Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

В эукариотических клетках существует главный регуляторный механизм, делающий инициацию репликации на каждой ОНР возможной один и только один раз за клеточный цикл. Он назван лицензированием. Каждая ОНР в фазах M/G₁ получает лицензию на однократную репликацию, и клетка обязательно должна пройти митоз, чтобы получить такую лицензию повторно. Механизм лицензирования критически зависит от погрузки в позднем митозе или в фазе G₁ комплекса белков МСМ на ОНР, т.е. от образования предрепликативного комплекса.

Повторная сборка такого комплекса до завершения митоза запрещается несколькими механизмами, в которых важную роль играют протеинкиназы, существенные как раз для прохождения фазы митоза. Ими являются комплекс киназы Cdc28 с циклинами типа В у дрожжей и комплекс киназы Cdk2 с циклинами типов А и Е у высших эукариотов. В клеточном цикле высших эукариотов нестабилен даже комплекс ORC, специфически метящий ОНР. Он дестабилизируется в фазе митоза и повторно образуется только в ранней фазе G₁. Более универсальным является освобождение из комплекса с ORC на ОНР белка Cdc6 (погрузчика белков МСМ), которое происходит в фазы S ещё до начала синтеза ДНК. Свободный белок Cdc6 в фосфорилированной протеинкиназами форме подвергается разушению при участии протеасом у дрожжей, а у высших эукариотов транслоцируется из ядра в цитопазму, где и остается до завершения митоза. Поэтому повторная погрузка комплекса МСМ в фазе S становится невозможной. Однако фосфорилирования Cdc6 недостаточно для строгого контроля инициации репликации: гиперпродукция мутанта белка Cdc6 дрожжей, у которого устранены известные сайты фосфорилирования, не вызывает повторной инициации в том же клеточном цикле. Во время фазы S сами белки МСМ в результате фосфорилирования киназой Cdc7-Dbf4 постепенно освобождаются из хроматина и выходят в цитоплазму у дрожжей. У высших эукариотов освобожденные из репликативного комплекса белки МСМ остаются в ядре во время фазы S. Поэтому для предотвращения реинициации требуется дополнительный механизм, состоящий в исчезновении в фазе S лицензирующего фактора RLF-B. Вновь синтезированный белок RFL-B может войти в ядро только после митоза, во время которого ядерная оболочка становится проницаемой для цитоплазматических белков. Таким образом, по меньшей мере 4 механизма используются эукариотическими клетками для предотвращения повторной сборки предрепликативных комплексов до завершения митоза.

Однократное использование ОНР за клеточный цикл вовсе не означает, что инициация синтеза ДНК на всех ОНР в эукариотической клетке происходит одновременно. Уже давно было установлено, что разные области эукариотических хромосом реплицируются в разные характеристические моменты в фазе S. Одни ОНР активируются для инициации рано, а другие поздно. Рано и поздно запускаемые (early and late firing) ОНР сгруппированы в разных кластерах, которые реплицируются в определенные интервалы времени. Временной порядок запуска ОНР остается в целом инвариантным во время последовательных генераций. Рано реплицирующиеся области хроматина цитологически соответствуют R-полосам, содержащим транскрипционно активные гены домашнего хозяства. Напротив, тканеспецифические гены, не экспрессируемые в данной ткани, присутствуют в поздно реплицирующихся G-полосах. Если же в этой ткани такие гены экспрессируются, то они реплицируются рано. Таким образом, рано реплицирующиеся гены находятся в эухроматине, а поздно реплицирующиеся гены – в гетерохроматине. К поздно реплицирующимся сегментам хроматина относятся также области теломер и центромер, транскрипционно инактивированные Х-хромосомы самок и молчащие копии импринтированных генов.

В определении временного порядка запуска ОНР важную роль играет структура хроматина. Об этом свидетельствуют данные, полученные при искусственном перемещении ОНР ARS в хромосомах дрожжей. Установлено, что при переносе поздно запускаемой ОНР из прителомерной области хромосомы в эухроматиновую область эта ОНР начинает реплицироваться рано. Таким образом, не первичная последовательность ДНК ОНР, а структура хроматина определяет расписание использования ОНР для инициации репликации, хотя известны исключения из этого обшего правила.

Изучение кинетики сборки предрепликативных комплексах на ОНР разного типа у дрожжей in vivo показало, что вербовка комплексов МСМ происходит одновременно на ранних и поздних ОНР. Однако последующие этапы связывания белка Cdc45 и погрузки RPA и ДНК-полимераз наблюдаются во время перехода G₁®S на рано запускаемых ОНР и значительно отсрочены на поздно запускаемых ОНР. Это позволяет предположить, что решающую роль в расписании репликации во время фазы S играет связывание с лицензированными ОНР белка Cdc45, зависящее от его фосфорилирования. В выяснении механизма этого эффекта важную роль сыграли мутанты дрожжей, дефектные по циклинам Clb5 и/или Clb6. Отсутствие одного Clb6 не повлияло на активацию ОНР. Однако у мутантов Clb5 поздно запускаемые ОНР не инициируют репликацию, и контролируемые ими области хромосомы пассивно реплицируются из отдаленных ранних ОНР. Высказано предположение, что Clb6 участвует только в активации ранних ОНР, а Clb5 требуется для координированного во времени запуска ранних и поздних ОНР. Возможно, специфическое фосфорилирование комплексом Cdc28-Cdc5 необходимо для ассоциации Cdc45 и образования предрепликативных комплексов на поздних ОНР.

Однако циклин-зависимые протеинкиназы клеточного цикла не являются единственными факторами, определяющими раннее и позднее использование ОНР у дрожжей. Существенной является и протеинкиназа Rad53 – плеотропный регулятор контрольных точек повреждения ДНК и репликации ДНК в фазах G₁ и S. Мутации в гене RAD53 не только делают клетки более чувствительными к повреждениям ДНК, но и изменяют расписание инициации репликации. Так, у некоторых мутантов rad53 поздние ОНР начинают активироваться более рано в фазе S. Следует отметить, что белок Rad53 физически взаимодействует с Dbf4 и может регулировать активность протеинкиназы Cdc7-Dbf4.

Различная кинетика использования ОНР в одной и той же клетке и возможность обойтись без поздних ОНР за счет активности ранних ОНР помогают понять ещё один аспект регуляции инициации ДНК, характерный для многоклеточных эукариотов. Продолжительность фазы S на разных стадиях развития животных не одинакова: она составляет от нескольких минут в быстро делящихся клетках эмбрионов (на стадии дробления) до нескольких часов в тканях взрослых организмов того же вида. С другой стороны, скорость репликации ДНК в обоих случаях примерно одинакова. Отсюда вытекает логический вывод: для обеспечения репликации генома на разных стадиях развития высшие эукариоты могут использовать разное число потенциальных ОНР, содержащихся в геноме. Для быстрой пролиферации эмбриональных клеток требуется активировать все ОНР, а для медленного роста клеток взрослых тканей можно ограничиться использованием более узкого их подмножества.