Мутаційна мінливість

Мутації можуть виникати в природі вільно і викликатися спеціальними діями. Чинники, що викликають утворення мутацій, називаються мутагенами. В штучних умовах для отримання мутацій використовуються іонізуючі випромінювання і дія хімічними речовинами.

Розрізняють генні, хромосомні і геномні мутації.

Генні мутації є результатом втрати групи атомів або зміни розташування цієї групи атомів: цитологічно вони не виявляються.

Хромосомні мутації – це хромосомні перебудови: дуплікації, делеції, інверсії, транслокації. При їх виникненні цитологічно виявляються мости, фрагменти, кільця.

Геномні мутації пов'язані із зміною числа хромосом, вони можуть бути 3 типів:

1) автополіплоїди – поліплоїди, що виникають за рахунок кратного збільшення геному одного виду;

2) анеуплоїди – зміна числа хромосом некратно гаплоїдному набору;

3) алополіплоїди – виникають на основі множення геномів різних видів.

Хід роботи

3.2.1 Отримання та аналіз хромосомних мутантів

Хромосомні перебудови вивчають в анафазі або метафазі мітозу. Метафазний метод є більш точним, але він вимагає більше часу, потребує доброго знання морфології хромосом досліджуваного об‘єкту та високої кваліфікації дослідника, тому частіше застосовують більш простий анафазний метод.

Виготовити тимчасові давлені препарати з корінців проростків, насіння яких піддавали дії опроміненню або дії хімічних мутагенів. На отриманих тимчасових препаратах, пофарбованих ацетокарміном, знаходять хромосомні перебудови в клітинах, що знаходяться на стадіях анафази та телофази. Підраховують клітин з нормальними анафазами і телофазами та кількість клітин з перебудовами, класифікуючи кожну. При цьому кількість аналізуємих клітин повинна бути не меншою, ніж 500, тому обирають декілька найбільш вдалих полей зору. Крім того, для достовірності результату кожна група студентів повинна проаналізувати не менше 5 -10 препаратів.

При аналізі анафаз і телофаз враховуються лише ті клітини, в яких відстань між анафаз ними (телофазними) групами не менша за ширину однієї анафазної (телофазної) групи. Телофазі клітини, в яких спостерігається формування фрагмопласту, не враховуються. Аналіз перебудов не проводиться при накладеннях і при порушенні цілісності клітинної оболонки.

Клітини з абераціями розбиваються по типам:

1) клітини з одинарними фрагментами ();

2) з парними фрагментами (═);

3) з одинарними хромотидними мостами ([ );

4) з хромосомними подвійними мостами.(}{).

Мости позначають з фрагментами та без і відносять до різних типів ([, [, }{, }{, }{═). Якщо в клітині є декілька типів порушень, наприклад, хромосомний міст з парним фрагментом плюс ще одинарний фрагмент, то таку клітини відносять до клітин з хромосомними мостами і парними фрагментами (}{═), а фрагмент другої аберації враховується при підрахунку загальної кількості аберацій. Клітини, в яких не вдається визначити тип аберації, відносять до класу клітин з невизначеними абераціями.

За результатами заповнюють табл. 6.8.

 

Таблиця 6.8 Протокол ана- телофазного аналізу

 

№ п/п	Кількість клітин
Нормальні анафази та телофази	З одинарними фрагментами	З подвійними фрагментами	З мостами	З невизначеними абераціями
хроматидними	хромосомними
[	[	[ ═	}{	}{	}{═
Разом

 

Після аналізу препарату проводиться підрахунок загальної кількості проглянутих клітин та визначається:

 

1) Мітотичний індекс за формулою:

 

(‰), де

 

П – кількість клітин, що знаходяться у стадії профази;

М - кількість клітин, що знаходяться у стадії метафази;

А - кількість клітин, що знаходяться у стадії анафази;

Т - кількість клітин, що знаходяться у стадії телофази;

N – загальна кількість проаналізованих клітин.

 

2) Відсоток клітин з абераціями (ЧАА) за формулою:

 

, де

 

Аа – кількість клітини з абераціями;

N – загальна кількість проаналізованих анафаз та телофаз.

 

3) Відсоток аберацій (ЧА) за формулою:

 

, де

 

А – кількість клітини з абераціями;

N – загальна кількість проаналізованих анафаз та телофаз.

 

4) Помилка репрезентативності (mч) за формулою:

 

, де

 

Ч – ЧАА, ЧА або МІ;

N – загальна кількість проаналізованих клітин.

 

Після аналізу всіх досліджуваних препаратів дані заносять у зведену таблицю (табл. 6.9).

 

Таблиця 6.9 Частота хромосомних аберацій у клітинах корінців.

 

№ препарату	МІ ± mМІ (‰)	ЧАА ± mЧАА (%)	ЧА ± mЧА (%)	Значущі відміни від контролю (t) за
МІ	ЧАА	ЧА
контрольний

 

Контрольний препарат виготовляється з корінців, що не піддавалися дії мутагену і вказується викладачем. Для визначення значущості відмін від контролю обчислюють критерій Ст‘юдента (t) за формулою:

 

, де

 

Ч_к та Ч_д – різниця ЧАА або ЧА між контрольним та дослідним варіантах відповідно;

m_к та m_д - різниця помилок репрезентативності ЧАА або ЧА між контрольним та дослідним варіантах відповідно.

 

Якщо t 1,96 (р = 0,05), то можна говорити про значущість відмін між контрольним та дослідним варіантами.

 

Завдання 6: Сформулювати висновки щодо впливу мутагену на хромосомні аберації у даній культурі рослин на основі отриманих результатів (табл. 6.8 та 6.9).

 

3.2.2 Отримання та аналіз геномних мутантів (автополіплоїдів).

За деяких умов у процесі мітозу не утворюється веретено поділу і хромосоми в результаті цього подвоюються, а не відходять до різних полюсів. Таким чином утворюються клітини, у хромосомному наборі хромосом у 2, 4 і т.п. більше хромосом у порівнянні з хромосомним набором вихідних клітин, тобто утворюються автополіплоїди.

Утворення автополіплоїдів можна викликати штучно – дією деяких хімічних речовин. Такою хімічною речовиною є алкалоїд колхіцин, який порушує утворення веретену поділу. Тому при обробленні верхівки проростків розчином колхіцину утворюються тетраплоїди.

У чашці Петрі на фільтрувальному папері проростити на протязі 2-3 днів насіння злакових або бобових.

Коли колеоптилі або верхівка досягають 2-4 мм довжини, проростки поміщають у 0,25 % розчин колхіцину. З цією метою у чисту чашку Петрі, що має діаметр на 1-2 см менший за фільтрувальний папір, на якому пророщувалось насіння, наливають туди раствор колхіцину.

Папір з проростками виймають з чашки Петрі й перевертають таким чином, щоб верхівки проростків опинилися у розчині колхіцину, а коріння, що прикрите фільтрувальним папіром, – зверху.

Через 30 хвилин проростки виймають з розчину колхіцину, промивають дистильованою водою та висаджують у судину з грунтом

Через 14 днів відбирають тетраплоїдні рослини. Вони відрізняються товстим м‘ясистим листям, неправильними зкривленими пагонами.

Підрахувати кількість тетраплоїдних рослин серед інших диплоїдних, підрахувати число хромосом та плоїдність у відібраних (тетраплоїдних) на тимчасових давлених препаратах, пофарбованих ацетокарміном (див. попередню роботу).

 

Завдання 7: Підрахувати кількість хромосому даного об‘єкту: у тетраплоїдних та диплоїдних рослин.