рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Погрузчики скользящего зажима

Погрузчики скользящего зажима - раздел Биология, Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев   Кольца Олигомерных Форм Белков Dnan И Pcna Являются Очень Ста...

 

Кольца олигомерных форм белков DnaN и PCNA являются очень стабильными. Так, константа диссоциации димера DnaB не превышает 50 нМ, а период «полураспада» димерного кольца, надетого на ДНК, равен ~ 100 мин при 37о. Это означает, что спонтанная погрузка колец скользящих зажимов на кольцевую ДНК бактериальной хромосомы или на очень длинные эукариотические линейные хромосомы маловероятна. Для погрузки на ДНК необходимо временное размыкание колец хотя бы по одной из контактных поверхностей между субъединицами, чтобы через образующуюся щель внутрь кольца могла проникнуть ДНК. Этот процесс требует участия специальных молекулярных машин – погрузчиков зажима: g-комплекса бактериальной ДНК-полимеразы III или комплекса фактора репликации С (RFC) у эукариотов и археев. Эти комплексы содержат субъединицы, похожие на члены суперсемейства белков ААА+. Сокращенное обозначение ААА означает «АТФ-азы, ассоциированные с различными клеточными активностями».

 

Белки ААА+

Белки суперсемейства ААА+ действительно, участвуют в разнообразных клеточных процессах: 1) в АТФ-зависимом протеолизе короткоживущих и развернутых белков у бактерий (например, протеазы Lon и протеазные комплексы с участием субъединиц ClpA ClpX, гены которых входят в регулон теплового шока у E. coli); 2) в регуляции активности эукариотических протеасом 26S, каждая из регуляторных частиц которых содержит 6 разных, но близкородственных белков ААА; 3) в регуляции слияния мембран в процессах опосредованного везикулами транспорта (например, белок NSF/Sec18p) и передачи нервных импульсов; 4) в работе моторного белка динеина, переносящего грузы вдоль микротрубочек; 4) в генетической рекомбинации (например, бактериальный моторный белок RuvB, участвующий в миграции рекомбинационного холидеевского стыка по ДНК). Особую группу образуют белки ААА+, участвующие в репликации ДНК. Одни из них необходимы для сборки комплексов инициации репликации. К ним относятся бактериальный белок DnaA и эукариотические белки комплексов ORC и MCM (см. гл. 3). Вторую подгруппу составляют погрузчики скользящих зажимов ДНК-полимераз.

Все белки ААА+ выполняют работу, сопряженную со связыванием и гидролизом АТФ, для выполнения их биологической функции, которая часто состоит в разборке белок-белковых и ДНК-белковых комплексов. Белки суперсемейства ААА имеет консервативный сегмент длиной около 220 остатков, который обычно называют модулем ААА, или модулем связывания нуклеотидов. Он состоит из доменов I и II, содержащих высококонсервативные мотивы аминокислотной последовательности. В домене I расположен активный центр связывания и гидролиза АТФ. Он содержит характерные для многих АТФаз мотивы Уокера (J. Walker) А и В. Мотив А с консенсусной последовательностью GxxxGKT, где х –произвольный остаток, образует в домене I так называемую Р-петлю, которая взаимодействует с необходимым для АТФазной активности катионом Mg2+ при участии остатка треонина и с b- и g-фосфатными группами АТФ при участии остатка лизина. Уокеровский мотив В (DExx) cодержит 2 смежные карбоксильные группы. Одна из них принадлежит остатку асп и входит к координационную сферу Mg2+, а вторая относится к остатку глу и считается каталитическим основанием АТФазы.

Кроме этих необходимых для АТФазной активности участков, домены I и II содержат так называемые сенсорные мотивы 1 и 2, которые способны различать, какой нуклеотид (АТФ или АДФ) связан с активным центром белка ААА+. В таком распознавании важную роль играют консервативные остатки асн и тре сенсора-1 в домене I, способные образовывать водородную связь только с g-фосфатом АТФ. В сенсоре-2, находящемся с домене II, находится остаток арг, который электростатически взаимодействует с g-фосфатом АТФ. Гидролиз АТФ до АДФ устраняет узнаваемую сенсорами g-фосфатную группу. Это приводит к изменению конформации сенсора-2 и всего белка ААА+. Таким образом, белки ААА+ в комплексах с АТФ и АДФ могут находиться в разных конформационных состояниях. Изменение конформации этих белков может играть роль молекулярного переключателя. В этом отношении белки ААА+ похожи на маленькие связывающие гуаниновые нуклеотиды эукариотические мембранные белки типа Ras в цепи передачи сигнала, которые также находятся в разных конформационных состояниях: активном в комплексе с ГТФ и неактивном в комплексе с ГДФ.

Дополнительный домен 3, прикрепленный к модулю ААА у некоторых белков ААА+, не консервативен у разных типов этих белков, и может, участвовать, например, в образовании их олигомеров. Все белки ААА+, для которых установлена 3-мерная структура, являются кольцевыми олигомерами. Их кольца чаще состоят из 6 и реже из 5 или 7 субъединиц. В мультимерных комплексах белков ААА+ сенсорные мотивы одного протомера иногда могут узнавать g-фосфатную группу АТФ, связанного с соседним протомером. Поэтому переход АТФ®АДФ в одной субъединице может сопровождаться изменением конформации смежных субъединиц.

 

g-Комплекс погрузчика зажима ДНК-полимеразы III E. coli

 

Из пяти разных субъединиц g-комплекса ДНК-полимеразы III E. coli только три (g, d и d’) существенны для действия погрузчика скользящего зажима. Рентгеноструктурный анализ субкомплекса gdd’ показал, что он содежит три протомера g и по одному протомеру d и d’. Данные, полученные при реконструкции этого субкомплекса in vitro, продемострировали, что любая из субъединиц g может быть заменена на более длинную субъединицу t, так что субкомлекс может содержать от 3 протомеров g до 3 протомеров t. Следовательно, уникальные для t С-концевые домены IV и V (см. 1.2.3) не мешают работе погрузчика.

Субъединица g в g-комплексе наиболее похожа на белки семейства ААА+. Она имеет форму буквы С и состоит из 3 доменов (рис. 1.18, А). Типичный N-концевой домен, похожий по общей укладке на домен связывания АТФ в рекомбинационном белке RecA, содержит уокеровские домены А (GTRVGDKTS) и В (DEVH) и сенсор-1. Короткий соединительный домен II, состоящий из 4 a-спиралей, содержит сенсор-2 с типичным остатком арг. С-концевой домен III, имеется только у белков-погрузчиков в суперсемействе ААА+. Он состоит из нескольких a-спиралей и участвует в белок-белковых взаимодействиях. Субъединицы d и d’ по первичной аминокислотной последовательности имеют низкий уровень гомологии с g, причем субъединица d наименее консервативна. Тем не менее, рентгенгеноструктурный анализ индивидуальной субъединицы d’ и субъединицы d в составе субкомплекса g3dd’ показал, что по 3-мерной структуре эти компоненты субкомплекса очень похожи на белки ААА+ по общей укладке. Их молекулы имеют форму буквы С и содержат типичные для белков ААА+ пространственные домены I и II, а домены III, как и в субъединице g, состоят преиущественно из a-спиралей. С другой стороны, в доменах I субъединиц d и d’ отсутствуют компоненты активного АТФазного центра. Так, у белка d’ в Р-петле существенные остатки KT заменены на DD, в уокеровском мотиве В отсутствует один из кислых остатков, а в сенсоре-2 из домена II консервативный остаток арг заменен на гли. Еще более сильно изменена структура этих мотивов в субъединице d. Следовательно, эти субъединицы не могут связывать и гидролизовать АТФ. Такой активностью обладает только субъединица g, считающаяся мотором погрузчика скользящего зажима.

 

 

Рис. 1.1800. Структура субъединиц g (А) и d’ или d (В) комплекса погрузчика скользящего зажима ДНК-полимеразы III E.coli.

BIE – участок взаимодействия с b-субъединицей, содержащийся только в субъединице d

 

Из всех индивидуальных компонентов субкомплекса gdd’ только свободная субъединица b с наибольшим сродством связывается с b-кольцом, надетым на ДНК, и может вызывать его освробождение, т.е. размыкать контакты между b-субъединицами в димере. Свободная субъединица g связывается с b-кольцом гораздо слабее и в 20 раз менее эффективно разгружает его с ДНК. Субъединица d’ не может вызывать разгрузку b-колец. Более того, связывание d’ с d ингибирует разгрузку b-кольца. Таким образом, характеристической способностью вызывать размыкание колец димерной формы b обладает только субъединица d.

Ретнгеноструктурный анализ комплекса субъединиц d и b позволил установить молекулярный механизм размыкания d-кольца. Из трех доменов d-субъединицы только N-концевой домен I может контактировать с b. Специфический выступ на дистальном конце этого домена, напоминающий по форме треугольный клин и содержащий существенные гидрофобные остатки, внедряется в гидрофобную щель между доменами 2 и 3 на одной стороне внешней поверхности субъединицы b (рис. 1.19, С). Белок d взаимодействует не контактными поверхностями мономеров в димере b, а с консервативным участком, соотетствующим сайту взаимодействия b с a-субъединице ДНК-полимеразы III.

Cравнение конфигурации мономера b-субъединицы в свободной форме или в форме открытого кольца после взаимодействия с d и в закрытой форме свободного b-кольца показало, что кривизна b-субъединицы в первом случае гораздо меньше, чем во втором. Это позволило предположить, что в закрытой форме кольца поверхность контакта между мономерами b находится в напряженном состоянии и что взаимодействие поверхности b-субъединицы с клином белка d вызывает изменение конформации этого мономера b, снимающим это напряжение и вызывающим образование щели на ближайшей поверхности контакта b-b. Размер этой щели достаточен для того, чтобы пропустить внутри кольца или из него онДНК, но не днДНК. Этот процесс идет в отсутствие АТФ, т.е. не требует затараты энергии. Таким образом, белок d действует как молекулярный клин, индуцирующий изменение конформации и вызывающий раскрывание b-кольца.

В клетке E.coli содержится ~ 950 молекул d и только 140 молекул ее ингибитора – белка d’. Следовательно, около 800 молекул белка d находятся в свободном состоянии и могут участвовать в разгрузке с ДНК b-колец, покинутых ДНК-полимеразой III во время синтеза отстающей нити. Это способствует рециклированию b-колец, общее число которых на клетку составляет ~ 300 и гораздо меньше общего числа скользящих зажимов, требующихся для полной репликации всего генома E. coli (2000-4000).

Несмотря на присутствие d-субъединицы в субкомплексе g3dd’, он не может в отсутствие АТФ вызывать размыкание b-колец, необходимое для их погрузки на ДНК. Однако в присутствии АТФ комплексы g3dd’ служат эффективными погрузчиками. Это позволило предположить, что в отсутствие АТФ в комплексе g3dd’ субъединица d’ маскирует N-концевой клин субъединицы d, не давая ему взаимодействовать с поверхностью b-кольца. В присутствии АТФ конформация всего комплекса изменяется, он переходит в более открытую форму, в которой субъединица d становится доступной для взаимодействия с b-кольцом. Изучение кристаллической структуры комплекса g3dd’ подтвердило эту гипотезу.

В петамерном кольцевом комплексе g3dd’ индивидуальные субъединицы расположены по кругу в следующем порядке: …d’-g1-g2-g3-d… (рис. 1.19, А). С-концевые домены III всех субъединиц участвуют в их ассоциации в пентамер. Ассоциация обеспечивается встраиванием a-спирали первого партнера каждой пары в гидрофобную щель между двумя a-спиралями следующего партнера. По 3-мерной структуре комплекс g3dd’ похож на кисть правой руки, сложенную в щепоть (рис. 1.19, В). Соединенные С-концевые домены всех субъединиц соответствуют ладони, а домены I и II вместе взятые –пальцам (субъединица d’ – большой палец, три смежные субъединицы g1, g2 и g3 - указательный, средний и безымянный пальцы и субъединица d - мизинец).

 

Рис. 1.1900. Трехмерная структура комплекса погрузчика скользящего зажима ДНК-полимеразы III E. coli.

А – вид сверху, В – вид сбоку (в неактивном состоянии в отсутствие связанного АТФ), С – взаимодействие N-концевой области субъединицы d с кольцом субъединицы b

 

Можно предположить, что в отсутствие АТФ комплекс g3dd’ находится в «закрытой» конфигурации, в которой кончики «пальцев» тесно прижаты друг к другу. В этом состоянии N-конец субъединицы d’ маскирует в субъединице d участок клина BIE, взаимодействующего с b-кольцом, и комплекс g3dd’ не может вызывать размыкание кольца. При взаимодействии с АТФ происходит постепенный переход комплекса в открытую конфигурацию, обусловленный изменением коформации всех субъединиц, за исключением d’, которая играет роль конформационно стабильного статора в погрузчике зажима. Три молекулы АТФ связываются только с 3 субъединицами g и, вероятно, в строго определенном порядке. Вначале АТФ взаимодействует только с субъединицей g1, т.к. только на стыке d’-g1 домен связывания АТФ в субъединицах g открыт для АТФ. Образование комплекса g1-АТФ вызывает характерные для белков ААА+ конформационные изменения на стыке g1-g2 при участии сенсорных доменов, открывающие для связывания АТФ домен I в g2 и т.д. Связывание АТФ с последней АТФазной субъединицей g3 вызывает изменение конформации в белке d, N-концевой домен которого спасается от секвестрирования смежной субъединицей d’. Это придает комплексу g3dd’ способность ассоциироваться с b-кольцом и раскрывать его по одной из контактных границ между мономерами. Таким образом, при раскрывании b-кольца АТФ необходим только для изменения конформации комплекса g3dd’.

Эти события соответствуют переходам из состояния “a” в состояние “c” на общей схеме погрузки скользящего зажима на ДНК (рис. 1.20). Комплекс g3dd’ в отсутствие b-кольца имеет очень низкое сродство к ДНК независимо от присутствия АТФ. Однако в присутствии белка b он приобретает способность связываться с ДНК, предпочитая стыки затравка-матрица. По-видимому, после открывания b-кольца через щель между мономерами субъединицы b внутрь кольца пропускается нить онДНК на таких стыках, и комплекс g3dd’ прикрепляется к ДНК (cостояние “d”). Взаимодействие с ДНК по неустановленному механизму активирует АТФазую активность g-субъединиц и вызывает переход по меньшей мере двух из них в форму комплекса с АДФ. Смена партнера в АТФазных центрах этих субъединиц узнается их доменами сенсор-2 и приводит к развитию в комплексе g3dd’ обратных конформационных изменений, возращающих g3dd’ в исходную замкнутую конфигурацию. N-концевой сегмент BIE субъединицы d покидает поверхность b-кольца, которое смыкается на ДНК (состояние “e”). Комплекс g3dd’ освобождается от погруженного зажима, а последующее освобождение АДФ возвращает его в исходное состояние “a”. Цикл погрузки b-кольца на этом заканчивается (состояние “e”). Погрузка b-кольца сопровождается гидролизом АТФ, энергия которого израсходовалась на регенерацию замкнутой формы погрузчика.

 

 

Рис. 1.20. Последовательные этапы погрузки b-кольца скользящего зажима ДНК-полимеразы III E. coli на праймированную ДНК

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

– Конец работы –

Эта тема принадлежит разделу:

Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев

На сайте allrefs.net читайте: Эукариотические ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы археев...

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Погрузчики скользящего зажима

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Биосинтез ДНК. Общие определения
  ДНК, служащая первичным носителем генетической информации, является линейным или кольцевым гетерополимером, состоящим из 4 дезоксирибонуклеотидов (dA, dT, dG и dC), соединенных (3’®

A. ДНК дНТФ
    5’

ДНК-полимераза II E.coli
  ДНК-полимераза II (PolII), кодируемая геном polB (dinA), является единственной из ДНК-полимераз E. coli, относящимся к полимерзному семейству В, в которое входят преимуществе

ДНК-полимераза III E. coli
  Главной репликативной ДНК-полимеразой E. coli является многосубъединичный комплекс ДНК-полимеразы III (PolIII). Самая большая каталитическая a-субъединица PolIII длиной 1160

ДНК-полимераза a
Эукариотические ДНК-полимеразы a (Pola) входят в состав состоящего из 4 субъединиц белкового комплекса, в котором две самые большие субъединицы определяют ДНК-полимеразную активность, а две малые с

Главные эукариотические ДНК-полимеразы
  ДНК-поли- мераза (типсемейство) Функции Мол. массы субъединиц в кД Гены (хромосомы) Функции субъединиц

ДНК-полимераза b
  ДНК-полимераза b (Polb) млекопитающих является самой маленькой из известных эукариотических ДНК-полимераз и относится к семейству Х, к которому принадлежит, например, и терминальная

ДНК-полимераза g
ДНК-полимераза g (Polg), кодируемая ядерными генами, является единственной эукариотической ДНК-полимеразой, участвующей в репликации митохондриальной ДНК (мтДНК), которая идет по непрерывному механ

ДНК-полимеразы d и e
Гетеромультимерные ДНК-полимеразы g и e (Polg и Pole) участвуют не только в репликации ДНК, но и в нуклеотидной эксцизионной репарации, эксцизионной репарации оснований, коррекции ошибочно спаренны

ДНК-полимеразы археев
  По ультраструктуре клеток представители третьего домена живых организмов археи (Archaea) похожи на бактерии и относятся к прокариотам. Их метаболические процессы в целом такж

Скользящие зажимы ДНК-полимераз и их погрузчики
  1.4.1. Скользящие зажимы – факторы процессивности ДНК-полимераз   Особый класс субъединиц холоферментов ДНК-полимераз образуют белки-зажим

Общая характеристика геликаз
Геликазами называются ферменты, способные расплетать две комплементарные нити дуплексов нуклеиновых кислот с использованием энергии, полученной при гидролизе 5’-НТФ. Геликазы могут расплетат

Свойства репликативной ДНК-геликазы DnaB E. coli
  ДНК-геликаза DnaB имеет длину 471 аминокислотный остаток (мол. масса 52,4 кД) и кодируется геном dnaB (92-ая мин генетической карты). Количество молекул белка DnaB на клетку

ДНК-геликаза репликативной вилки у эукариотов
  Общее число различных ДНК-геликаз даже у низших эукариотов гораздо больше чем у бактерий. Так, в геноме дрожжей S. cerevisiae около 200 открытых рамок считывания кодируют пре

Механизм действия гексамерных ДНК-геликаз
Рассмотрим рабочие модели нескольких последовательных этапов в каталитическом цикле репликативных гексамерных ДНК-геликаз. Эти модели основаны на экспериментальных данных, но во многих деталях оста

N I II C
Рис. 2.8. Схема организации белка DnaC E. coli. I – область взаимодействия с белком DnaB, II – мотивы связывания АТФ   Количество белка DnaС на клетк

Белки, связывающие однонитевую ДНК
  Однонитевые участки ДНК, появляющиеся в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК, могут быстро превращаться в нуклеопротеиновые комплексы, полностью покрываясь специальным

Праймазы
  Синтез затравок РНК в процессе образования фрагментов Оказаки при репликации ДНК (преимущественно в отстающей нити) катализируется праймазами – особой разновидностью ДНК-зави

RNAP Toprim
Рис. 2.18. Доменная организация праймазы DnaG E. coli. I – домен связывания с ДНК, II – центральный каталитический домен, III - линкерный домен, IV – домен взаимодействия с другими

ДНК-лигазы
  ДНК-лигазы катализируют образование фосфодиэфирной связи в однонитевом разрыве (ОР) днДНК между смежными 3’-гидроксильным и 5’-фосфатным концами разорванной нити. Для связыва

Свойства и функции ДНК-топоизмераз
Организм Фермент Ген Поло-жение гена* Длина белка (а.о.) Субъеди-ничная структура Подсе-мейство

Белок-инициатор DnaA
  Белок DnaA играет ключевую роль в инициации репликации хромосомы у многих бактерий. Он последовательно выполняет 3 главные функции: 1) узнает область начала репликации oriC, последо

Минимальная область начала репликации oriC y E.coli
  Область начала репликации (ОНР) oriC является уникальным местом инициации нормальной двунаправленной репликации хромосомы E. coli и расположена на 84-ой мин генетической карт

IHF R5(M)
         

Этапы инициации репликации на ОНР oriC
  Для инициации репликации в ОНР oriC необходимо, чтобы матрица ДНК находилась в сверхскрученной кольцевой форме. Первой стадией инициации является образование начального “преиницииру

Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli
  Контроль инициации репликации хромосомы в области oriC имеет два аспекта. Прежде всего, репликация инициируется в фиксированный момент клеточного цикла, через интервалы, равные врем

Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)
У S. cerevisiae были идентифицированы специфические элементы хромосомной ДНК, названные автономно реплицирующимися последовательностями ARS (autonomously replicating sequences). Встраивание

Этапы пути инициации репликации на ОНР у дрожжей
В конце митоза или в начале фазы G1 клеточного цикла нуклеопротеиновые комплексы ORC-ARS вербуют на ДНК белок Cdc6 c мол. массой 58 кД. Этот белок очень нестабилен и должен синтезировать

Инициация репликации у высших эукариотов
  3.3.1. Белковые компоненты и путь инициации репликации   Гомологи большинства белков S. cerevisiae, участвующих в описанном выше пу

А. В. С.
Рис. 3.10. Электрофоретические картины радиоавтографов рестрикционных фрагментов реплициру

Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках
  В эукариотических клетках существует главный регуляторный механизм, делающий инициацию репликации на каждой ОНР возможной один и только один раз за клеточный цикл. Он назван лице

Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • Популярное
  • Облако тегов
  • Здесь
  • Временно
  • Пусто
Теги