 2BE2121

 
 


Т.п.н.

 

Рис. 3.9. Организация некоторых ОНР у эукариотов

А. Минимальная область автономно реплицирующейся последовательности ARS2404 S. pombe.

Обозначены размеры существенных областей I, II и III и расстояния между ними. Жирной линией указано положение зоны инициации репликации, идентифицированной методом двумерного электрофореза

В. Локус DHFR областей начала репликации (orib, orib’ и orig) в клетках СНО китайского хомячка

 

Анализ возможных ОНР у высших эукариотов оказался весьма затруднительным из-за отсутствия хромосомных фрагментов ARS, которые в плазмидах реплицируются столь же эффективно, как и в хромосомной ДНК. Выделить такие ОНР методом клонирования на плазмидах невозможно. В лучшем случае они очень неэффективны в роли ARS. Поэтому для идентификации областей хромомомы, в которых происходит инициация репликации, приходится использовать более сложные методы, имеющие недостаточно высокую разрешающую способность.

Первый метод физического картирования ОНР в клетках млекопитающих основан на двумерном электрофорезе в агарозном геле рестрикционных фрагментов хромосом, выделенных из синхронизированной в фазе S клеточного цикла культуры клеток. При разделении в первом направлении используют низкую концентрацию агарозы и небольшую напряженность электрического поля. В этих условиях фрагменты ДНК разделяются в соответствии с их молекулярными массами независимо от формы. При разделении в направлении, перпендикулярном первому, применяют условия, в которых электрофоретическая подвижность фрагментов ДНК становится зависящей от формы (высокую концентрацию агарозы, низкую температуру и высокую напряженность). Линейные нереплицированные молекулы ДНК, имеющие одинаковую подвижность в обоих условиях, располагаются после двумерного электрофореза на диагонали агарозной пластинки. Разветвленные, имеющие форму буквы Y фрагменты, содержащие одну репликативную вилку, мигрируют более медленно, чем линейные, и образуют выше диагонали дугу с восходящей и нисходящей ветвями. Еще медленнее мигрируют фрагменты ДНК, в центре которых расположена область инициации двунаправленной репликации, т.е. пузырек ДНК. Они образуют дугу с восходящей ветвью, расположенную выше дуги Y-фрагментов (рис. 00). Для визуализации в геле нужных фрагментов ДНК применяют гибридизацию с радиоактивно меченными зондами, соответствующими анализируемой области генома. Этот метод позволяет установить примерное положение области инициации двунаправленной репликации.

 

 

А. В. С.

  А. Репликация инициировалась за пределами изучаемого фрагмента ДНК, так что он… В. Фрагмент содержит расположенную в его центре область начала двунаправленной репликации. По мере роста…

CAAAAGCAAGACAAA GACAAGC TCCAAATAAGATTCA Orib хомячка (CHO)

CAAAAGCAAA-AAAA ATTGAGA TAAAATTACAATAAA ACE3 Drosophila

CAAAAGGAAA-TACT TCTGAGA TACATTAAGTAACTT b-глобин человека

СAAAATGTTT—-ATT GGAGTGT TGTACAAAAAAGTTT ламин В2 человека

 

B1 A

Рис. 3.11. Сравнение первичных последовательностей предполагаемых сайтов связывания ORC в пяти эукариотических ОНР.

Выделены нуклеотидные остатки, совпадающие с ARS1 S. cerevisiae

Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

В эукариотических клетках существует главный регуляторный механизм, делающий инициацию репликации на каждой ОНР возможной один и только один раз за… Повторная сборка такого комплекса до завершения митоза запрещается несколькими… Однократное использование ОНР за клеточный цикл вовсе не означает, что инициация синтеза ДНК на всех ОНР в…

ЛИТЕРАТУРА

 

1. Messer W. Initiation of DNA replication in Escherichia coli // J. Bacteriol., v. 169, 3395-3399, 1987.

2. Georgopoulos C. The E. coli dnaA initiation protein // Trends Biochem. Sci., v. 5, 319-321, 1989.

3. Skarstad K., Boye E. The initiator protein DnaA: evolution, properties and function // Biochim. Biophys. Acta, v. 1217, 111-130, 1994.

4. Messer W., Blaesing F., Majka J. et al. Functional domains of DnaA proteins // Biochimie, v. 81, 819-825, 1999.

5. Messer W., Blaesing F., Jakimowicz D. et al. Bacterial replication initiator DnaA. Rules for DnaA loading and roles of DnaA in origin unwinding and helicase loading // Biochimie, v. 83, 5-12, 2001.

6. Marczynski G.T., Shapiro L. Bacterial chromosome origins of replication // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 3, 775-781, 1993

7. Crooke E. Regulation of chromosomal replication in E. coli: sequestration and beyond // Cell., v. 82, 877-880, 1995.

8. Norris V., Fralick J., Danchin A. A SeqA hyperstructure and its interactions direct the replication and sequestration of DNA // Mol. Microbiol., v. 37. 696-702, 2000.

9. Boye E., Lobner-Olesen A., Skarstad K. Limiting replication to once and only once // EMBO Reports, v. 11, 479-483, 2000.

10. Katayama T., Fujimitsu K., Ogawa T. Multiple pathways regulating DnaA function in Escherichia coli: distinct roles for DnaA titration by the datA locus and the regulatory inactivation of DnaA // Biochimie, v. 83, 13-17, 2001.

11. Newlon C.S. Putting it all together: building a prereplicative complex // Cell, v. 91, 717-720, 1997.

12. Takisawa H., Mimura S., Kubota Y. Eukaryotic DNA replication: from pre-replication complex to initiation complex // Curr. Opin. Cell Biol., v. 12, 690-696, 2000.

13. Ritzi M., Knippers R. Initiation of genome replication: assembly and dissembly of replication-competent chromatin // Gene, v. 245, 13-20, 2000.

14. DePamphilis M.L. Origins of DNA replication // In: “DNA Replication in Eukaryotic Cells”, 1996, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 45-86.

15. DePamphilis M.L. Initiation of DNA replication in eukaryotic chromosomes // J. Cell. Biochem. Suppl., v. 30-31, 8-17, 1998.

16. Bogan J.A., Natale D.A., DePamphilis M.L. Initiation of eukaryotic DNA replication: conservative or liberal // J. Cell. Physiol., v. 184, 139-150, 2000.

17. Bryant J.A., Moore K., Aves S.J. Origins and complexes // J. Experim. Bot., v. 53, 192-202, 2001.

18. Jares P., Donaldson A., Blow J.J. The Cdc7/Dbf4 protein kinase: target of the S phase checkpoint? // EMBO Reports, v. 11, 319-322, 2000.

19. Masai S., Arai K. Cdc7 kinase complex: a key regulator in the initiation of DNA relication // J. Cell. Physiol., v. 190, 287-296, 2002.

20. Dijkwel P.A., Hamlin J.L. Physical and genetic mapping of mammalian replication origins // Methods: a Comparison to Methods in Enzymol., v. 18, 418-431, 1999.

21. Gilbert D.M. Replication origins in yeast versus metazoa: separation of the haves and the haves nots // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 8, 194-199, 1999.

22. Francon P., Maiorano D., Mechali M. Initiation of DNA replication in eukaryotes: questioning the origin // FEBS Lett., v. 452, 87-91, 1999.Chevallier S., Blow J.J. Cell cycle control of replication initiation in eukaryotes // Curr. Opin. Cell. Biol., v. 8, 815-821, 1996.

23. Donaldson A.D., Blow J.J. The regulation of replication origin activation // Cur. Opin. Genet. and Devel., v. 9, 62-68, 1999.

24. Littlewood J. Emerging mechanisms of eukaryotic DNA replication initiation // Curr. Opin. Cell Biol., v. 10, 742-748, 1998.

25. Rowles A., Blow J.J. Chromatin proteins involved in the initiation of DNA replication // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 7, 152-157, 1997.

26. Hyrien O., Maric C., Lucas I. Role of nuclear architecture in eukaryotic DNA replication // Biochimie, v. 79, 541-548, 1997.

27. Larkins B.A., Dilkes B.P., Dante R.A., Coelho C.M., Woo Y., Liu Y. Investigating the hows and whys of DNA endoreduplication // J. Experim. Bot., v. 82, 183-192, 2001.

 

 

– Конец работы –

Используемые теги: Эукариотические, ДНК-полимеразы, ДНК-полимеразы, археев0.074

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Еще рефераты, курсовые, дипломные работы на эту тему:

Строение эукариотической клетки
Поверхностный комплекс животной клеткиСостоит из гликокаликса плазмалеммы и... Вокруг центриолей находится так называемый центр организации цитоскелета район в котором группируются минус концы...

Ядро клетки. Наследственный аппарат прокариотической и эукариотической клетки. Наследственный аппарат клеток человека
В году Роберт Броун открыл ядро и доказал что ядро является постоянным и непременным компонентом клетки Форма ядра определяется формой... В процессе жизни ядро наиболее стабильно в... Классификация метафазных хромосом...

Эукариотическая клетка
Отличаясь от прокариот более сложной организацией, они используют в своей жизнедеятельности больший объем наследственной информации. Так, общая… Полезно заметить, что многоклеточность возникла в эволюции в период, когда… Особенностью организмов простейших рис. 2.2 является то, что они исключая колониальные формы соответствуют в…

Строение эукариотической и прокариотической клеток
В известном смысле клетки находятся на полпути между молекулами и человеком.Мы изучаем клетки, чтобы понять, каково их молекулярное строение, с… Два основных процесса эволюции - это 1. случайные изменения генетической… Однако, эти древние события оставили много следов, которые мы можем анализировать. ПреДНКовые растения, животные и…

Происхождение эукариотических клеток
В царство протоктистов входят водоросли , протозои, слизевики и другие эукариотические организмы неясной принадлежности . Протисты определены более… Все клетки содержат рибосомы - тельца диаметром около 0,02 мкм , состоящие из… Прокариотичесие организмы - наименьшие биологические единицы , которые удовлетворяют этому определению клетки . У них…

0.038
Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • По категориям
  • По работам