УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ПО «МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ»

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской федерации

( ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России)

Кафедра микробиологии

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС

ПО «МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ» ДЛЯ СТУДЕНТОВ ЛЕЧЕБНОГО И ПЕДИАТРИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТОВ

Дисциплинарный модуль 1

(Общий курс)

 

 

Студента (ки)________________________________________________________

Группа №__________________________________________________________

Преподаватель______________________________________________________

 

Принятые сокращения и условные обозначения

Ат - антитело БАК - бактерицидная активность кожи БАСК - бактерицидная активность сыворотки крови

ЗАНЯТИЕ 1.1.1

Правила организации и оборудования микробиологической лаборатории (техника безопасности). Морфология эукариотов (грибы)

Цель занятия: 1. Ознакомиться с принципами организации и оборудования бактериологической… 2. Ознакомиться с основными методами микроскопии.

Теоретическая справка

Структура бактериологической лаборатории

Микроорганизмы по степени опасности заражения работающих с ними лиц подраз­деляют на 4 групп I. Возбудитель чумы. П. Возбудители холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, сапа, Ку-лихорадки, бластомикоза, кокцидиоидоза,…

Оборудование рабочего места бактериолога

· микроскоп · иммерсионное масло · бактериологические петли

В случае воспламенения спирта огонь тушить асбестовой тканью, полотенцем.

• -подготовить кабинет к работе - проверить состояния рабочих мест и дефекты уборки, проветрить помещение; • - пробирки и чашки, засеянные культурой микроорганизмов, зарегистрировать в… • - по окончании занятия: проверить состояния микроскопов, рабочих мест и дефекты уборки, выключить свет.

Морфологические особенности грибов

1. Важнейшие морфологические особенности грибов… 2. Гриб адаптируется к неблагоприятным условиям…  

Теоретическая справка

Морфология грибов и методы их изучения

II. Выделяют 2 вида грибов: плесени и дрожжи. 1. Основа вегетативного тела плесневых грибов – мицелий, состоящий из… 2. Более высоко организованными считаются дрожжи и дрожжеподобные грибы. У них мицелий отсутствует, тело в…

Методы изучения

Препараты: а) Нативные. Для приготовления препаратов, берут волосы, соскобы кожи,… б) Фиксированные (окрашенные). Для окраски мазков чаще всего используют простые методы окраски (метиленовый синий), а…

Подпись преподавателя_________________________________________________________

Самостоятельная работа во внеурочное время

Изучить теоретическую справку «Типы микроскопов и принципы микроскопии; правила работы с микроскопом при использовании иммерсионной системы». Ответить на следующие работы:

Основные характеристики светового микроскопа

   

Принцип иммерсионного метода микроскопии

 

Особенности фазово-контрастной микроскопии

   

Особенности темнопольной микроскопии

 

Особенности люминесцентной микроскопии

   

Основные характеристики электронного микроскопа

   

Типы микроскопов и принципы микроскопии; правила работы с микроскопом при использовании иммерсионной системы

 

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра.

  Системы микроскопии

ЗАНЯТИЯЕ 1.1.2

  Цель занятия: изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с…

Работа № 2. Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки

Самостоятельная работа:приготовить мазок из смеси культур стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму (см. теоретическую справку). Оценить…     Результат:

Подпись преподавателя_________________________________________________________

К работе № 2 Теоретическая справка

 

Структурные компоненты бактериальной клетки, их функции методы выявления:

 

Постоянные компоненты и их природа	Функции	Метод выявления
Клеточная стенка   Гр + (пептидогликан, тейхоевые кислоты)   Гр – (пептидогликан, фосфолипиды, белки, ЛПС)	1) Скелетная 2) Защитная 3) Рецепторная 4) Антигенная 5) Адгезивная 6) Транспортная 7) Нарушение синтеза клеточной стенки ведет к образованию L-форм	Световая микроскопия, окраска по Граму
ЦПМ (цитоплазматическая мембрана) Двойной слой фосфолипидов с внедрёнными белками	1) Основной осмотический барьер 2) Участвует в регуляции роста и синтезе компонентов клеточной стенки 3) Транспорт питательных веществ в клетку и метаболитов из нее 4) Инвагинации участков ЦПМ - мезосомы - содержат ферменты, обеспечивающие биологическое окисление	Электронная микроскопия
Мезосомы Производные ЦПМ	1) Аналог митохондрий, обеспечивают синтез АТФ и процессы дыхания 2) Участвуют в делении клетки 3) Участвуют в спорообразовании	Электронная микроскопия
Цитоплазма Сложная коллоидная система, состоит из воды, растворимых белков, РНК	Обеспечивает функционирование всех органелл	Электронная микроскопия
Рибосомы 70S	Отвечают за биосинтез белка	Электронная микроскопия
Нуклеоид Двунитевая молекула ДНК, замкнута в кольцо, плотно уложена в виде клубка	Расположен в центральной зоне бактерий (одна хромосома) – носитель генетической информации	Электронная микроскопия

 

 

Непостоянные компоненты и их природа	Функции	Метод выявления
Капсула Слизистая структура, прочно связана с клеточной стенкой (полисахариды или полипептиды)	1) Защитная 2) Антигенная 3) Адгезивная	Световая микроскопия, окраска по Бурри, Бурри-Гинсу
Жгутики Состоят из белка-флагеллина, являющимся Н-антигеном   Пили Состоят из белка	Обеспечивают движение бактерий     Пили 1-го порядка обеспечивают адгезию на поражаемой микробной клетке. Пили 2го порядка – конъюгационные, обеспечивают перенос части генетического материала от донора к реципиенту	В мазках «висячая капля», «раздавленная капля», при фазово-контрастной микроскопии   Электронная микроскопия
Плазмиды Дополнительные факторы наследственности в виде замкнутых колец ДНК с небольшой молекулярной массой	1) Регуляторная – компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина 2) Кодирующая – внесение в бактериальную клетку новой генетической информации	Электронная микроскопия
Включения Гликоген, полисахариды, бета-оксимасляная кислота, полифосфаты (волютин)	Запас питательных веществ	Световая микроскопия. Волютин окрашивают по Леффлеру или Нейссеру
Спора Образуют Гр+ бактерии, из одной клетки образуется спора. Плотная многослойная оболочка, с большим содержанием кальция и липидов, низким содержанием воды	Сохранение генетической информации, при неблагоприятных условиях. Расположена: - субтерминально - терминально - центрально	Световая микроскопия, окраска по Ожешко.

 

Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.

1 этап.Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.

2 этап. Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество материала, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см².

3 этап. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. В фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы фиксации

 

Физический метод	Химический метод
Фиксация мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх	Мазок погружают в фиксатор на определенное время. В качестве фиксатора используют: этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь Никифорова (этанол +эфир – 1:1) – 10-15 мин и др.

 

Методы окраски

 

Простые методы (ориентировочные)	Сложные методы (дифференцирующие)
1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним красителем анилино-вого ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый.	1. Применяют для изучения структуры клеток, дифференциации микроорганизмов. 2. Используют несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, Нейссера Гинса-Бурри и др.

 

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион - катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

 

Окраска по Граму. Сущность метода

 

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

 

Этапы окраски по Граму представлены на стенде.

 

Окраска по Цилю-Нильсену.

Методика окраски по Цилю-Нильсену: 1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через… 2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

Окраска по Ожешко

Методика окраски по Ожешко: 1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и… 2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену.…

Самостоятельная работа во внеурочное время

а) морфологические свойства - __________________________________________________ … …

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ И ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ

  9. Заполните таблицу

ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ

 

ЗАНЯТИЕ 1.1.3

Цель: изучить морфологию актиномицетов, спирохет, микоплазм, хламидий, риккетсий, вирусов    

КЛАССИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Работа№1. Актиномицеты. Методы выявления

  Самостоятельная работа: зарисуйте и опишите строение актиномицетов. Объясните,…  

Теоретическая справка

К Работе № 1

Методы выявления актиномицет

С помощью прокаленного и остуженного скальпеля отрезают небольшой кусочек культуры актиномицета на плотной питательной среде и помещают его в каплю… При микроскопии видно сплетение тонких нитей, истинное ветвление их и большое…

Работа№2. Спирохеты. Методы выявления

Самостоятельная работа: зарисуйте и опишите строение спирохет. Объясните, почему спирохеты занимают промежуточное положение между бактериями и…   Результат:    

T. pallidum (трепонема)

Результат:______________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

B. recurrentis (боррелия)

Результат:______________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

L. interogans (лептоспира)

 

Ультраструктура спирохет

                 

Теоретическая справка

К Работе № 2

Методы выявления спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир)

Работа №3. Микоплазмы. Методы выявления

Самостоятельная работа: зарисуйте и опишите строение микоплазм. Какие методы применяются для выявления микоплазм?   Результат:

Теоретическая справка

К Работе № 3

Методы выявления микоплазм

Работа №4. Хламидии: морфология, цикл развития Цель:изучить морфологию хламидий, цикл развития Самостоятельная работа:ответьте на вопросы:

Теоретическая справка

К Работе № 4

Хламидии (морфология, жизненный цикл хламидий).

По современной классификации хламидии относят к роду Chlamidia семейства Chlamidiaceae порядка Chlamidiales. Вид С. trachomatis - возбудитель… Возбудитель венерической лимфогранулемы имеет биологическое отличие от…

Методы выявления хламидий

Хламидии окрашиваются по Романовскому-Гимзе. Грамотрицательны, хорошо видны в нативных препаратах при фазово-контрастной микроскопии.  

Работа№5. Морфология риккетсии и цикл развития

  Самостоятельная работа:зарисовать и описать морфологию риккетсий. Какие методы…  

Теоретическая справка

К Работе № 5

 

Методы выявления риккетсий

По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе. По П. Ф. Здродовскому наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы… 1) кокковидные (0,5мкм),

Работа №6. Вирусы. Методы выявления

  Самостоятельная работа: Опишите строение вирусов. Перечислите основные…  

Подпись преподавателя______________________________________________________

Самостоятельная работа во внеурочное время

  1. Заполните таблицу ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ ВИРУСОВ Принцип классификации Описание Примеры 1. Тип…

Взаимодействие бактериофага с оболочкой бактерии

Вывод:             …

ЗАНЯТИЕ 1.1.4

    Цель занятий: изучить условия и методы культивирования микроорганизмов. Освоить бактериологический метод…

Теоретическая справка

  Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть… 1) простые (универсальные) - на них растут только нетребовательные микробы (стафилококки, кишечная палочка). Это МПА и…

Дифференциально-диагностические среды.

1.1. Среды Эндо,Левина, Плоскирева. Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы… К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20%… 1.2.Среды с крахмаломопределяют микроорганизмы, образующие амилазу. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько…

Теоретическая справка

Микроорганизмам как всему живому присущи три основные физиологические функции: питание, дыхание и размножение. Питание необходимо для синтеза в клетке всех органических структур, оно…  

Работа № 3. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах

Самостоятельная работ:описать характер роста на жидкой питательной среде                 …  

Теоретическая справка

  Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением…  

Работа № 4. Техника посева на питательные среды

Самостоятельная работа:рассмотреть готовые демонстрационные посевы, зарисовать и указать назначение каждой техники посева.   название рисунок значение 1)…  

Теоретическая справка

Работа № 4

Техника посева на жидкие и плотные питательные среды

Методы, основанные на механическом разобщении микробов

Метод Дригальского

Стерильной пипеткой материал помещают на поверхность МПА в чашку Петри   посев шпателем (газоном) посев петлей (штрихом)

Работа № 5. Биохимическая активность аэробов (дифференциально-диагностические признаки)

Цель:изучить ферментативную активность микроорганизмов (см. теоретическую справку)

Самостоятельная работа: определить сахаролитическую и протеолитическую активность предложенной культуры и идентифицировать микроорганизм.

 

А) Сахаролитическая и протеолитическая активность

Вывод: …  

Б) Каталазная активность аэробов

Самостоятельная работа:определить каталазную активность у исследуемой культуры   Результат: _______________________________

Теоретическая справка

Работа № 5   Б) Каталазная активность. Каталаза - это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием…

Теоретическая справка

Бактериологический метод является основным при диагностике инфекционных заболеваний. Его сущность заключается в определении вида возбудителя… Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от… 1. Забор исследуемого материала следует провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после…

Подпись преподавателя______________________________________________________________

 

 

Самостоятельная работа во внеурочное время:

Ответьте на следующие вопросы:

1) Что изображено на схеме?

1-

 

2-

 

3-

 

4-

 

Охарактеризовать все фазы процесса

                 

ЗАНЯТИЕ 1.1.5

  Цель занятия: изучить методы выделения чистых культур анаэробов; методы культивирования облигатных внутриклеточных паразитов.

Работа№1. Схема бактериологического метода диагностики анаэробных инфекций

Цель: выявить особенности бактериологического метода диагностики для анаэробных инфекций

Самостоятельная работа:разобрать схему выделения и идентификации микроорганизмов с анаэробным типом дыхания

 

Схема бактериологического метода диагностики анаэробных инфекций

II

 

III

 

 

IV

		а)

 

 

V

Г)

Б)

В)

I. Забор исследуемого материала

II. Накопление культуры (среды обогащения: сахарный бульон, тиогликолевая среда, железо-сульфидная среда)

III. Получения изолированных колоний на плотных питательных средах (культивирование в анаэробных условиях)

IV. Накопление чистой культуры на тиогликолевой среде

V. Идентификация выделенной чистой культуры

а) изучение морфологических и тинкториальных свойств

б) изучение культуральных свойств

в) изучение биохимических свойств возбудителя по результатам посева на среды Гисса

г) Реакция нейтрализации токсина на лабораторных животных, реакция флоккуляции

 

Вывод: ____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

Работа №2. Методы создания анаэробных условий

Самостоятельная работа: рассмотреть предложенные питательные среды и оборудование для культивирования анаэробов, назвать метод создания анаэробных…   …

Работа №3. Биохимическая активность анаэробов

Самостоятельная работа: указать какая биохимическая активность анаэробов проявляется на демонстрационных средах среда рисунок …   …

Куриный эмбрион

1. Воздушное пространство 2. Отверстие в скорлупе 3. Скорлупная оболочка

Культура тканей

                     

Лабораторные животные

Вывод:_______________________________________________________________________               …  

Теоретическая справка

К работе №2

Методы создания анаэробных условий

•Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества: В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г)… Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующим веществами является среда тиогликолевая, которая используется для…

К работе № 3

Для культивирования вирусов используют: 1) Куриные эмбрионы. Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования…

Самостоятельная работа во внеурочное время

Цель применения устройства? Какие дополнительные технические средства и среды нужно использовать? Дать классификацию микробов по типу дыхания. …             …  

Подписьпреподавателя___________________________________________________

Занятие № 1.1.6

 

Контроль по модульной единице 1.1 «Морфология и физиология микроорганизмов»

Вопросы к контрольному занятию

 

I. Тест-контроль по темам: «Морфология и физиология микроорганизмов»

II. Ответить на теоретические вопросы:

1. Принципы классификации бактерий. Основные формы и размеры бактерий.

2. Постоянные структуры бактериальной клетки. Функциональное значение отдельных структурных компонентов.

3. Непостоянные структуры бактериальной клетки. Функциональное значение капсулы, спор. Методы выявления.

4. Непостоянные структуры бактериальной клетки. Функциональное значение жгутиков, включений. Методы выявления.

5. Различие в структуре клеточной стенки Гр⁺ и Гр^-бактерий. Химический состав. Функции.

6. Строение стенки Гр⁺ бактерий. Структура и функции пептидогликана.

7. Строение стенки Гр^-бактерий. Функции липополисахарида.

8. Цитоплазматическая мембрана, Функциональное значение.

9. Протопласты, сферопласты , L – формы бактерий. Условия их формирования.

10. Принципы классификации грибов.

11. Морфология грибов.

12. Сравнительная характеристика актиномицетов и грибов.

Классификационное положение, методы выявления.

13. Риккетсии и хламидии. Морфология, методы выявления. Особенности биологии.

14. Сравнительная характеристика спирохет и простейших. Методы выявления и классификационное положение.

15. Особенности морфологии микоплазм. Принципы классификации и методы выявления.

16. Вирусы – своеобразная форма жизни. Природа вирусов.

17. Вирусы. Принципы классификации, морфология вирионов.

18. Структура вириона.

19. Химический состав вириона.

20. Жизненный цикл вирусов. Стратегия вирусного генома.

21. Цитопатология зараженных клеток. Природа вирусных включений. Значение лабораторной диагностики.

22. Бактериофаги, классификация, строение.

23. Структура типовых бактериофагов. Практическое использование.

24. Формы взаимодействия бактериофагов с бактериальной клеткой.

25. Структура и химический состав микробной клетки. Особенности метаболизма бактерий.

26. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.

27. Питание бактерий. Типы питания микробов.

28. Поступление питательных веществ в клетку.

29. Ферменты бактерий (классификация, назначение). Идентификация бактерий по ферментативной активности.

30. Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение).

31. Принципы и методы выделения чистых культур аэробов.

32. Принципы и методы выделения чистых культур анаэробов.

33. Питательные среды, используемые для культивирования бактерий. Их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.

34. Методы культивирования риккетсий и вирусов.

 

III. Практическая работа студента:

1. Техника работы с микроскопом.

2. Микроскопировать готовый препарат- мазок. Определить морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов.