ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Генная инженерия — раздел биотехнологии, связанный с целена­правленным конструированием in vitro новых комбинаций генетичес­кого материала, способного размножаться в клетке и синтезиро­вать определенный продукт.

Генная инженерия решает следующие задачи:

1) получение генов путем их синтеза или выделения из кле­ток;

2) получение рекомбинантных молекул ДНК;

3) клонирование генов или генетических структур;

4) введение в клетку генов или генетических структур и син­тез чужеродного белка.

Получение генов.Известны два способа искусственного син­теза генов вне организма — химический и ферментативный. Хи­мическим путем в 1969 г. американский ученый Г. Корана с сотр. синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была уже ранее расшифрована. Ученые сначала синтезировали фраг­менты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Однако ген аланиновой тРНК при введении в клетку кишечной палочки или бесклеточную среду не функцио­нировал. Оказалось, что он не имел регуляторных элементов — промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терми­нальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК. В 1976 г. Г. Корана с сотр. осуществили синтез гена супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нук­леотидов. Были также синтезированы примыкающие к гену регу-ляторные участки: промотор (52 пары нуклеотидов) и термина­тор (21 пара нуклеотидов) и прикрепленные к концам полимера тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген, встроенный в геном мутантного фага Т4, при введении в живую кишечную палочку оказался работоспо­собным. В 1979 г. в нашей стране под руководством Ю. А. Ов­чинникова и М. Н. Колосова химическим путем с помощью ферментов были синтезированы гены гормонов человека и жи­вотных — энкефалина и брадикинина.

Химико-ферментативный синтез довольно широко применя­ют в генной инженерии для получения мелких генов. Для полу­чения генов животных, растений и человека, размер которых составляет 1000—3000 нуклеотидов, этот метод слишком сложен и пока неосуществим. Ученые нашли более простой способ по­лучения таких генов.

В 1970 г. Г. Темин с сотр. обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некото­рые онкогенные вирусы при помощи обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы иРНК. Дальнейшие исследования показали, что матрицами для образо­вания копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и другие иРНК. Это открывало принципиальные возможности ферментативного синтеза любых индивидуальных генов (ДНК), используя их РНК-копии. Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементар­ной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. Система для синтеза представляет собой раствор, в котором содержатся все четыре нуклеотида, входящих в состав ДНК, ионы магния* фермент обратная транскриптаза (ее получают из онкогенных вирусов) и матричная (информационная) РНК, кодированная геном, копию которого ставится задача снять. На иРНК обрат­ная транскриптаза синтезирует комплементарную ей цепь ДНК, а затем на ней при помощи этого же фермента синтезируется вторая цепь ДНК. В результате получается ген по структуре такой же, как и тот, на котором была синтезирована иРНК. Этим способом в лабораториях многих стран создан целый

ряд генов. В нашей стране под руководством В. А. Энгельгардта был разработан проект «Ревертаза» — программа синтеза генов с помощью этого фермента. В осуществлении проекта участвовали ведущие отечественные и зарубежные институты. В итоге с 1974 по 1978 г. были синтезированы гены глобина голубя, кролика и человека, а также гены митохондрий печени крыс, часть гена, кодирующего иммунные белки мышей, и др.

Гены, синтезированные при помощи обратной транскрипта­зы, не имеют регуляторных участков и функционально неактив­ны. Поэтому транскрибирование копий ДНК рекомендуется проводить с про-мРНК, которые имеют все необходимые копии регуляторных частей гена.

Кроме изложенных способов ген можно получить путем выде­ления с помощью трансдуцирующих фагов. Таким путем в 1969 г. был впервые выделен лактозный ген кишечной палочки. Однако такой способ получения генов не всегда пригоден, так как предусматривает строгие места локализации фагов. Поэтому используются и другие приемы выделения фрагментов ДНК с нужными для переноса генами.

Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы).Важным собы­тием для развития генной инженерии было открытие в клетках бактерий ферментов, способных разрезать молекулу ДНК в стро­го определенных местах. Ферменты эти называются рестрикти-рующими эндонуклеазами или рестриктазами, а процесс «разреза­ния» молекулы ДНК называется рестрикцией. С рестриктазами связаны дальнейшие успехи в молекулярной биологии. Они стали одним из главных элементов генной инженерии. Участок ДНК, узнаваемый определенной рестриктазой, включает специ­фическую последовательность из 6—8 пар оснований, являющих­ся палиндромом. Палиндромом называется последовательность ДНК, которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная от З'-конца каждой цепи. Например, рестриктаза E.coli под названием EcoRI узнает последовательность

------П ААТТ Ц------

------Ц ТТАА t Г------

и, прикрепляясь к ней, делает по одному однонитевому надрезу с обеих сторон, т. е. разрезает ее в симметричных участках, указанных стрелками. В результате двухцепочная молекула ДНК, если была кольцевой, вследствие разрыва приобретает линейное строение. На краях молекулы образуются липкие концы, представленные однонитевыми участками из четырех нуклеоти­дов: на одном конце будет последовательность ААТТ, на дру­гом — ТТАА. При наличии липких концов молекула ДНК из линейной формы вновь способна замкнуться в кольцо без до­полнительной обработки. Были обнаружены рестриктазы, узнаю­щие самые разнообразные последовательности нуклеотидов. На­пример, рестриктаза EcoRII узнает последовательность ЦЦТГГ. К настоящему времени известно свыше 200 рестриктаз, харак­терных для разных видов микроорганизмов. Это открывает новые возможности для экспериментаторов. Огромные молекулы выс­ших организмов включают большое число мест разрезания для ферментов рестрикции. При обработке ДНК рестриктазами обра­зуются многочисленные фрагменты ДНК, в которых представле­ны отдельные гены. Затем гены можно соединять в определенные структуры. Остающиеся в такой структуре разрывы нитей ДНК воссоединяются лигазой. Имеется и другой способ получения фрагментов ДНК с липкими концами. Он состоит в том, что выделенные или искусственно синтезированные участки ДНК об­рабатывают эндонуклеазой, укорачивающей участки ДНК с обоих концов, после чего при помощи фермента полинуклеотидтран-сферазы пристраивают к этим концам последовательности адени-ловых и тимидиловых нуклеотидов. Длина липких поли-А и поли-Т составляет 50—100 нуклеотидов. При встраивании гена в вектор используются оба рассмотренных метода и часто совместно.

Рекомбинантные ДНК.Рекомбинантная ДНК — это искусст­венно полученная молекула ДНК. Она имеет форму кольца, включает ген (гены), составляющий объект генетических манипу­ляций, и так называемый вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном. Векторами являются те компоненты рекомбинантных ДНК, которые способны акцепти­ровать чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетках хозяина. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь свойства репликона; 2) нести субстратные участки для рестриктаз, иначе невозможна встройка ДНК; 3) содержать один или несколько маркирующих генов, чтобы по фенотипу можно было определить факт его передачи. Исследования показали, что эффективными векторами являются плазмиды. Из них в качестве векторов используются Col El, pSC 101 и др. Из вирусов в каче­стве векторов используют фаги X, SV 40 и их производные. Векто­ры придают рекомбинантной молекуле способность воспроизво­диться независимо от хромосомы клетки бактерии.

Соединение вектора с фрагментом ДНК может производиться следующими путями: при помощи липких концов, образующихся в ДНК под действием эндонуклеаз рестрикции; дополнительного син­теза полинуклеотидных фрагментов каждой из цепей ДНК (поли-А и поли-Т); соединения тупых концов при помощи Т4-лигазы.

На рисунке 25 показаны ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду. Слева на иРНК при помощи обратной транскриптазы синтезируется цепь ДНК (кДНК), затем иРНК удаляют щелочью и при помощи ДНК-полимеразы достраивают вторую цепь кДНК, экзонуклеазой уко­рачивают обе цепи ДНК и концевой трансферазой пришивают к их концам поли-Т-последовательности. На этом же рисунке справа показано, что кольцевую ДНК векторной плазмиды раз­резают рестриктазой и превращают ее в линейную форму, затем экзонуклеазой цепи укорачивают и концевой трансферазой при­шивают к ним поли-А-последовательности. На последнем этапе соединяют оба типа молекул ДНК и получают гибридную моле­кулу — векторную плазмиду со встроенным в нее синтезирован­ным геном. Разрывы в цепях ДНК воссоединяют лигазой.

В данном случае было известно, какой ген включен в вектор­ную плазмиду. Но в работах по трансгенозу чаще имеют дело со многими фрагментами ДНК, и среди них только единичные включают ген, который подлежит переносу. Для получения фраг­ментов ДНК с определенным геном применяют так называемый способ дробового ружья, который заключается в том, что ДНК механически или ферментами дробится на множество мелких фрагментов, после чего их вслепую гибридизируют с молекулами ДНК вектора. Перед этим ДНК вектора обрабатывают рестрик­тазой для придания им линейной формы и образования липких концов. После введения рекомбинантных молекул в кишечную палочку при помощи селективных сред выделяют те бактерии, в которые попал фрагмент ДНК с нужным геном. Включенный ген обнаруживают по продукту его действия в виде определенно­го вещества (фермент, гормон и т. д.). Размножение в бактериях идентичных рекомбинантных ДНК называется клонированием.

каждый клон бактерий содержит свою рекомбинантную ДНК.

Разрабатываются методы, позволяющие производить замены

нуклеотидов в ДНК клонированного гена и тем самым изменять

свойства кодируемого этим геном белка.

Введение в клетку рекомбинантных молекул и синтез чужерод­ного белка.Чаще всего рекомбинантные молекулы вводятся в клетки бактерий методом трансформации. Сначала клетки бакте­рий с целью повышения их способности поглощать плазмидную ДНК обрабатывают хлористым кальцием или хлористым барием. После этого в клеточную взвесь вводят раствор с рекомбинантны-ми молекулами. Некоторые из этих молекул проникают внутрь клетки, и часть из них, прикрепясь к мембранам клетки, начинает размножаться и функционировать (рис. 26). Одно из наиболее важных для практики направлений генной инженерии — конструирование микроорганизмов-продуцентов нужных веществ. Первыми в этом направлении были исследова­ния К. Итакуры и Г. Боейра с соавт. (1977). Им удалось добить­ся экспрессии гена, кодирующего гормон соматостатин в клетках кишечной палочки (рис. 27). Затем в разных странах клетки кишечной палочки использовались для синтеза ряда белков и гормонов человека и животных: инсулина, интерферонов, гормо­на роста, урокиназы, кальцитонина, альбумина, тимозина и др. В лабораториях А. А. Баева, Ю. А. Овчинникова, М. Н. Колосова, Е. Д. Свердлова и др. осуществлена экспрессия генов, кодирую­щих энкефалин, лейкоцитарный интерферон, брадикинин, сома-тотропин и др.

В последние годы уделяется много внимания созданию генно-инженерных вакцин. Получают антигены из рекомбинантных микроорганизмов или культур клеток, в которые введен опреде­ленный ген возбудителя болезни. Этим методом получен матери­ал для вакцинации против гепатита В, гриппа А, малярии, ящура, бешенства, паравируса свиней и др. В нашей стране произведена обратная транскрипция РНК вируса гепатита А. ДНК, кодирующая вирусный белок гепатита, была пришита к ДНК вируса оспы. В результате ослабленная культура оспы вы­зывает иммунитет против опасной болезни >— гепатита. Вакцина проходит производственное испытание.

Штаммы бактерий, продуцирующие вещества, активные в ор­ганизме человека и животных, могут быть использованы для промышленного производства лекарственных препаратов.

В нашей стране ведутся работы по получению методами ген­ной инженерии суперпродуцентов продуктов, свойственных клеткам, таких, как аминокислоты, витамины, ферменты, а также по созданию культур, активно разлагающих нефть, пласт­массы, разрушающих нафталин, фиксирующих азот, и т. д.