Индукция хромосомных мутаций (делеций, инверсий).

Изменчивость, её виды. Генетические рекомбинации, их виды, роль плазмид. Изменчивость микробов и её роль в диагностике, терапии и профилактики инфекционных заболеваний. Изменчивость – свойство живых организмов приобретать изменения в генах или их проявлении. Различают следующие виды изменчивости: 1. Наследственная (определяется генотипом, передаётся следующим поколениям). 1.1 Мутационная. 1.1.1 Генные мутации. 1.1.2 Хромосомные мутации. 1.2 Комбинативная. 2. Ненаследственная или модификационная. 3. RS – диссоциация. Мутационная изменчивость. Мутация – прерывное скачкообразное изменение гена. Мутации представляют собой изменения в первичной структуре, которые выражаются в утрате или изменении какого-либо признака. Классификация мутаций. 1. По уровню возникновения 1.1 Генные (нескорректированные изменения химической структуры генов, воспроизводимые в последующих поколениях в виде новых признаков) 1.1.1 Мутации, связанные с заменой азотистых оснований (изменяется триплет, а, следовательно, и аминокислота в белке) 1.1.2 Мутации с изменением рамки считывания (выпадение или добавление азотистых оснований) 1.1.3 Мутации по типу инверсии внутри гена. 1.2 Хромосомные (нарушения целостности хромосомы, сопровождающиеся изменением её структуры) мутации. 1.2.1 Делеции (выпадение участка хромосомы) 1.2.2 Дупликации (удвоение участка) 1.2.3 Инверсии (поворот участка на 180⁰) 1.2.4 Транслокации (отрыв фрагмента и встраивание его в другой участок) 2. По происхождению. 2.1 Спонтанные мутации (появляются внезапно под влиянием различных причин, например, ошибок ДНК-полимеразы, встраивании в ДНК транспозонов, плазмид, Is-последовательностей). 2.2 Индуцированные мутации (в эксперименте под действием каких-либо мутагенов). 3. По фенотипическим последствиям. 3.1 Нейтральные (фенотипически не проявляются какими-либо изменениями). 3.2 Условно-летальные (приводят к изменению функциональной активности, но не к утрате фермента). 3.3 Летальные (приводят к утрате жизненно важных ферментов). Клеточный геном обладает системами, восстанавливающими повреждения генетического материала. Эти системы называют репарационными. Различают дорепликационную и пострепликационную репарацию. Комбинативная изменчивость (генетические рекомбинации). Комбинативная изменчивость заключается в передаче генов от одних бактерий другим с помощью механизмов трансформации, трансдукции и конъюгации. Трансформация заключается в непосредственной передаче генетического материала донора реципиентной клетке. С донорной ДНК реципиентной клетке передаётся только один ген. Клетки, способные воспринимать донорную ДНК, называются компетентными. Трансдукция – передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов. Различают неспецифическую (вместе с фаговой ДНК могут быть принесены любые гены донора), специфическую (характеризуется способностью фага переносить определённые гены донора), и абортивную (гены ДНК донора не страиваются в ДНК реципиента, остаются в цитоплазме и функционируют в таком состоянии). Конъюгации – перенос генетического материала от клетки-донора в клетку реципиента при их скрещивании. Донорами генетического материала могут быть бактерии, несущие F-плазмиду (половой фактор). Модификационная изменчивость. Модификационная изменчивость - различные варианты проявления генотипа в зависимости от условий внешней среды. Модификации можно рассматривать как адаптивные реакции к изменяющимся условиям среды. Модификации могут подвергаться реверсии к первоначальному фенотипу после устранения действия фактора. Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих генов. Модификации могут возникать под действием антибиотиков. RS – диссоциация. RS – диссоциации представляют собой своеобразную форму изменчивости. Она возникает спонтанно и характеризуется образованием двух типов клеток, которые отличаются друг от друга по свойствам и характеру колоний на плотной среде. Процесс диссоциации протекает иногда через образование промежуточных слизистых колоний. В процессе диссоциации меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды. Мутации, которые приводят к RS – диссоциации называются инсертационными.

Признак	S – форма	R – формы
Колонии	Гладкие, выпуклые	Шероховатые, плоские
Капсула	Выражена	Утрачивается
Суспензия клеток	Устойчива	Клетки агглютинируют
ЛПС	Полноценный	Утрачены боковые цепи
Свойства	Полноценные	Возможно снижение вирулентности, фермен-тативной активности, утрата подвижности
Устойчивость

Генная инженерия.

Генная инженерия – наука, целью которой является получение с помощью лабораторных приёмов организмов с новыми (даже не встречающимися в природе) комбинациями наследственных свойств.

В основе генной инженерии лежат ряд приёмов, позволяющих манипулировать с фрагментами нуклеиновых кислот. Молекулы ДНК синтезируются с т-РНК или м-РНК (легче выделить из клетки) с помощью химического синтеза или применения РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Однако, использование в качестве матрицы РНК позволяет синтезировать только структурные гены, и не позволяет синтезировать регуляторные. Для выделения любых генов (в том числе и регуляторных) из нуклеосомы бактериальной клетки используют плазмиды, которые встраиваются в геном клетки, а под действием определенных факторов (например, УФ-излучение) вновь переходят в цитоплазму, «захватив» с собой ряд генов бактериальной клетки. С помощью плазмид осуществляется и встраивание рекомбинированных in vitro генов в геном бактериальной клетки. Для рекомбинации широко используются эндонуклеазы рестрикции – ферменты, способные разрезать молекулу ДНК в строго определённом месте.

Химиотерапия. Группы химиотерапевтических препаратов. Химиотерапия – лечение инфекционных, инвазионных заболеваний, а также злокачественных новообразований с помощью лекарственных средств (химиотерапевтических препаратов), подавляющих рост или размножение клеток возбудителя или перерождённых клеток. К химиотерапии не относится лечение инфекционных заболеваний с помощью средств, опосредованно действующих на микробную клетку, например, вакцин, анатоксинов, сывороток и т.д. Задачи химиотерапии. 1. Изыскание и получение химиотерапевтических препаратов. 2. Изучение спектра, механизма и условий действия препаратов. 3. Разработка методов применения химиотерапевтических средств. 4. Получение химиотерапевтических препаратов, действующих на определённых возбудителей. 5. Разработка методов выделения возбудителя и определения его таксонометрической принадлежности. Антибиотики. Классификация антибиотиков. Антибиотики – вещества природного происхождения или полученные синтетическим путём, обладающие выраженной биологической активностью против вирусов, бактерий и других микроорганизмов. Каждый антибиотик обладает специфическим избирательным действием на определённые виды микробов. Биологическую активность антибиотика определяют в у.е., содержащихся в 1 мл раствора (единица действия в мл химически чистого продукта). За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост некоторого количества клеток стандартного штамма в единице объема питательной среды. Характеристики антибиотиков: 1. Незаменимые лекарства. 2. Профилактические средства. 3. Применяются как в медицине, так и в сельском хозяйстве, и в микробиологии. 4. Применяются в качестве консервантов. Требования, предъявляемые к антибиотикам: 1. Действие в низкой концентрации. 2. Активность антибиотика не должна снижаться под действием жидкостей организма. 3. Действие в короткий срок. 4. Отсутствие аллергического и токсического действия на макроорганизм. 5. Антибиотик не должен препятствовать выздоровлению. 6. Антибиотик не должен снижать иммунологические реакции. Классификации антибиотиков. 1. Противобактериальные препараты. 2. Противогрибковые препараты. 3. Противовирусные препараты. 4. Противоопухолевые препараты. Механизм действия антибиотиков. Действие разных антибиотиков различно – от бактериостатического до бактерицидного и бактериолитического. Под механизмом действия антибиотика понимают те нарушения обмена веществ микроорганизмов, которые приводят к остановке развития или гибели микроорганизма. Точками приложения действия антибиотика служат различные процессы в микробной и вирусной клетке. Механизмы действия: 1. Подавление синтеза клеточной стенки (β – лактамные антибиотики). 2. Подавление синтеза белка на уровне 70S рибосом (стрептомицины препятствуют сборке рибосом, эритромицины – реакции транслокации, пуромицин, соединяясь с растущей ППЦ, способствует её преждевременному отделению от рибосомы). 3. Нарушение функций мембран (дезорганизация мембран, ингибирование связывания мембран с ферментами, нарушение проницаемости мембран для ионов, нарушение транспорта жизненно важных веществ через мембрану). 4. Ингибирование синтеза пуринов и пиримидинов. 5. Ингибирование процессов дыхания. 6. Ингибирование окислительного фосфорилирования. 7. Ингибирование обмена веществ антибиотиками – псевдосубстратами. Лекарственная устойчивость микробов. Механизмы формирования, роль плазмид. Существует два основных вида антибиотикорезистентности: естественная и приобретенная. Естественная устойчивость некоторых микробов к определённым антибиотикам является видовым признаком, т.е. присуща всем представителям данного вида и передаётся по наследству. Наследственная устойчивость чаще всего связана с плохой проницаемостью клеточной стенки и ЦМ для антибиотика. Приобретенная устойчивость к антибиотикам возникает у отдельных представителей данного вида и, чаще всего, связана с мутациями в тех или иных генах. Механизмы формирования антибиотикорезистентности. 1. Изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика. 2. Разрушение молекулы антибиотика. 3. Изменение структуры антибиотика под действием различных микробных ферментов. 4. Изменение структуры мишеней для антибиотиков. 5. Формирование «обходного» пути синтеза вещества, разрушаемого антибиотиком. 6. Формирование механизма активного выведения антибиотика из организма. Важнейшая роль в развитии устойчивости к антибиотикам принадлежит не столько собственно мутациям в классическом их понимании, сколько генетическим рекомбинациям, и, в частности, передаче генов от одних микроорганизмов другим через R-плазмиды. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам. Чувствительными к антибиотикам или другим химиопрепаратам считаются те бактерии, на которые препарат в определённой концентрации оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. Способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. 1. Метод стандартных дисков. Этот метод заключается в использовании 20 стандартных картонных дисков, на которые нанесены различные антибиотики в определённой терапевтической концентрации. Диски с различными антибиотиками отличаются по цвету и букве-коду. Для опыта на питательную среду равномерно засевают исследуемую культуру и помещают диски (не более 6 на одну среду). Культуру инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 37⁰ С. Результаты оценивают по диаметру зон задержки роста. 2. Метод количественной оценки минимальной концентрации антибиотика, подавляющей рост бактерий. В ряд сред, содержащих возбудителя, добавляют антибиотик в определённых разведениях. Культуры инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 37⁰ С. Результаты оценивают по минимальной концентрации антибиотика, при которой произошло подавление роста исследуемого штамма. 3. Метод металлических цилиндров. На поверхности двуслойного агара (второй слой содержит исследуемую культуру) располагают металлические цилиндры, содержащие стандартные растворы антибиотиков. Культуру инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 37⁰ С. Результаты оценивают по диаметру зон задержки роста. 4. Метод лунок на плотных средах. На плотной среде делают ряд лунок диаметром 8 мм. В одни лунки вносят антибиотик, в другие – исследуемую культуру. Культуру инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 37⁰ С. Результаты оценивают по диаметру зон задержки роста. 5. Калориметрия и спектрофотометрия. В культуру, содержащую возбудителя, вносят антибиотики. Результат оценивают с помощью колориметра ли спектрофотометра по образуемым цветным продуктам реакции или по исчезновению полосок света. 6. Диффузный метод. Основан на способности антибиотика и возбудителя диффундировать в агар-агар. 7. Биологический метод. Группу лабораторных животных, чувствительных к данным микробам, заражают микроорганизмами в чистом виде, а также в смеси с различными антибиотиками в определенной концентрации. Если микроорганизм чувствителен к данному антибиотику, то антибиотик задержит рост или даже убьёт микроб, лабораторное животное не погибнет.