рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Основы ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Основы ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ - раздел Биология, Основы...

основы

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ


В. А. Галынкин, Я А. Заикииа, В. И. Кочеровец, Т. С. Потехина, Н. Д. Бунатян

ОСНОВЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования

ЩуЩ

Санкт-Петербург 2008

УДК 615.281:579 (075.8) ББК 52.81я73 0 75

Основы фармацевтической микробиологии: Учебное пособие/В. А. Галын- кин, Н. А. Заикина, В. И. Кочеровец и др. - СПб: «Проспект Науки», 2008. -304 с.

ISBN 978-5-903090-14-3

Современные сведения о микроорганизмах-продуцентах БАВ, контаминан- тах фармацевтического производства, возбудителях инфекционных заболеваний, а также о биоцидных агентах - химиотерапевтических веществах, дезинфектантах и антисептиках, механизме их действия и проблемах микробной резистентности представлены в свете применимости этих знаний для специалистов в области про­мышленного производства, асептичного изготовления, контроля качества и исполь­зования лекарственных средств. Основы иммунитета изложены в связи с особенно­стями производства иммунопрепаратов. В разделе «Микробиологические аспекты фармацевтического производства» рассматриваются требования к качеству лекар­ственных средств и проблемы повышения качества путем борьбы с микробами-кон- таминантами и соблюдения принципов GMP.

ISBN 978-5-903090-14-3 © ООО «Проспект Науки», 2008 © Коллектив авторов, 2008

Для студентов, микробиологов, провизоров, технологов по производству фарм­препаратов и широкого круга специалистов, занятых в сфере лекарственного обра­щения.

ISBN 97S-5-903090-14-3

9785903090143

СОДЕРЖАНИЕ

Введение................................................................................................................ 7

Часть I. БИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ......................................... 9

Глава 1. Прокариоты (бактерии).................................................................... 9

1.1. Морфология и ультрастуктура................................................ 11

1.2. Генетический аппарат............................................................... 17

1.3. Физиология.................................................................................... 20

1.4. Возбудители бактериальных заболеваний человека........ 30

Глава 2. Грибы.................................................................................................. 33

2.1. Морфология и ультраструктура......................................... ....33

2.2. Экология........................................................................................ 38

2.3. Использование в промышленности........................................ 39

2.4. Грибы - возбудители болезней человека и животных....... 40

2.5. Фитопатогенные грибы............................................................. 44

Глава 3. Вирусы и прионы.......................................................................... 45

3.1. Структура вирусов...................................................................... 45

3.2. Взаимодействие вирусов с клеткой хозяина........................ 46

3.3. Культивирование вирусов........................................................ 51

3.4. Действие химических и физических факторов на вирусы.

. Принципы создания антивирусных препаратов...................... 51

3.5. Прионы............................................................................................ 57

Глава 4. Простейшие....................................................................................... 59

4.1. Споровики...................................................................................... 59

4.2. Саркодовые................................................................................... 62

4.3. Жгутиконосцы.............................................................................. 64

4.4. Инфузории...................................................................................... 65

4.5. Лечение протозойных инфекций............................................. 66

Глава 5. Основы патогенности микроорганизмов Инфекционные болезни 68

5.1. Патогенность и вирулентность................................................ 68

5.2. Факторы защиты и агрессии..................................................... 68

5.3. Инфекционные болезни.............................................................. 71


Часть II. АНТИМИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ Глава 6. Антибиотики и синтетические

химиотерапевтические препараты........................................................... 74

6.1. Антибиотики................................................................................. 74

6.2. Синтетические химиотерапевтические препараты........... 81

6.3. Полимерные производные антимикробных препаратов....83

Глава 7. Производство химиотерапевтических препаратов............ 84

7.1. Общие представления о промышленном производстве лекарственных препаратов 84

7.2. Производство антибиотиков.................................................... 87

7.3. Микроорганизмы как продуценты биологически активных веществ и биоиндикаторы 91

Глава 8. Получение биологически-активных веществ методами генетической и клеточной инженерии 94

8.1. Методы генетического конструирования микроорганизмов in vitro 94

8.2. Направленный мутагенез..;....................................................... 98

8.3. Клеточная инженерия................................................................. 99

8.4. Генная терапия........................................................................... 100

8.5. Контроль безопасности в области молекулярной биотехнологии 102

Глава 9. Применение химиотераиевтических препаратов............. 104

9.1. Химиотерапия инфекционных заболеваний...................... 104

9.2. Применение химиотераиевтических препаратов для лечения инфекционных заболеваний 109

9.3. Применение химиотерапевтических препаратов

в сельском хозяйстве........................................................................ 115

Глава 10. Механизм действия химиотерапевтических препаратов. Резистентность 117

10.1.Ингибиторы биосинтеза компонентов клеточной стенки. .117

10.2. Ингибиторы синтеза белка................................................... 118

10.3.Препараты, нарушающие функции хромосомы............. 120

10.4. Антагонисты фолатов............................................................ 120

10.5. Антимикробные агенты, воздействующие

на цитоплазматическую мембрану............................................. 121

10.6. Устойчивость микроорганизмов

к химиотерапевтическим веществам........................................... 123


Глава 11. Дезинфектанты, антисептики и консерванты................... 130

11.1.Факторы, определяющие выбор антимикробного агента..130

11.2.Применение биоцидов............................................................ 131

11.3.Оценка эффективности........................................................... 135

11.4. Механизм действия дезинфектантов и антисептиков... 139

11.5. Резистентность микроорганизмов к антисептикам

и дезинфектантам............................................................................. 142

Глава 12. Основы иммунитета................................................................... 148

12.1. Неспецифические факторы защиты................................... 148

12.2.Иммунитет,................................................................................ 151

12.3. Аллергия.................................................................................... 162

12.4. Толерантность и аутоиммунитет....................................... 165

12.5. Влияние факторов внешней среды на формирование защитных сил организма 166

Глава 13. Иммунопрепараты: производство и контроль качества.... 170

13.1. Вакцины..................................................................................... 170

13.2. Иммуномодуляторы............................................................... 178

13.3. Сыворотки и иммуноглобулины......................................... 179

13.4. Контроль качества иммунопрепаратов............................ 184

Часть III. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА Глава 14. Экология микроорганизмов и ее связь с фармацевтической промышленностью 191

14.1.Нормальная микробиота человека.................................... 191

14.2. Микробиота окружающей среды.

Санитарно-показательные микроорганизмы........................... 199

Глава 15. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве 211

Глава 16. Микробиологические требования к качеству лекарственных средств 225

16.1. Микробиота нестерильных лекарственных средств.... 225

16.2. Микроорганизмы, контролируемые в НДС..................... 227

16.3. Принципы микробиологического контроля нестерильных лекарственных средств 235

16.4. Контроль стерильности лекарственных препаратов... 245

Глава 17.Борьба с микробами-контаминангами в фармацевтическом производстве 249

17.1. Действие физических и химических факторов

на микроорганизмы.......................................................................... 249

17.2.Асептика, антисептика, стерилизация............................... 254

17.3. Промышленная дезинфекция................................................ 264

Глава 18. Гигиена на производстве. Принципы GMP....................... 269

18.1. Правила GMP в обеспечении качества лекарственных средств 269

18.2. Гарантия качества и контроль микробиологического риска в фармацевтическом производстве 272

18.3. Микробиологические требования к организации производства фармацевтической продукции 274

Рекомендуемая литература.......................................................................... 284

Предметный указатель................................................................................ 286

Указатель латинских названий.............................................................. 298


ВВЕДЕНИЕ

Трудности лечения и профилактики инфекционных заболеваний свя­заны с разнообразием биологических форм их возбудителей, постоянным возникновением резистентных штаммов, появлением новых видов опас­ных патогенов, угрозой биотерроризма, что определяет актуальность про­блемы разработки, изготовления, контроля качества и использования эф­фективных лекарственных срдств - антимикробных агентов. Современ­ная фармацевтическая промышленность во многих странах является од­ной из наиболее успешно развивающихся отраслей индустрии. Необхо­димым показателем качества лекарственного препарата является его эф­фективность и безопасность, в том числе по микробиологическим пока­зателям. Специалистам, работающим в этой отрасли, и студентам фарма­цевтических ВУЗов необходимо владеть современными знаниями о мик­роорганизмах-продуцентах биологически активных веществ, контаминан- тах фармацевтического производства и готовой продукции, а также о воз­будителях инфекционных заболеваний (прокариотах, грибах, вирусах, простейших), вызываемых ими заболеваниях, биологических особеннос­тях патогенов, обеспечивающих их устойчивость к лекарственным пре­паратам, чтобы находить способы ее преодоления.

Глубокое понимание особенностей структуры и механизма действия антимикробных препаратов необходимо для творческого подхода к со­зданию качественной фармацевтической продукции. Особой отраслью медицинской промышленности является производство иммунопрепара- тов, которое требует от работников отрасли знаний основ иммунитета.

Для провизоров и работников фармацевтической промышленности необходимым этапом деятельности является обеспечение условий, исклю­чающих возможность проникновения микробов-контаминантов в сферу производства, а также мероприятия по снижению их численности до до­пустимых пределов.

В книге обобщен многолетний опыт преподавания на кафедре мик­робиологии СПХФА курсов «Общая микробиология», «Микробиология продуцентов БАВ», «Основы промышленной асептики», атакже опыт пре­подавания методов микробиологического контроля качества лекар­ственных средств на факультете усовершенствования провизоров ММА им. И. М. Сеченова.

Учебное пособие рекомендовано для студентов, микробиологов, про­визоров, технологов и широкого круга специалистов, занятых в сфере ле­карственного обращения с целью подготовки к работе в условиях строго­го соблюдения правил GMP, принятых в России (ОСТ 42-510-18).


ЧАСТЬ I. БИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Глава 1. ПРОКАРИОТЫ (БАКТЕРИИ)

Прокариоты составляют отдельную классификационную группу микроорганизмов, они существенно отличаются от эукариот, к которым принадлежат грибы, растения, животные и человек (табл. 1). В литерату­ре традиционно принято называть представителей прокариот бактерия­ми. В зависимости от особенностей клеточной оболочки бактерии под­разделяют на четыре основные категории: (1) грамотрицательные бакте­рии, (2) грамположительные бактерии, (3) бактерии, лишенные клеточ­ных стенок, (4) архебактерии. Первые две группы имеют ригидные клеточные стенки, жесткий каркас которых составляет пептидогликан му- реин, содержащий мурамовую кислоту. К ним относится большинство возбудителей инфекционных заболеваний и сапротрофных микроорганиз­мов. Бактерии, лишенные ригидной клеточной и поэтому не имеющие постоянной формы клеток, называют микоплазмами. Среди них имеются виды, патогенные для человека (Mycoplasma pneumoniae, M.hominis, M.fermentans), животных и растений.

Архебактерии не содержат муреина в клеточной стенке, что делает их устойчивыми к b-лактамным антибиотикам. По особенностям молеку­лярного строения они значительно отличаются от других прокариот. Пре­имущественно это почвенные или водные микроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях (в средах с высоким содержанием солей, силь­нокислой и при высокой температуре). Кроме того, среди них имеются симбионты в пищеварительном тракте теплокровных.

Таблица I

Некоторые дифференцирующие признаки прокариот и эукариот

Признак Прокариоты Эу кар ноты
Цитологические свойства    
Нуклеоид (нукяеоплазма, генофор) отделен от цитоплазмы мембраной +
Диаметр клетки: + -
обычно 0,2-2 мкм    
обычно > 2 мкм    
Митохондрии - +
Хлоропласта (у фототрофов) - +

Продолжение табл. 1

Признак Прокариоты Эукариоты
Цитологические свойства    
Нуклеоид (нуклеоплазма, генофор) отделен от цитоплазмы мембраной +
Диаметр клетки: + -
обычно 0,2-2 мкм    
обычно > 2 мкм    
Митохондрии - +
Хлоропласты (у фототрофов) - +
Вакуоли, если присутствуют, окружены мембраной - +
Аппарат Гольджи - D
Лизосомы - D
Эндоплазматический ретикулум - +
Локализация рибосом:    
рассеяны в цитоплазме + -
прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму - +
Ток цитоплазмы, эндоцитоз, экзоцитоз - D
Диаметр жгутиков (если присутствуют):    
0,01-0,02 мкм + -
около 0,2 мкм - +
Эндоспоры D -
Химические признаки    
Полигидроксибутират как запасное вещество в виде включений в цитоплазму D
Тейхоевые кислоты в клеточной стенке D -
Полиненасыщенные жирные кислоты в составе мембран Редко Обычно
Стиролы в составе мембран D Обычно
Диаминопимелиновая кислота в составе клеточных стенок D
Пептидогликан, содержащий мурамовую кислоту в составе клеточных стенок D  
Метаболические свойства    
Клетка поглощает питательные вещества в виде малых молекул. Крупные молекулы или частицы должны быть предварительно гидролизованы внеклеточными ферментами т D
Компоненты систем дыхания и фотосинтеза (у фототрофов) локализованы в цитоплазматической мембране или ее инвагинантах +  

 

Окончание табл. 1

Признак Прокариоты Эукариоты
Хемолитотрофный тип метаболизма D -
Фиксация N2 D -
Способность к диссимиляционному восстановлению N03 до N20 или N2 D
Метаногенез D -
Аноксигенный фотосинтез D -
Особенности размножения    
Деление клеток без образования системы веретена
Деление клеток путем митоза с участием системы веретена +
Мейоз - D
Молекглярно-биonогические свойства    
Число хромосом в одном нуклеоиде или ядре Обычно 1 Обычно >1
Хромосомы кольцевые + -
Хромосомы линейные - +
Рибосомы:    
70S + -
80S - +
Рибосомальные РНК:    
16 S, 23 S, 5 S + -
18 S, 28 S, 5,85 S, 5 S +

 

1.1. Морфология и ультраструктура

Прокариоты - это одноклеточные микроорганизмы, диаметр клеток которых обычно составляет от 0,2 до 2 мкм. По форме клеток их подраз­деляют на три основные группы: сферические (кокки), цилиндрические (бактерии, бациллы) и спиралевидные (рис. 1). Более сложное строение имеют актиномицеты.

Клеточная стенка обеспечивает поддержание жесткости структу­ры клетки, постоянства ее формы и механической прочности; кроме того, она является осмотическим барьером, имеющим зоны избирательной про­ницаемости для веществ различной химической природы. В качестве опор­ного каркаса она содержит пептидогликан муреин. Основу муреина со­ставляют цепи чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетил- мурамовой кислоты, соединенные |3-1,4-гликозидными связями. Остатки мурамовой кислоты соединены полипептидными цепочками, в состав которых входят а-аланин, D-аланин, лизин, D-глутаминовая и мезодиа- минопимелиновая кислоты.




 

 


а ц Н-

Z 3 = сл

О


С 5 О

\ Л \ «—• ^


 

 


о о -а

S О О Е

П. О 3" о

а о я к

о s а.
7

'С £ а. й

£7 w ч

_ к я

в 5 о

«19

5 3 ?

я а, 2

<х>

a 55 §

Зой о. о £

О Я

5' О- §•

р г г


 

 


•О" U

ч\


 

 


О


Аминокислоты D-ряда и мурамовая кислота уникальны для прока­риот, своеобразие структуры клеточной стенки служит основой избира­тельного действия некоторых антибиотиков, например, пенициллина и других р-лактамов. Клеточные стенки грамположительных и грамотри- цательных бактерий существенно различаются по своей структуре.

У грамотрицательных бактерий муреиновая сеть однослойная, иног­да двуслойная. На ней располагаются белки, липопротеиды, липополиса- хариды и фосфолипиды, входящие в состав внешней мембраны. Стаби­лизация этих компонентов обеспечивается ионами Са^ и Mg4^. Существен­ное значение для структуры и функции внешней мембраны имеет липид А. Его скелет содержит дисахарид, состоящий из остатков D-глюкозамина, соединенных |3-1,6-связью, имеющих в положении 1 и 4 фосфатные груп­пы. Скелет этерифицирован жирными кислотами С)2, С14 и С]6. Липид А имеет уникальную конформацию - компактную и высокоупорядоченную, благодаря чему создает в мембране вязкую структуру, которая затрудняет диффузию желчных кислот, детергентов и некоторых антибиотиков. Ли­пид А обеспечивает токсичность и пирогенность липополисахарида. Ан­тигенная специфичность грамотрицательных бактерий главным образом определяется углеводами О-замещенных боковых цепей, выступающих наружу с поверхности клетки. Внешняя мембрана обеспечивает высокую устойчивость грамотрицательных бактерий по сравнению с грамположи- тельными к антимикробным агентам.

У грамположительных бактерий внешняя мембрана отсутствует, а муреиновая сеть составляет 30-70 % сухой массы клеточной стенки и достигает 40 слоев. Характерно наличие тейхоевых и тейхуроновых кис­лот, обеспечивающих отрицательный заряд клетки и способствующих сор­бции катионов из окружающей среды. У некоторых микроорганизмов мо­гут присутствовать добавочные компоненты - липиды, воска, миколовые кислоты, протеины, полисахариды.

Различие в структуре клеточной стенки двух групп микроорганиз­мов выявляют с помощью окрашивания по Граму. Препарат обрабатыва­ют раствором кристаллического фиолетового, затем йода. Образующий­ся комплекс красителя с йодом располагается на (в) протопласте. При об­работке препарата спиртом он удерживается клеточной стенкой грампо­ложительных бактерий и вымывается - у грамотрицательных. Способ­ность окрашиваться по Граму - важный таксономический признак, с ко­торым коррелируют другие свойства бактерий.

S-слой (surface - поверхность) располагается на поверхности кле­ток всех прокариот и покрывает целиком всю клетку. Он состоит из струк­турных единиц-протеинов или глико протеинов, образующих монослой, структура которого типична для двухмерных кристаллов (решетка гекса­гональной, косой или квадратной симметрии). Взаимодействие между субъединицами и подлежащими структурами происходит за счет некова- лентных связей. S-слой обеспечивает защиту клетки от внешних воздей­ствий, однако при продолжительном культивировании он может быть ут­рачен без потери жизнеспособности штамма.

Капсулы и слизь образуются у некоторых бактерий снаружи от кле­точной стенки как ее внешний слой. Способность к их формированию не является видовым признаком: могут существовать капсульные и бескап- сульные штаммы. У патогенных микроорганизмов капсула обеспечивает защиту от фагоцитоза, повышая вирулентность штамма. У микробов, оби­тающих в почве и на растениях, капсула защищает клетки от высыхания, солнечной радиации, биоцидов. Капсулы и слизь создают для микробных клеток осмотические условия, благоприятствующие сорбции питатель­ных веществ из субстрата, способствуют адгезии клеток между собой и субстратом. Многие экзоферменты локализуются в капсуле, где проис­ходят превращения веществ, поступающих в клетку.

У большинства бактерий капсулы и слизь имеют полисахаридную природу. У некоторых бацилл это полипептиды в основном D- и L-глута- миновой кислоты.

Капсульные полисахариды обладают антигенной специфичностью и используются для изготовления вакцин (у пневмококков, менингокок­ков), для идентификации и классификации (у сальмонелл). Растворимые слизи (декстран Leuconostoc dextranicum, L.mesenteroides, ксантан Xanthomonas campestris) получают в промышленных масштабах и широ­ко используют в фармации и других областях.

Протопласты и сферопласты - это структуры полностью (прото­пласты) или частично (сферопласты) утратившие клеточную стенку, на­пример, под действием лизоцима или пенициллина. Это осмотически ла­бильные элементы, которые могут существовать только в гипертоничес­ких растворах. Они сохраняют биологическую активность и способны в специальных условиях ревертировать в нормальные клетки. Использу­ются в клеточной инженерии для получения гибридных форм микроорга­низмов.

L-формы, получившие свое название в честь института Листера в Лондоне, образуются в условиях, приводящих к нарушению синтеза клеточной стенки; например, у больного туберкулезом возбудитель под влиянием лекарственных веществ может превратиться в L-форму. При этом микобактерии теряют характерную кислотоустойчивость, что затрудняет их выявление и диагностику заболевания. Для таких клеток характерны неправильные формы, иногда нитевидные, способные проходить через поры бактериальных фильтров. Лабильные L-формы способны реверти- ровать в нормальные клетки. Стабильные не образуют клеточной стенки, поскольку ее утрата связана с изменением генотипа (мутацией).

Лериплазматическое пространство располагается между слоем муреина и цитоплазматической мембраной. В нем находятся ферменты гидролазы, расщепляющие вещества, поступающие в клетку, и полимера- зы, участвующие в синтезе клеточной стенки и капсулы, а также белки, принимающие участие в транспорте субстратов в цитоплазму и белки - рецепторы хемотаксических стимулов.

Цшпоплазматическая мембрана располагается под клеточной стен­кой и отделяет от внешней среды цитоплазму. Имеет толщину 6-8 нм и составляет 8-15 % сухого вещества клетки. Ее структура соответствует общему принципу организации мембран про- и эукариотических клеток.

Цитоплазматическая мембрана служит осмотическим барьером, в ней локализуются системы активного транспорта веществ в клетку и из клетки.

Мезосомы - особые структуры, образуемые путем инвагинации (вта­чивания) мембраны, содержат ферменты системы окислительного фос- форилирования и выполняют у прокариот функции митохондрий.

Цитоплазма составляет внутреннюю среду клетки. Это сложная высокогетерогенная система, в ней располагается генетический матери­ал клетки (нуклеоид, плазмиды), 70S рибосомы, ферментные системы, выполняющие метаболические функции, резервные вещества (полисаха­риды, липиды, полигидроксимаеляная кислота, полифосфаты, сера у се­робактерий). Основная часть метаболических процессов осуществляется в цитоплазме. Мембранные структуры, располагающиеся в цитоплазме, наиболее развиты в клетках эукариот, у бактерий имеются их аналоги (ме­зосомы, вакуоли, лизосомы).

Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Перемещаться без жгутиков способны скользящие бактерии и спирохеты. Число жгути­ков и их расположение на клетке - таксономический признак, характер­ный для определенных видов. Жгутики построены из белка - флагелли- на, их диаметр 10-20 нм, длина до 20 мкм. Жгутик закреплен в цитоплаз­матической мембране и клеточной стенке с помощью базального тельца, состоящего из центрального стержня и двух пар (у грамотрицательных бактерий) и одной пары (у грамположительных) дисков. Жгутики враща­ются благодаря тому, что через диски проходит поток заряженных частиц (Н+, ОН-, Na+) за счет разности потенциалов внутри и вне клетки. Жгути­ки находятся под контролем системы, воспринимающей информацию о состоянии окружающей среды. Поэтому они позволяют клеткам переме­щаться в область с оптимальными условиями (таксис).

Фимбрии (пили или волоски) располагаются на поверхности кле­ток многих бактерий. Их число на клетке может доходить до 10000. Их диаметр 3-25 нм, длина около 12 мкм. Они обеспечивают сцепление кле­ток, например, при конъюгации, их адгезию к субстрату. Белки фимбрий служат рецепторами, обеспечивающими биологическое узнавание. Неко­торые фимбрии являются капиллярами, связанными с мезосомами и уча­ствуют в водно-солевом обмене.

F-волоски (F-numi) по структуре напоминают фимбрии, однако на клетке их не более одного-двух. Они находятся лишь у клеток, способных к передаче генетического материала при конъюгации, и принимают учас­тие в этом процессе как рецепторы и связывающие структуры. Кроме того, они являются рецепторами специфических фагов.

Споры прокариот - это особая структура, предназначенная для со­хранения в неблагоприятных условиях. Споры по сравнению с вегетатив­ными клетками намного устойчивее к воздействию высокой температу­ры, радиации, химических агентов. Споры образуются внутри бактери­альной клетки обычно при истощении в культуральной среде питатель­ных веществ и накоплении продуктов обмена. Биохимическим сигналом для спорообразования служит снижение концентрации в клетке гуанило- вых нуклеотидов - ГТФ и ГДФ. Спорообразование зависит от плотности популяции: при малой концентрации клеток споры не образуются. Спо­рообразование включает синтез специфических протеинов и активацию соответствующих генов, продукты которых катализируют серию процес­сов, приводящих к формированию споры.

Белки споры содержат значительно больше цистеина, чем вегета­тивные клетки. Предполагают, что многочисленные дисульфидные связи в белке обеспечивают высокую механическую прочность оболочек спор. На ранней стадии споруляции образуются особые кор-специфические белки, которые связываются с ДНК, слегка раскручивая ее, что изменяет геометрию пиримидиновых оснований и повышает их устойчивость к ультрафиолетовому излучению. В период споруляции образуется спе­цифическое вещество - дипиколиновая (пиридин-2,6-дикарбоновая) кис­лота, которая в виде соли кальция входит в состав оболочки споры.

Зрелая спора содержит минимальное количество свободной воды и повышенное по сравнению с вегетативной клеткой количество липи-
дов. На долю ее оболочки приходится до 50% сухой массы. Все эти осо­бенности обеспечивают ее устойчивость к факторам внешней среды.

Многослойная оболочка споры (рис. 2) окружает ее центральную часть (кор), содержащий геном клетки.

1 - кор (кор-специфические белки, тесно свя­занные с ДНК)

2 - кортекс (перекрестно сшитый пептидогли- кан)

3 - оболочки споры (белки с высоким содер­жанием цистеина)

4 - экзоспориум (протеин)

Рис. 2. Схема строения эндоспоры

Спорообразование присуще преимущественно палочковидным мик­роорганизмам (бациллам, клостридиям). К ним относятся возбудители сибирской язвы, столбняка, анаэробной инфекции, ботулизма и некото­рые сапротрофные виды. Помимо этого споры образуют виды родов Thermoactinomyces, Sporosarcina, Sporomusa. Все они за исключением последнего по Граму окрашиваются положительно.

Спора - это покоящаяся форма. В благоприятных условиях споры прорастают. При этом спора набухает, поглощая воду, возрастает ее мета­болическая активность, выделяется дипиколиновая кислота, спора утра­чивает свою устойчивость. Происходит деградация кор-специфических протеинов, которые служат источником энергии при прорастании споры, синтез новых молекул РНК, ДНК и белков. Наконец, оболочка споры раз­рывается, и из нее выходит вегетативная клетка.

Способность микроорганизмов к спорообразованию учитывают при выборе методов дезинфекции и стерилизации, имея в виду высокую ус­тойчивость спор к биоцидным агентам. Наиболее устойчивые виды ис­пользуют в качестве тест-культур для оценки эффективности стерилиза­ции: Bac.stearothermophilus - паром под давлением, Bac.subtilis var. niger - сухим паром, Bac.pumilus - радиационной.

1.2. Генетический аппарат

Геном прокариотической клетки включает нуклеотид (бактериаль­ную хромосому) и внехромосомные факторы наследственности.

Совокупность наследственных детерминант клетки называют гено­типом, ему противоцастапляют фоиотип - совокупность наблюдаемых
признаков. Фенотипическое проявление одного и того же генотипа может быть различным в зависимости от внешней среды.

Нуклеоид- ядро прокариотической клетки, представлен одной двой­ной фибриллой ДНК, замкнутой в кольцо. ДНК связана с гистоноподоб- ными белками. У архебактерий белки, стабилизирующие ДНК, не имеют сходства с гистонами. Геном организован из независимых доменов, огра­ниченных взаимодействием белков и ДНК. Структура доменов лабильна: для транскрипции экспонируется только необходимая часть ДНК.

Величина генома у прокариот варьирует от вида к виду в пределах 0,8-8 • 103 тысяч пар оснований (тпо) и имеет молекулярную массу поряд­ка 1-2-109 Da.

Хромосома прокариот расположена в участке цитоплазмы, свобод­ном от рибосом и не окружена мембраной. Как правило, нуклеоид несет гены, контролирующие необходимые функции клетки, связанные с ее метаболизмом и обеспечивающие процессы воспроизводства. Помимо этого геном содержит добавочные гены, контролирующие факультатив­ные свойства: гены, обеспечивающие горизонтальный перенос ДНК, гены резистентности, вирулентности и т. д., которые располагаются на транс­портабельных (мигрирующих) генетических элементах - инсерционных последовательностях, транспозонах и плазмидах.

Плазм иды по своим свойствам аналогичны умеренным фагам (см. гл. 3), но исторически сложилось так, что их рассматривают раздель­но. Это автономно реплицирующиеся элементы ДНК (репликоны), кото­рые могут быть циркулярными или линейными от маленьких (около 10 тпо) без фенотипических проявлений до близких к бактериальной хро­мосоме (более 500 тпо), придающих бактериям новые свойства - устой­чивость к биоцидам, вирулентность, синтез антибиотиков и т.д. Транс- миссибельные (конъюгативные) плазмиды способны передаваться из клет­ки донора в клетку реципиента при конъюгации, нетрансмиссибельные - путем трансдукции или трансформации (см. ниже).

Плазмиды используют в генетической инженерии для получения ре- комбинантных штаммов, например, продуцентов БАВ.

Транспозоны - это короткие двойные цепи ДНК (2-20 тпо), способ­ные перемещаться из одного участка генома в другой, обычно по маршру­ту: хромосома плазмида (1) плазмида (2) -> хромосома, перенося таким образом определенные гены, например, кодирующие устойчивость к какому-либо антибиотику, что приводит к формированию плазмид, обус­ловливающих множественную лекарственную резистентность микроор­ганизмов. По современным представлениям большая часть спонтанных мутаций является результатом внедрения в ген мигрирующих генетичес­ких элементов, например, инсерционных последовательностей (участ­ков ДНК, содержащих менее 2 тпн).

Передача генетического материала у прокариот происходит вер­тикально и горизонтально. Первый способ осуществляется при размно­жении, которое у прокариот происходит путем прямого бинарного деле­ния. Процесс сопровождается репликацией ДНК, в результате чего дочер­ние клетки получают идентичные наборы генетической информации.

Вегетативный клеточный цикл - это период, в течение которого происходит рост массы клетки, удвоение генетического материала, разде­ление вновь образованных хромосом и деление клетки. Плазмиды репли­цируются автономно и независимо от клеточного цикла, одни могут не реплицироваться, в результате чего происходит их элиминация, другие реплицируются 2-3 раза. Горизонтальный перенос ДНК осуществляется путем трансформации, трансдукции (см. гл. 3) и конъюгации.

Трансформация - это передача изолированной ДНК из клетки до­нора в клетку реципиента без каких-либо посредников. Трансформиро­ванными могут быть лишь компетентные клетки, т.е. такие, в которые может проникнуть экзогенная ДНК. Состояние компетентности может быть естественным или искусственным, т.е. достигнутым путем обработ­ки клеток химическими или физическими агентами, повышающими про­ницаемость клеточной стенки. Трансформация широко используется в генетической инженерии для создания рекомбинантных культур микро­организмов.

Конъюгация - главный путь обмена генами в природе, таким спосо­бом гены могут быть переданы не только от бактерии к бактерии, но и от прокариот эукариотам (грибам, растениям). Механизм конъюгации коди­руется плазмидами и транспозонами. Плазмида F (fertility - плодовитость) контролирует образование у клеток-доноров (F+) F-пилей, которые слу­жат для межклеточного узнавания, распознавания сайта рецептора на по­верхности клетки реципиента (F") и прикрепления к нему. F-пили образу­ются только у грамотрицательных бактерий. Предполагают, что у грам- положительных микроорганизмов конъюгация обеспечивается особыми веществами типа адгезинов.

Конъюгативный перенос генов играет значительную роль в обмене генетической информацией в мире прокариот. Он возможен как внутри одного вида, так и между разными видами бактерий. Путем передачи R-плазмиды, контролирующей резистентность к антимикробным агентам, от устойчивого штамма чувствительные к биоцидам микроорганизмы получают блок генетической информации, обеспечивающей их полире­зистентность, без длительной эволюционной перестройки. Возможна также передача других признаков: синтеза токсинов, ферментов, капсулы ит. д.

1.3. Физиология

1.3.1. Передача информации в мире микробов

Одноклеточные организмы должны распознавать изменения в ок­ружающей среде и быстро на них реагировать, адаптируя свой метабо­лизм. Прокариоты распознают свое окружение посредством мембранос- вязанных и внутриклеточных сенсоров (рецепторов) транспортных сис­тем. Сенсоры связаны с комплексом путей передачи сигналов в систему контроля метаболизма, определяющую процессы клеточной дифферен­циации и поведения бактериальной популяции. Передача сигнала связана с явлением таксиса - направленным движением в зону оптимального химического состава, температуры, освещенности. Бактерии имеют так­же сенсорные системы для оценки направления магнитного поля, меха­нического и электрохимического стимула.

При переходе микроорганизма из некультивируемого состояния в фазу роста сенсоры передают клетке сигнал об изменении внешних ус­ловий (например, при попадании в макроорганизм). Таким образом, бак­терии могут не обнаруживаться в воде, почве и т. п., но при попадании в организм вызывать инфекционный процесс. Экспрессия генов вирулент­ности часто происходит только в организме хозяина (принцип экономии энергии и адаптации к условиям in vivo).

Особая контрольная система (аутоиндукция) позволяет бактериям общаться на межклеточном уровне и оценивать плотность своей популя­ции (чувство кворума). Аутоиндукция является причиной того, что попу­ляция при высокой плотности клеток ведет себя иначе, чем при низкой плотности, например, при споруляции, биолюминесценции и т. п. Пере­дача сигналов от клетки к клетке происходит у микроорганизмов с учас­тием веществ, подобных гормонам млекопитающих, в том числе стерои­дов и полипептидов и рецепторов для этих веществ. Принцип механизма чувства кворума - активация транскрипции специфических генов при достижении порогового уровня связывания белка-активатора транскрип­ции с низкомолекулярным аутоиндуктором. Этот механизм обеспечивает быстрый рост культуры при больших посевных дозах, участвует в эксп­рессии генов вирулентности и в других процессах.

1.3.2. Метаболизм

Процессы метаболизма микроорганизмов включают всю совокуп­ность ферментативных реакций, происходящих в клетке. Это высокоин- тегрированный и целенаправленный процесс, в котором участвует комп­лекс мультиферментных систем, обеспечивающих обмен веществом и энергией между клеткой и средой. Этот обмен складывается из двух процессов - катаболизма и анаболизма.

Катаболизм включает реакции ферментативного расщепления срав­нительно крупных молекул питательных веществ, получаемых из внеш­ней среды или содержащихся в клетке в качестве запасных (углеводов, липидов, белков); реакции катаболизма (в основном окислительно-вос­становительные) сопровождаются выделением энергии, которая запаса­ется в виде АТФ.

Анаболизм представляет собой совокупность процессов фермента­тивного синтеза крупных молекул из простых предшественников; эти процессы проходят с потреблением энергии, которая поставляется в виде АТФ и других макроэргических соединений (КоА, ГТФ, УТФ, ЦТФ).

Реакции катаболизма и анаболизма протекают в клетках одновре­менно, их пути объединяет общая стадия, называемая амфибол и ческой. на которой завершается разрушение продуктов катаболизма, а ее интер­медиа™ служат предшественниками продуктов анаболизма.

Системы регуляции микробного метаболизма позволяют коорди­нировать общую метаболическую активность растущего микроорганиз­ма, которая представляет собой одновременное действие многочислен­ных биохимических реакций, катализируемых отдельными ферментами. Чтобы процесс роста был быстрым и эффективным, клетка должна управлять скоростями отдельных реакций каждого метаболического пути и общими скоростями различных путей. Кроме того, клетка должна изме­нять скорость и направление отдельных метаболических путей в ответ на изменения условия окружающей среды. Для этого у микроорганизмов существуют многочисленные регуляторные механизмы. В клетке суще­ствует два основных типа регуляции: регуляция синтеза ферментов и ре­гуляции активности ферментов. Оба они действуют при посредстве низ­комолекулярных соединений - эффекторов, которые или образуются в клетке, или поступают в нее из окружающей среды. В обоих регулятор- ных механизмах участвует особый класс белков, называемых аллостери- ческими, свойства которых изменяются при связывании с молекулами эффекторов.

Регуляция активности ферментов заключается в том, что эф­фектор соединяется с регуляторным центром молекулы фермента, из­меняя таким образом его активность. Эффектором может быть конеч­ный продукт данной реакции или конечный продукт данного метабо­лического пути. В этом случае говорят об ингибировании по принци­пу обратной связи. У фермента, чувствительного к ингибированию конечным продуктом, каталитический (активный) и аллостерический центры пространственно разобщены. Ингибирование по принципу обратной связи, как правило, обратимо, т. е. связанный конечный про­дукт может отделяться от фермента, тем самым, восстанавливая его активность. Аллостерическое ингибирование позволяет клетке расхо­довать вещества-предшественники и энергию со скоростью, необхо­димой для биосинтеза, но не выше. Аллостерическое ингибирование следует отличать от изостерического, или конкурентного, при котором субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же каталитический центр фермента. Конкурентный ингибитор по своей структуре обыч­но аналогичен структуре субстрата.

Регуляция синтеза ферментов. Ингибирование конечным продук­том, осуществляемое аллостерическими ферментами, в основном доста­точно для того, чтобы все реакции метаболизма протекали в равновесии друг с другом. Однако, если продукт какой-либо реакции не нужен, фер­менты, катализирующие эту реакцию, становятся избыточными. В этом случае действует механизм регуляции, изменяющий ферментативный со­став клетки. Эта регуляция осуществляется на уровне генов и включает индукцию и репрессию синтеза ферментов.

Помимо индуцибельных ферментов, т. е. тех, которые образуются клеткой при наличии соответствующего индуктора в питательной среде и при том условии, что в геноме клетки имеется соответствующий струк­турный ген, существуют конститутивные ферменты, образование кото­рых не зависит от наличия индуктора в среде. Индуцибельная фермент­ная система может стать конститутивной в результате мутации, затраги­вающей область оператора, либо ген-регулятор. Если мутации затрагива­ют пути, ведущие к синтезу какого-либо полезного продукта, то у таких дерепрессированных мутантов имеет место перепроизводство конечного продукта, и они с успехом могут быть использованы в промышленности, например, при получении микробиологическим путем аминокислот, ви­таминов и т. д.

1.3.3. Питание микроорганизмов

Прокариоты отличаются от других живых существ на Земле исклю­чительным разнообразием своего метаболизма, которое проявляется в их способности использовать источники питательных веществ и осуществ­лять биохимические превращения, недоступные другим организмам.

В качестве источника энергии они могут использовать как солнеч­ный свет (фототрофы), так и энергию химических соединений (хемотро- фы); в качестве источника углерода - неорганические (литотрофы или автотрофы) и органические соединения (органотрофы или гетеротрофы). Примеры различных форм потребления энергии и углерода приведены в табл. 2.

Таблица 2

Типы питания прокариот

Тип питания Источник углерода Источник энергин Донор электронов Примеры (ро­ды, семейства)
Фотолитотроф- ный СО, СО?, карбонаты Свет Н20 Цианобактерии (зеленые рас­тения)
H2S S Chromatium Thiocapsa
Фотооргано- трофный Органиче­ские соеди­нения и С02 Свет Органиче­ские соеди­нения Rhodobacter Rhodomi- crobium
Хемолитотроф- ный СО, С02, карбонаты Окислительно- восстанови­тельные реак­ции н2 Метаногены
Н2, S, H2S Thiothrix Thiobacterium Beggiatoa
Fe^, Fe'bt+ Siderocapsaceae
NHj, NOJ Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus
NOJ, NOJ Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina
Хемоорганотроф- ный Органиче­ские соеди­нения Окислительно- восстановительные реакции Большинство бактерий (гри­бы, высшие животные, не- фотосинтези- рующие клетки растений)

 

Питательные вещества, используемые гетеротрофными мик­роорганизмами . весьма разнообразны. Практически для каждого при­родного органического соединения можно найти микроорганизм, обес­печивающий его разложение. Прокариоты способны утилизировать и многие синтетические вещества, в том числе биоциды. Поэтому мик­роорганизмам принадлежит ведущая роль в круговороте веществ в природе.

Наиболее доступны для гетеротрофов в качестве источника углеро­да разнообразные углеводы, аминокислоты, органические кислоты, нук- леотиды. Источниками азота, фосфора и серы могут служить как органи­ческие (пептиды, аминокислоты, нуклеотиды) так и неорганические со­единения.

Некоторые микроорганизмы не способны синтезировать все орга­нические соединения (витамины, аминокислоты, нуклеотиды), необходи­мые для их роста и размножения. Чтобы обеспечить рост, данные веще­ства необходимо вносить в питательную среду, поэтому они получили название факторов роста. Микроорганизмы, нуждающиеся в каком-либо факторе роста, называют ауксотрофными, не нуждающиеся - прото- трофными. Ауксотрофные штаммы используют в генетических иссле­дованиях как маркерные, а также для микробиологического анализа оп­ределенных веществ.

Для культивирования различных микроорганизмов используют пи­тательные среды разного химического состава, соответствующие тре­бованиям данного вида.

Всякая питательная среда должна удовлетворять следующим тре­бованиям: содержать все необходимые для роста и размножения мик­роба вещества; иметь достаточную влажность; соответствующую ре­акцию среды (рН); быть стерильной, изотоничной для микробных кле­ток, обладать определенным окислительно-восстановительным потен­циалом. Среды должны быть по возможности унифицированными в отношении основных компонентов: содержание суммарного азота аминогрупп, аминокислот и низших полипептидов должно составлять 0,8-1,2 г/л, общего азота 2,5-3 г/л, хлоридов (в пересчете на хлорид натрия) - 0,5-0,8 %.


Среды стерилизуют при различных режимах, в зависимости от со­става (табл. 3).

Таблица 3

Режимы стерилизации питательных сред
Питательные среды Режим стерилизации
  Аппарат Темпе­ратура Время
Простые Автоклав 121°С 20 мин
Сложные: с углеводами, молоком, жела­тином Автоклав 110 °с 15 мин
Автоклав с незакрытой крышкой, или аппарат Коха 100 °с 30-60 мин, 3 дня подряд (дробная сте­рилизация)
Белковые (сывороточные и яичные) с уплотнением Водяная баня 80-85 °С 1 ч, 3 дня подряд
Аппарат Коха 95 °С 1 ч однократно
Белковые (без уплотнения) Водяная баня 58 °С 1 ч, 3-4 дня подряд

 

1.3.4. Кинетика роста

Кинетика роста бактерий отражает их отношение к конкретным ус­ловиям культивирования. Интенсивность роста оценивают путем подсче­та количества клеток или определения биомассы, образовавшихся за оп­ределенный период времени. Типичная кривая роста микробной популя­ции (рис. 3) позволяет определить основные константы, характеризую­щие динамику роста: константу скорости роста

t lg2 -{t-t0)'

где: n — число клеточных делений, К— число клеточных делений за 1 час, N0 - исходная (при tQ) концентрация клеток в популяции, N-концентрация клеток в период времени t; и время генерации

G = - = —, п К

где G - время, необходимое для одного клеточного деления.

Рис. 3. Кривая роста бактерий: 1 - исходная стационарная фаза, в течение которой внесенные в среду клетки адаптируются к новым условиям; 2- фаза ускоренного роста; 3 - логарифмическая или экспоненциальная фаза, когда число клеток растет в геометрической прогрессии; 4 - фаза умень­шения скорости роста; 5 - стационарная фаза максимума; 6 - фаза отмирания

 

1.3.5. Энергетика роста микроорганизмов

Все реакции биосинтеза требуют участия АТФ. Это соединение имеет две макроэргические связи, обладающие высокой реакционной способ­ностью. АТФ служит донором фосфатной группы для множества интер- медиатов метаболизма, переводя их таким образом в активированную форму, что позволяет им участвовать в термодинамически выгодных ре­акциях биосинтеза. Помимо АТФ имеются и другие соединения, имею­щие макроэргические связи, которые участвуют в реакциях биосинтеза: например, ГТФ - в синтезе белков, УТФ - пептидогликана клеточной стен­ки, ЦТФ - фосфолипидов, ацил~КоА функционирует как переносчик ацильных радикалов при синтезе жирных кислот и в реакциях катаболизма.

АТФ образуется в результате двух принципиально различных про­цессов: субстратного фосфорилирования и транспорта электронов при окислительном или фотофосфорилировании.

Брожение. Примером метаболического процесса, при котором АТФ образуется путем субстратного фосфорилирования (переноса богатой энергией фосфатной группы от интермедиата катаболизма на АДФ), яв­ляется брожение. При брожении органические соединения служат как донорами, так и акцепторами электронов. В результате субстрат, подвер­гающийся брожению, превращается в смесь конечных продуктов, состав которых различается в зависимости от особенностей метаболизма данно­го микроорганизма. В соответствии с главными конечными продуктами различают спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, уксуснокислое и др. брожения.

Процессы брожения могут проходить только в анаэробных услови­ях. Микроорганизмы, осуществляющие брожение, подразделяются на строгих и факультативных анаэробов. Строгие анаэробы не могут рас­ти в присутствии кислорода, поскольку не имеют ферментов, разрушаю­щих его токсичные соединения - Н,0, и О, (каталаза и супероксиддис- мутаза). Факультативные анаэробы в присутствии кислорода переходят к аэробному метаболизму, энергетически более выгодному, чем брожение.

Дыхание - это метаболический процесс, идущий с образованием АТФ, в ходе которого донорами электронов служат органические или неорганические соединения, а акцепторами электронов - неорганичес­кие соединения: при аэробном дыхании - молекулярный кислород, а при анаэробном дыхании - сульфаты, нитраты и карбонаты. Отличительная особенность дыхательных процессов - наличие цепи переноси электро­нов, т.е. ряда специфических соединений, способных подвергаться обра­тимому окислению и восстановлению, т. е. принимать электроны от од­ного соединения и передавать их другому. Электроны, отнятые от суб­страта, попадают в эту цепь и по ней достигают конечного акцептора (02, NO 3,S0~~, СО ~~). В ходе этого процесса образуется АТФ путем окис­лительного фосфорилирования, сопряженного с транспортом электронов.

К аэробному дыханию способно большинство микроорганизмов, составляющих нормальную микробиоту человека, и патогенных. Карбо­наты (С02) в процессе анаэробного дыхания используют метанообразую- щие бактерии, сульфаты - виды родов Desulfovibrio, Desulfotomacuium, и др., обитающие в водоемах, где имеются органические осадки и суль­фаты. Восстановление нитратов характерно для многих хемогетеротро- фов, осуществляющих реакции денитрификации

глюкоза + N0 " + Н+ СО, +N, + Н,0 и нитрат-нитритного дыхания

глюкоза + N0 ~ -» СО, + Н,0 + N0 ".

Последний тип дыхания характерен для большинства энтеробакте- рий. Избыток нитратов в пищевых продуктах опасен потому, что в ки­шечнике при их восстановлении с участием бактерий образуются токсич­ные нитриты.

Фотофосфорилирование - это процесс, при котором АТФ образу­ется при переносе энергии света, поглощенного фотосинтетической пиг­ментной системой, через цепь переноса электронов. Большинство фото- синтезирующих организмов (цианобактерии, зеленые растения) исполь­зуют в качестве основного восстановителя воду, при окислении которой образуется кислород (оксигенный фотосинтез). Некоторые фотосинтези- рующие бактерии в качестве восстановителя используют водород или се­роводород (аноксигенный фотосинтез).

Пути образования АТФ у хемоорганотрофов. Одним из основных путей расщепления глюкозы у хемоорганотрофов, например E.coli, явля­ется гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа. Глюкоза поступает в клетку с помощью специфической системы транспорта, сопряженной с фосфорилированием до глюкозо-6-фосфата, который расщепляется до пирувата. Пируват используется в реакции окислительного карбоксили- рования для образования ацетил-КоА. Ацетильный радикал поступает в цикл трикарбоновых кислот или цикл Кребса, где он окисляется до С02, а водород, который при этом образуется, сохраняется в виде восстанов­ленных коферментов (НАДН,, НАДФН,, ФАДН2).

Окисленные формы коферментов регенерируются в дыхательной цепи, где конечным акцептором водорода является кислород. Основными компонентами дыхательной цепи являются белки, несущие простетичес- кие группы, окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) кото­рых лежат между потенциалами НАД (- 0,32В) и молекулярного кисло­рода (+ 0,81В). Таким образом, восстановительные элементы (электро­ны) от НАДН, переходят на кислород по цепи переносчиков с последова­тельно возрастающими значениями ОВП, как бы по каскаду. Компоненты дыхательной цепи располагаются на инвагинантах цитоплазматической мембраны (мезосомах) прокариот и мембранах митохондрий у эукариот.

Другие пути метаболизма углеводов помимо пути Эмбдена-Мейер­гофа или наряду с ним у некоторых микроорганизмов приводят к образо­ванию необходимых для них продуктов.

Важнейшим назначением пентозофосфатного (фосфоглюконат- ного) пути или гексозомонофосфатного шунта являются генерация восстановительного НАДФН,, необходимого для синтеза жидких кислот, стероидов, некоторых антибиотиков, и пентоз (Д-рибозы) для синтеза нуклеиновых кислот.

Кетодезоксифосфоглюконатный путь Энтнера-Дудорова у не­которых микроорганизмов может иметь место как основной (у псевдомо­над) или как запасной. Его суммарное уравнение:

глюкоза пируват (2) + АТФ + НАДФН, (2).

Гликолитический, пентозофосфатный и кетодезоксифосфоглюконат- ный - это основные катаболические пути, в которых органические моле­кулы (клеточное «топливо») расщепляются до определенных промежу­точных продуктов, еще обладающих значительной энергией. Дальнейшее превращение этих веществ с освобождением их энергии происходит при дыхании или брожении.

Люминесценция микроорганизмов, как и других организмов (про­стейших, грибов, насекомых) является окислительным процессом, в ко­тором фермент люцифераза окисляет молекулярным кислородом особый длинноцепочечный алифатический радикал и восстановленный ФМНН2:

RCHO + ФМНН, + О, -» RCOOH + ФМН + Н20 + hn (квант света).

Реакция, приводящая к свечению, требует присутствия АТФ, имеет­ся прямая зависимость между количеством АТФ и интенсивностью све­чения; поэтому тест-систему, содержащую люциферазу, используют для определения АТФ. Реакция биолюминесценции высокочувствительна и может быть использована для определения микробной контаминации продукта, а также для определения микроколичеств токсинов и наркоти­ков, подавляющих свечение.

Метаболизм белка и аминокислот включает процессы протеоли- за (ферментативного гидролиза белка до аминокислот) и отщепления а-аминогруппы аминокислот, которое осуществляется с помощью двух процессов -трансаминирования или окислительного дезаминирования.

Азотфиксчцию - уникальный процесс связывания атмосферного азо­та с образованием аммиака, осуществляют исключительно прокариотичес- кие организмы, число которых достаточно велико. Микроорганизмы, спо­собные к симбиотической (в ассоциации с растениями) и несимбиотичес- кой азотфиксации, обладают особой ферментной системой, включающей белки, азоферредоксин, молибдоферредоксин и катализирующей реакцию:

N2 + H2 + АТФ NH+ + АДФ + Фн.

Круговорот азота в природе (рис. 4) помимо описанных выше про­цессов включает реакцию нитрификации (NH3 -» NO~2 -» NOT), которую осуществляют хемолитотрофные бактерии.

Таким образом, процессы метаболизма микроорганизмов не только обеспечивают их существование, но являются неотъемлемой частью эко­логической системы Земли, а также широко используются в хозяйствен­ной деятельности человека.

Многочисленные представители прокариот могут вызывать заболе­вания у человека (табл. 4), животных и растений. Основы их патогенно- сти рассматриваются в главе 5.

Таблица 4

Нитрификац;
Атмосферный азот Ин­
фиксация азота ™осферы
Синтез белка
Рис. 4. Схема превращений азота в природе 1.4. Возбудители бактериальных заболевание человека
Денитрификация NO?
Бе; [икроорганизмов

Основные возбудители бактериальных заболеваний человека

Морфолого- бнологическая группа Род или вид микроор­ганизма Заболевание
Спирохеты Treponema pallidum Leptospira interrogans Borrelia recurrentis Сифилис Лептоспироз Возвратный тиф
Аэробные (микроаэро- фильные) подвижные спиралевидные бакте­рии Campilobacter Helicobacter Spirillum minor Язва желудка, гастриты То же Содоку (зоонозное заболевание)
Грамотрицательные аэробные (микроаэро- фильные) палочки и кокки Bordetella pertussis Brucella Francisella tularensis Legionella pneumophila Коклюш Бруцеллез Туляремия Легионеллез
Грамотрицательные кокки Neisseria gonorrhoeae N. meningitidis Pseudomonas aerugi­nosa Burkholderia mallei B. pseudomallei Гонорея, эндокардиты, менинги­ты, артриты, септицемия и др. Менингит, назофарингит, септи­цемия Местные и общие нагноитель- ные процессы Сап Мелиоидоз

 

Окончание табл. 4
Морфолого- биологоческая группа Род или вид микроор­ганизма Заболевание
Факультативно- анаэробные грамотри- цательные палочки Сем. Enterobacteriaceae Escherichia Salmonella Shigella Yersinia pestis Y. pseudotuberculosis Y. enterocolitica Klebsiella pneumoniae K. ozenae K. rhinoscleromatis Острые кишечные заболевания и др., эшерихиозы Брюшной тиф, токсикоинфек- ции, сальмонеллезы Дизентерия, шигеллезы Чума Псевдотуберкулез Йерсиниоз Бронхолегочные заболевания Хронические заболевания рес­пираторного тракта Хронические заболевания верх­них дыхательных путей
  Proteus Сем. Vibrionaceae Vibrio cholerae V. parahaemoliticus V. vulnificus Сели Pasreurellaceae Haemophilus influenzae Токсикоинфекшш, нагноитель- ные процессы Холера Пищевые отравления Септицемия Менингит, септицемия, бронхит и др. Мягкий шанкр
  H. ducreyi
Риккетсии Rickettsia Сыпной тиф и др., риккетсиоз
Хламидии Chlamydia Трахома и др., хламидиозы
Грамположительные кокки Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Гнойно-воспалительные процес­сы, токсикоинфекции Пневмония, скарлатина, сепсис и др.
Грамположительные палочки, образующие эндоспоры Bacillus anthracis B. cereus Clostridium tetani CI. perfringens CI. novyi CI. septicum CI. botulinum Сибирская язва Пищевые отравления Столбняк Анаэробная инфекция То же То же Ботулизм
Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы Corynebacterium diphte- riae Actinomyces bovis A. israelii Mycobacterium tubercu­losis M. leprae Дифтерия Актиномикоз То же Туберкулез Лепра
Микоплазмы Mycoplasma pneumoniae M. hominis Болезни органов дыхания, сер­дечнососудистой и центральной нервной систем


ВСЕРОССИЙСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ФГУП ГосНИИгенетика

Н Россия, Москва, 117545 1-й Дорожный проезд, 1

Я Тел: (495)315 12 10 Факс:(495)315 07 74 @ vkpm@genetika.ni В www.genetika.ru

вкпм

(Всероссийская Коллекция Промышленных микроорганизмов)

крупнейшая национальная сервисная коллекция, коллекционный фонд которой насчитывает в настоящее время более 15000 штаммов непатогенных микроор­ганизмов, предназначенных для использования в различных исследовательских и прикладных целях.

ВКПМ имеет статус международного органа по депонированию и является членом всемирной федерации коллекций культур (WFCC) и европейской орга­низации коллекций культур (ЕССО).

Среди коллекционных микроорганизмов: бактерии (в том числе актино- мицеты), дрожжи, мицелиалъные грибы, генетически модифицированные штаммы, плазмиды, илазмидосодержащие штаммы и фаги.

ВКПМ предоставляет различные сервисные услуги исследовательским, промышленным и учебным организациям: депонирование микроорганизмов (депонирование включает в себя передачу штамма в коллекцию с целью регист­рации, хранения и выдачи образца микроорганизма заинтересованным лицам в соответствии с установленными правилами), таксономическая идентификация микроорганизмов, паспортизация микроорганизмов, лиофилизация микроор­ганизмов, выделение микроорганизмов из различных экологических ниш для скрининговых целей, консультации по вопросам длительного хранения мик­роорганизмов, патентного депонирования и патентования микроорганизмов, проведение семинаров и индивидуальных научных стажировок, предоставление культур из коллекции по запросам заинтересованных лиц в соответствии с пра­вилами ВКПМ, осуществление договорных работ.

В ВКПМ работают высококвалифицированные микробиологи, генетики, специалисты по криобиологии и информационным базам данных, патентный поверенный РФ.

В ВКПМ регулярно проходят практику студенты различных учебных за­ведений, выполняющие курсовые и дипломные работы, проводится обучение аспирантов с последующей защитой кандидатских диссертаций по различным тематикам как биотехнологии и микробиологии, так и молекулярной биологии.

ВКПМ активно сотрудничает с отечественными и зарубежными научными центрами в том числе с коллекциями культур.

Глава 2. ГРИБЫ

Грибы составляют особое царство Fungi (Mycota), они обладают признаками, характерными как для растений, так и для животных. При­знаки растений: голофитный способ питания (поглощение питательных веществ через клеточную стенку), способность к синтезу витаминов, на­личие ригидной клеточной стенки, вакуолей, поперечных перегородок в мицелии, полярность клетки, способность к неограниченному росту, раз­множение спорами. Признаки животных: отсутствие хлорофилла, гете­ротрофный тип питания, образование мочевины в ходе азотистого обме­на и гликогена - в процессе углеводного обмена, наличие хитина в кле­точной стенке, формирование лизосом в цитоплазме, особенности пер­вичной структуры цитохромов и тРНК. Своеобразие грибов проявляется не только в сочетании признаков, присущих растениям и животным, но и в наличии специфических черт и свойств, характерных только для чле­нов царства Mycota: мицелиальной структуры вегетативного тела; слож­ных ядерных циклов и плеоморфизма; многоядерности и гетерокариоза (разнокачественность ядер в одной клетке); дикариоза (длительное суще­ствование в одной клетке двух ядер, одновременно делящихся и имитиру­ющих диплоидное ядро).

Разнообразие представителей этого царства отражает их классифи­кация, построенная на основании структурно-химических и морфологи­ческих признаков.

2.1. Морфология и ультраструктура

В ходе жизненного цикла грибов происходит образование вегета­тивных и репродуктивных структур. Вегетативная структура - это мице­лий и его видоизменения. Любая часть мицелия в благоприятных услови­ях может дать начало новой особи.

Репродуктивными называют структуры, специально предназначен­ные для размножения (рис. 5). Репродукционное бесполое размножение происходит с помощью особых клеток - спор, образующихся без участия полового акта. Репродукционное половое размножение включает обмен генетическим материалом при слиянии ядер (кариогамии) и редукцион­ное деление (мейоз), связанные с образованием определенных морфоло­гических структур.


©=


 

 


Рис. 5. Морфология грибов. (Начало) Вегетативные структуры: столоны (1) и ризоиды (2) Rhizopus nigricans; оидии (3) и хламидоспоры (4) Mucor chibinensis; псевдомицелий (5) и бластоконидии (6) Candida spp.; почкующиеся клетки (7) Saccharomyces cerevisiae. Анаморфы: спорангий со спорами (8), спорангиеносец (9), конидиеносец (10), стеригмы (11), конидии (12) Aspergillus spp. (А) и Peniciliium spp. (В) Телеоморфы: сумки с аскоспорами (13) S. cerevisiae (Endomycetes), перитеций, содержащий сумки с аскоспорами (14) Sordariaspp. (Ascomycetes), зигоспора

(15) Mucor spp. (Zygomycetes).

Рис. 5. Морфология грибов. (Окончание)

 

U) Ui


Бесполые репродуктивные структуры называют анаморфами, а по­ловые — телеоморфами. Грибы, имеющие половую стадию развития, на­зывают совершенными. Грибы, в жизненном цикле которых отсутствует половое размножение, называют несовершенными, дейтеромицетами или мшпоспоровыми грибами.

Анаморфы и телеоморфы строго приурочены к определенной фазе жизненного цикла гриба, образуются при наличии особых условий внеш­ней среды и выполняют дифференцированные функции (табл. 5).

Таблица 5 Функциональная и морфологическая дифференцировка таллома
Фаза цикла развития Функция Морфологическая структура
Вегетативная Прорастание Проростковые гифы, почкующиеся клетки
Разрастание по суб­страту Столоны, мицелий, ризоморфы, тяжи
Поселение на хозяи­не Апрессории, гифоподии, инфекцион­ные и перфорационные гифы, гаусто­рии, ловчие гифы
Перенесение небла­гоприятных условий Хламидоспоры, склероции
Репродукцион­ная бесполая Размножение и рас­пространение Спорангиеносцы (спорангиофоры), спорангиеспоры, конидиеносцы (кони- диофоры), конидии, зооспоры
Репродукцион­ная половая Размножение и рас­пространение Гаметы, гаметангии, оогонии, аского- нии, антеридии, трихогины, зооспоры, зигоспоры, аски (сумки), аскоспоры, базидии, базидиоспоры, плодовые тела

 

Клеточная стенка обеспечивает механическую прочность клетки, постоянство ее формы, служит барьером проницаемости и защищает клет­ку от внешних воздействий. Характерная черта клеточной стенки - спо­собность к росту и интенсивной перестройке в течение развития грибов (в их онтогенезе). Компоненты клеточной стенки можно подразделить на две группы: структурные компоненты (сеть микрофибрилл) и соедине­ния, заполняющие пространство между ними (матрикс). Первые представ­лены полисахаридами, включающими полиаминосахара (хитин и хито- зан) и глюканы, имеющие (3-(1,3), Р~(1,4) и (3-(1,б) связи. Вторые являют­ся маннопротеинами, галактоманнопротеинами, глюкуронманнопротеи- нами, ксиломаннопротеинами и а-(1,3) глюканами. У мицелиальных и дрожжевых грибов имеются существенные различия в химическом со­ставе и структуре клеточной стенки. Так, содержание хитина составляет у мицелиальных грибов 0,2-26,2 % от сухой массы клеточных стенок, а у дрожжевых 1-4 %. Помимо полисахаридов в клеточной стенке при­сутствуют белки и липиды. Некоторые белки являются ферментами. Ли- пиды клеточной стенки определяют ее гидрофобность и принимают учас­тие в синтезе компонентов клеточной стенки, активируя хитинсинтетазу.

У многих грибов, особенно дрожжевых, внешняя часть клеточной стенки образует капсулу - сильно оводненный слизистый слой полисаха- ридной природы. В капсуле локализованы многие ферменты, она прини­мает участие в поглощении питательных веществ из субстрата, участвует в адгезии клеток между собой и субстратом, защищает клетку от внешних воздействий (высушивания, радиации и т.п.).

Органеллы грибной клетки характерны для большинства эукари- от. В ней имеется ядро, содержащее наследственную информацию в виде ДНК, оформленной в хромосомы. Ядро заполнено нуклеоплазмой, имеет ядрышко - место синтеза прорибосом, окружено двойной оболочкой (ядер­ной мембраной). Ядерная мембрана имеет поры, которые связывают нук- леоплазму с цитоплазмой.

Митохондрии содержат ферменты дыхательной цепи и окислитель­ного фосфорилирования, а также цикла трикарбоновых кислот, обеспе­чивая энергетические потребности клетки.

Рибосомы 80S частично располагаются в цитоплазме, однако боль­шинство их прикреплено к мембранам эндоплазматического ретикулума, митохондриям и другим органеллам.

Одним из основных компонентов клеточных органоидов являются мембраны. С ними связано большинство метаболических процессов. Они составляют от 40 до 90 % общей массы клеток. Цитоплазматическая мембрана служит осмотическим барьером, в ней локализуется система активного транспорта, она способна к пиноцитозу и фагоцитозу. Эндоп- лазматический ретикулум (ЭР) расположен в цитоплазме в виде сети канальцев, цистерн и трубочек, не имеющих фиксированной ориентации, выполняет транспортную функцию, связывает цитоплазматическую мем­брану с ядерной, образует поверхности раздела в цитоплазме, на его мем­бранах могут располагаться рибосомы.

Аппарат Гольджи представляет собой систему вакуолей, он обес­печивает экскрецию (выведение) по типу обратного пиноцитоза с помо­щью пузырьков, аккумулирующих выводимые продукты, и транспорт ве­ществ, синтезированных в ЭР, к другим органоидам. Кроме того, аппарат Гольджи - место синтеза новых мембран и образования лизосом.

Лизосомы содержат около сотни ферментов, преимущественно гид- ролаз, осуществляющих функцию пищеварения.

Вакуоли образуются из ЭР и выполняют многообразные функции. В них могут накапливаться вредные продукты метаболизма, они участву­ют в компартментализации веществ в клетке (их разделении и концентра­ции), в них накапливаются необходимые клетке метаболиты (полифосфа­ты, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания). Вакуоли обеспечивают тургор клеток. Новообразование мембран ЭР и Гольджи происходит на матрице ядерной мембраны.

Цитоплазма содержит включения, которые служат запасными пи­тательными веществами: гликоген, волютин (полифосфат), липиды.

Цитоскелет наряду с мембранными структурами обеспечивает внутриклеточную организацию и высокую биологическую упорядочен­ность всех метаболических процессов, протекающих в клетке. Цитоске­лет представляет собой развитую сеть белковых нитей (филаментов), из которых наиболее важная роль принадлежит микрофиламентам и мик­ротрубочкам. Те и другие состоят из глобулярных белковых субъединиц, которые в клетке могут легко соединяться между собой и разъединяться. Помимо этого существуют вспомогательные белки, которые либо связы­вают филаменты друг с другом или с другими клеточными структурами, либо влияют на скорость и степень полимеризации филаментов. Цитос­келет связан с движением органоидов клетки и амебоидным движением, присущим некоторым грибам.

Другие подвижные клетки грибов (зооспоры, планогаметы) пере­двигаются с помощью жгутиков. Жгутики грибов по строению отлича­ются от жгутиков бактерий, но сходны с аналогичными органеллами про­стейших и многих подвижных гамет растений и животных.

2.2. Экология

Грибы широко распространены в природе на самых различных суб­стратах. Они предпочитают водные или влажные местообитания, но встре­чаются и в относительно сухих средах. Грибы являются гетеротрофами, потребляют органические соединения углерода. Азот, фосфор, сера, ионы металлов могут поглощаться в неорганической форме. Питательные ве­щества грибы получают, принимая участие в разложении органического вещества или паразитируя на животных и растениях.

Многие грибы переносят значительные изменения температуры, ме- зофильные грибы предпочтительно развиваются в пределах (24±30) °С. Термофильные - в диапазоне (33±55) °С, психрофильные - от -2 °С до +20 °С. Свет, особенно в коротковолновой области, может влиять на спо- роношение грибов.

Экологические группы грибов сформировались в процессе эволю­ции. Сапротрофные грибы принимают участие в минерализации органи­ческих веществ, образовании гумуса, ксилотрофные грибы разлагают древесину, кератинофилы способны жить на волосах, перьях, рогах и т. п. павших животных. Симбиотрофные грибы образуют микоризу, имеющую огромное значение для жизни многих растений. Лишайники - это ста­бильные симбиотические ассоциации гриба с водорослями или циано- бактериями. Грибы - паразиты растений и животных описаны ниже.

Грибы являются активными биодеструкторами, вызывая поврежде­ния разнообразных материалов и изделий, в том числе и фармацевтичес­кой продукции. Содержание грибов в нестерильных лекарственных сред­ствах регламентируется фармакопеей.

Грибы, как и другие организмы, способны существовать в относи­тельно узком диапазоне температур, влажности, почвенных условий и других факторов среды. Эти условия определяют их географическое распространение. Распространению популяций препятствуют географи­ческие преграды (океаны, пустыни, горные цепи) и способствуют агенты, действующие как средства переноса: воздух, вода, животные и человек.

Для некоторых грибов характерна способность обитать длительное время в неизменных и ограниченных зонах - эндемических областях (оча­гах). К таким грибам относятся возбудители глубоких микозов Coccidioides immitis и Paracoccidioides brasiliensis, которые встречаются в зонах с оп­ределенными климатическими условиями (Центральная Америка для пер­вого гриба и Южная Америка для второго). Дерматофиты Trichophyton soudanense обнаруживается только в Африке, a T.concentricum - в Южной Океании. Многие грибы являются космополитами, их можно обнаружить в любой местности, где условия для них окажутся благоприятными. Тако­вы возбудители многих микозов человека и фитопатогенные грибы.

2.3. Использование грибов в промышленности

С древних времен человек использует дрожжи Saccharomyces cerevisiae для изготовления хлеба, пива, вина. В современной промыш­ленной микробиологии грибы служат продуцентами антибиотиков, алка­лоидов, белков, витаминов, гербицидов, ферментов, коферментов, инги­биторов ферментов, полисахаридов, липидов, органических кислот и др. Некоторые дрожжевые грибы используют для получения кормового бел­ка на непищевом сырье. Многие грибы из класса базидиомицетов (макро- мицеты, образующие крупные плодовые тела) обладают целебными свойствами, их культивируют поверхностным и глубинным (в ферментерах) способами и используют как лекарственные препараты и пищевые добавки.

2.4. Грибы - возбудители болезней человека и животных

Грибы могут наносить вред человеку и животным путем отравле­ния их метаболитами, вызывая состояние повышенной чувствительности к различным веществам, входящим в состав их клеток или продуцируе­мым ими (микогенная аллергия), и вызывая инфекционные заболевания (микозы).

Отравление может происходить при поедании ядовитых или испор­ченных грибов, при неправильном приготовлении и хранении шляпоч­ных грибов. Их токсины действуют из пищеварительную, нервную систе­мы или на другие ткани тела.

Другая группа заболеваний, вызванных отравлением метаболитами грибов (микотоксикозы), связана с тем, что токсинообразующие грибы заселяют растения, продуцируя при этом или во время хранения урожая ядовитые вещества, действующие и после переработки растительных про­дуктов в корма или продовольствие.

Микогенные аллергии возникают у чувствительных людей в ответ на антигенные вещества грибов. Они проявляются в виде кожной сыпи, насморка, конъюнктивита, диареи, астматических явлений и т. п. Аллер­генами могут быть клетки мицелия, споры гриба и продукты их обмена или распада. Эти заболевания могут возникать и развиваться у персонала биотехнологических предприятий, использующих грибы как продуцен­ты БАВ, и у населения близлежащих районов за счет загрязнения воздуха при плохой очистке заводских выбросов. Меры предупреждения состоят в строгом соблюдении техники безопасности (защитная одежда, маски, респираторы, герметизация оборудования) и тщательной очистки возду­ха, контактировавшегося с микроорганизмами.

Опасна также работа в складских помещениях, где плесневые гри­бы могут развиваться при неправильном хранении сырья в условиях вы­сокой влажности, образовании конденсата на поверхностях и т. д. Такие помещения должны быть снабжены приточно-вытяжной вентиляцией, а температуру необходимо поддерживать постоянной, чтобы предотвра­тить появление конденсата.

Микозы человека. В последние десятилетия наиболее часто встре­чаются оппортунистические микозы, возникающие при ослабленном им­мунитете и вызываемые условно-патогенными грибами, которые ветре- чаются среди представителей родов Penicillium, Aspergillus, Mucor, Alemaria, Cladosporium, Fusarium, Candida, Geotrichum, Saccharomyces, Rhodotorula, Sporobomyces, Trichosporon и др. Они могут входить в состав нормальной микробиоты человека и животных и активируют свои паразитарные свой­ства под влиянием нерациональной антибиотической и кортикостероид- ной терапии, при использовании иммунодепрессантов и при ослаблении реактивности организма в связи с предшествующим заболеванием.

Наряду с этим существуют и микозы, вызванные патогенными гри­бами. К ним относятся дерматомикозы и глубокие микозы (кокцидиои- доз, паракокцидиоидоз, бластомикоз, гистоплазмоз). Всего патогенных грибов насчитывают около 100 видов, тогда как грибов-оппортунистов - несколько сотен видов.

В табл. 6 приведены наиболее важные возбудители (этиологические агенты) микозов человека. Этиологический агент - либо один паразити­ческий вид, либо группа близких микроорганизмов. Клиническая карти­на микоза сильно варьирует в зависимости от фонового заболевания, ло­кализации очага или тяжести поражения. Например, аспергиллы могут вызывать поражение кожи, подкожных тканей, легких, грибы рода Candida - слизистых оболочек рта и половых органов, кожи, ногтей, бронхов, лег­ких и других органов.

Таблгща 6

Основные возбудители микозов человека
Возбудитель Резервуар Способ заражения Болезнь
Класс Телеоморфа Анаморфа
Basidio- mycetes Filobasidiella neoformans Cryptococ- cus neofor­mans Почва, помет птиц, летучих мышей Вдыхание Криптокок- коз
Asco- mycetes или Deu- teromy- cetes He обнару­жена Madurella spp. Почва, расте­ния Инокуля­ция Мицетома
Ceratocystis stenoceras Sporotrix schenkii Растения, почва Инокуля­ция Споротри- хоз
Различные Dathideales Phialophora spp. Растения, почва Инокуля­ция Хромоми- коз
Различные Eurotiales Aspergillus fumigatus, другие ви­ды Asper­gillus и Penicillium Распростра­нены повсе­местно Вдыхание, инокуля­ция Аспергил- лез


мулов и ослов, a Pityrosporum pachydermatis - дерматомикоз у собак, ко­ров, лошадей, свиней и носорогов. Грибы рода Saprolegnia (Oomycetes) паразитируют на рыбах,

2.5. Фитопатогенные грибы

Грибы, вызывающие заболевания лесных пород и культурных рас­тений, наносят огромный ущерб. Массовые заболевания растений (эпи- фитотии) могут быть причиной голода населения целых стран. Болезни снижают потенциальный урожай на 10-20 % и более. В Центральной Ев­ропе насчитывают до 162 серьезных заболеваний сельскохозяйственных культур. Из них 135 (83 %) вызываются грибами, остальные - бактериями и вирусами. Поражая лекарственные растения, грибы, как и другие мик­роорганизмы, делают их непригодными для использования в качестве сырья в фармацевтической промышленности.

Грибы проникают в ткани растения через устьица или через раны на его поверхности, они способны прорывать поверхностные структуры сво­ими инфекционными гифами. Далее гриб распространяется по растению, что сопровождается появлением симптомов его заболевания. На следую­щей стадии инфекционного процесса гриб развивает органы спороноше- ния, а реакция растения зависит от количества и качества возбудителя за­болевания.

Меры борьбы и профилактики. Некоторые болезни передаются семенами, поэтому важным мероприятием оказывается обеззараживание семян. Одним из источников инфекции являются опавшие на поверхность почвы пораженные растительные остатки. Поэтому эффективна глубокая зяблевая вспашка, способствующая перемещению паразитов вглубь по­чвы, где они погибают под антагонистическим воздействием бактерий и актиномицетов или поедаются простейшими животными. Важное значе­ние имеет сбор и уничтожение опавших листьев, плодов, ветвей, правиль­ный севооборот, препятствующий накоплению в почве заразного начала.

Широко используются меры химической защиты растений. Боль­шое значение имеет правильная обработка почвы и внесение удобрений, что повышает сопротивляемость культурных растений. Весьма важны выведение и подбор устойчивых к заболеваниям сортов, интересны так­же сверхчувствительные сорта, быстрая гибель которых ведет к прекра­щению развития паразитического гриба. Для предупреждения переноса возбудителей из одной страны в другую существуют специальные каран­тинные службы, осуществляющие специальные мероприятия.

Глава 3. ВИРУСЫ И ЛРИОНЫ

Вирусы существенно отличаются от других форм жизни своими размерами, строением генома и особенностями его воспроизводства.

Размеры вирусных частиц (вирионов) находятся в пределах 28-250 нм, их можно рассмотреть только с помощью электронного мик­роскопа. Вирион содержит только один тип нуклеиновых кислот - ДНК или РНК. Вирусы не способны строить свои структурные элементы (бел­ки, нуклеиновые кислоты и др.) из компонентов питательной среды, они не способны расти на питательных средах, а для своего воспроизводства используют метаболические системы клетки хозяина (человека, живот­ного, растения, бактерии), т. е. являются облигатными паразитами.

3.1. Структура вирусов

Вирусная частица (вирион) содержит генетический материал (ДНК или РНК), окруженный белковой оболочкой (капсидом) (рис. 6). ДНК мо­жет образовывать кольцевые или линейные структуры. РНК представле­на одно- или двухнитевыми молекулами, у некоторых вирусов может быть сегментированной. Преимущество сегментированного генома в том, что в дискретных фрагментах содержится информация, которую не способна

Рис. 6. Схематическое изображение структуры вируса гриппа


обеспечить единая молекула. В зависимости от выполняемых функций однонитевые РНК подразделяют на две группы:

1 - РНК способна непосредственно транслировать генетическую

информацию на рибосомы клетки-хозяина, т. е. выполнять функ­ции иРНК, ее обозначают +РНК (плюс-нити РНК, позитивный геном).

2 - РНК вируса не способна функционировать как иРНК, а служит

матрицей для образования +РНК, ее обозначают -РНК (минус- нити, негативный геном).

Ретровирусы содержат+РНК, на матрице которой фермент реверта- за (РНК-зависимая ДНК-полимераза) синтезирует ДНК-провирус, инте­грирующий в клеточный геном.

Капсид защищает геном от внешних воздействий, например, от дей­ствия нуклеаз клетки хозяина. На его поверхности располагаются систе­мы распознавания рецепторов клетки хозяина и адсорбции на ее поверх­ности. Обычно это гликопротеиды, молекулы которых в виде ворсинок окружают вирион. Вирусы бактерий - бактериофаги часто имеют особые структуры, облегчающие их проникновение внутрь клетки. Некоторые вирусы в составе вириона имеют ферменты, участвующие в разрушении оболочки клетки хозяина (фаговый лизоцим) или в репликации его гено­ма (например, вирус иммунодефицита человека содержит обратную транс- криптазу). Капсид построен из идентичных белковых субчастиц - капсо- меров. Субъединичная структура обеспечивает экономию генетического материала, а также самосборку вириона за счет нековапентных межмоле­кулярных взаимодействий подобно процессу кристаллизации. Кроме того, такая структура способствует освобождению генетического материала внутри клетки хозяина путем диссоциации нековалентно связанных суб­частиц. Форма вириона определяется характером самосборки капсоме- ров и может быть кубической, спиральной или соединять несколько струк­турных компонентов. На поверхности белкового капсида многие вирусы млекопитающих имеют липопротеиновую оболочку, которая обычно об­разуется из мембраны клетки хозяина.

3.2. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина

ДНК хозяина
Передача фага дочер­ним клеткам

Б актер и а ф ига (фаги)-это вирусы бактерий (прокариот). Их генети­ческий материал содержится в головке, имеющей белковую оболочку. Хво­стовые нити и зубцы предназначены для распознавания рецепторов на по­верхности бактериальной клетки и адсорбции на ней. Распознавание спе­цифично не только для вида бактерии, но и для штамма, что служит осно­вой для фаготипирования бактерий. У некоторых фагов хвост имеет чехол, покрывающий стержень. После адсорбции фага на клетке чехол сокраща­ется, проталкивая стержень внутрь. Через стержень фаговая НК проникает внутрь клетки. Процесс облегчается благодаря местному повреждению кле­точной стенки фаговым лизоцимом. Таким сложным органом инфицирова­ния обладают лишь некоторые фаги грамотрицательных бактерий. На кле­точной стенке грамположительных бактерий имеются рецепторные участ­ки, которые способствуют проникновению в клетку крупных молекул и бактериофагов. Чувствительное место для атаки - это пили, к которым фаги могут прикрепляться. Некоторые фаги впрыскивают в клетку свою НК, другие проникают интактными. По типу взаимодействия с бактериаль­ной клеткой фаги подразделяют на вирулентные и умеренные (рис. 7). Ви­рулентные фаги размножаются внутри клетки. Созревшие частицы фага изнутри разрушают клеточную стенку и выходят наружу, клетка при этом погибает. Умеренные фаги также способны лизировать бактерии, однако, в большинстве клеток популяции они существуют в клетке в виде профа- га— фаговой НК, которая подобно плазмидам может интегрировать с хро-

Вирусная ДНК летка хозяина


 

Репликация ви­ Индукция  
русной ДНК - \ 1   Профаг
  / ~    
Сборка частиц фага Лизис клетки хо­зяина и выход фага

Вирусная ДНК, интег­рированная в хромосо­му хозяина

 

; гнг

Рис, 7. Скема развития вирулентного (А) и умеренного (В) бактериофагов

мосомой, что обеспечивает ее передачу дочерним клеткам. Лизогенные (несущие умеренный фаг) бактерии невосприимчивы к заражению теми фагами, которыми они лизогенизированы, а также близкородственными фагами. Эта невосприимчивость связана с образованием особого репрес- сора, препятствующего размножению фага. Этот же репрессор препят­ствует переходу профага в активное состояние и синтезу фаговых белков. Спонтанно лизогенные бактерии лизируются редко (10"М0"5 в одной ге­нерации). Частота лизиса зависит от внешних условий, например, состава питательной среды. Мутагены (ультрафиолетовые лучи, Н,0 , митоми- цин С и др.) могут индуцировать массовое развитие зрелых фаговых частиц в клетках лизогенной культуры, связанное с нарушением механизма репрес­сии. Мутации также могут быть причиной перехода умеренного фага в виру­лентное состояние. Такие мутанты оказываются устойчивыми к репрессору или утрачивают способность вызывать синтез репрессора в клетке.

Обычно лизогения - это весьма стабильное состояние, однако, не­которые клетки способны утрачивать фаг и вместе с этим резистентность к данному типу фага.

Лизогения - чрезвычайно распространенное явление: большая часть штаммов бактерий несет в себе НК одного или нескольких фагов, которая определяет фенотипические показатели культуры (морфологические, куль- туральные, антигенные, токсигенные и др.). Это явление носит название фаговой конверсии.

Инфекционные фаги, продуцируемые лизогенной культурой, спо­собны лизогенизировать другие штаммы данного вида бактерии (или близ­кородственных видов). При переходе из интегрированного с бактериаль­ной хромосомой состояния в автономное геном фага может включить в свою структуру соседние гены нуклеоида клетки донора и перенести их в другую клетку (реципиент). Это явление носит название трансдукции. Путем трансдукции могут быть переданы многие важные признаки бакте­рий: резистентность к антибиотикам, вирулентность, токеигенность и др.

Практическое использование фагов. Фаги широко используются в генетической инженерии в качестве векторов - переносчиков генов в процессе создания рекомбинантных молекул ДНК. В медицине фаги на­значают с профилактической и лечебной целью при дизентерии, брюш­ном тифе и других энтеральных заболеваниях, при гнойно-воспалитель­ных процессах и дисбактериозе. Широко используют фаги в диагностике инфекционных заболеваний и идентификации микроорганизмов. Реакция нарастания титра специфичного фага указывает на присутствие соответ­ствующего вида микроорганизма в объектах внешней среды (вода, пище­вые продукты и т.п.)- Метод фаготипирования позволяет установить био- вар бактерии и тем самым выявить источник инфекции. Поскольку мно­гие вещества, вызывающие индукцию профага и переход его в активное состояние, являются онкогенными, лизогенные культуры бактерий могут быть использованы для выявления потенциальных канцерогенов.

Вирусы млекопитающих. По сравнению с бактериофагом, лити- ческий цикл которого завершается в пределах 30 мин, вирусы млекопита­ющих размножаются медленно, в культуре ткани цикл репликации зани­мает от 4 до 24 час и включает стадии адсорбции, проникновения внутрь клетки и процесс образования зрелых вирусных частиц.

Адсорбция обусловлена двумя механизмами: неспецифическими (электростатическими и ван-дер-ваальсовыми силами) и специфически­ми, более прочными, представляющими собой взаимодействие рецепто­ров вируса с соответствующими рецепторами клетки по принципу био­логического узнавания.

Проникновение вирусов млекопитающих внутрь клетки зависит от природы вируса. На поверхности вирионов многих групп вирусов, на­пример, гриппа имеются особые шипы, содержащие нейраминидазу и ге- магглютинин, которые участвуют в проникновении вириона в клетку. Вирусы оспы и герпеса поглощаются клеткой, как при фагоцитозе.

Депротеинизация (высвобождение вирусной НК) происходит с участием ферментов клетки хозяина.

Синтез вирусных НК и белков определяется природой вируса. У ДНК-геномных вирусов процесс начинается с синтеза ранней иРНК с участием РНК-полимеразы клетки хозяина или вириона. На матрице ран­ней РНК синтезируются ранние белки, необходимые для последующей репликации ДНК. Репликация также происходит под действием клеточ­ных или вирусных ферментов. На матрице реплицирующейся ДНК про­исходит синтез поздних иРНК, которые направляют синтез белков вируса.

У РНК-геномных вирусов, содержащих +РНК, последняя транслиру­ется на рибосомах клетки хозяина. Вирусная -РНК используется как мат­рица для построения с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы комп­лиментарной копии +РНК, которая функционирует как информационная.

Необходимым этапом жизненного цикла ретровирусов является ин­теграция его генома в форме ДНК-провируса в хромосому хозяина. Син­тез ДНК-провируса на матрице вирусной +РНК происходит с участием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Интегриро­ванная в одну из хромосом хозяина вирусная ДНК транскрибируется кле­точной РНК-полимеразой. Ретровирусы часто являются онкогенными, поскольку включение их ДНК в геном клетки-хозяина вызывает ее пере­рождение. По этой же причине онкогенными могут быть и ДНК-геном- ные вирусы.

Самосборка вириона-это физико-химический процесс, в результа­те которого формируется капсид с встроенной в него НК. У вирусов, име­ющих наружную оболочку, формирование вирионов происходит на кле­точной мембране, компоненты которой входят в состав оболочки вируса.

Выход вирионов у одних вирусов сопровождается гибелью клетки, у других - только частичным повреждением мембраны.

Многие вирусы патогенны для человека (табл. 7), животных и рас­тений.

Таблица 7

Возбудители вирусных болезней человека

Вирусы Геном Заболевания
Герпесвирусы 2 н ДНК линейная Герпес, ветряная оспа, опоясывающий лишай, инфекционный мононуклеоз, энцефалит и др.
Паповавирусы 2 н ДНК циклическая Папилломы и полиомы
Аденовирусы 2 н ДНК линейная Конъюнктивиты, гастроэнтериты
Поксвирусы 2 н ДНК Оспа и др.
Парвовирусы 1 н ДНК Анапластический криз у детей
Гепаднавирусы 2 н ДНК неполная кольцевая Гепатит В
Ортомиксовирусы 1 н РНК сегментированная Грипп
Парамиксовирусы 1н РНК ' Парагрипп, корь,
  несегментированная эпидемический паротит и др.
  линейная  
Пикорнавирусы +РНК несегме нти ро ван н ая Полиомиелит, менингит, OP3
Рабдовирусы 1 н РНК Бешенство и др.
Тогавирусы 1н+PHK Гепатит С, лихорадка, краснуха, энцефалиты
Буньявирусы 1 н -РНК сегментированная Лихорадки, энцефалиты
Аденовирусы 1 н -РНК сегментированная Геморрагические лихорадки, менингиты, гриппоподобные заболевания
Филовирусы 1 н-РНК Геморрагические лихорадки
Коронавирусы 1 н +PHK Гастроэнтериты,
  несегментированная респираторные инфекции

 

Олончание табл. 7

Вирусы Геном Заболевания
Калицивирусы 1 н +РНК несегментированная Гепатит Е, гастроэнтериты
Реовирусы 2 н РНК сегментированная Лихорадки, острые энтериты
Ретровирусы +РНК, состоящая из 2-х Злокачественные заболевания,
  идентичных субъединиц Т-клеточные лимфомы, мелопатии, СПИД
Неклассифицированные вирусы:
Вирус гепатита D 1 н РНК Гепатит D
Астро вирусы 1 н РНК Диарейные инфекции у детей

 

3.3. Культивирование вирусов

Культивирование вирусов в лабораторных условиях является эта­пом диагностики многих вирусных болезней, кроме того, оно необхо­димо для получения вакцинных препаратов. Поскольку вирусы явля­ются облигатными паразитами, они способны размножаться только в живых клетках, например, в культуре ткани (клетках тканей челове­ка или животных, растущих на питательном субстрате, обычно в виде монослоя на плоской поверхности сосуда). Присутствие вирусов мож­но обнаружить по цитопатическому эффекту (ЦПЭ), т. е. разрушению монослоя клеток. Метод позволяет идентифицировать вирус, напри­мер, в клиническом материале, с помощью иммунной сыворотки. Спе­цифическая сыворотка нейтрализует вирус, и ЦПЭ в ее присутствии не будет проявляться.

Вирусы выращивают также путем заражения лабораторных живот­ных или эмбрионов птиц.

3.4. Действие химических и физических факторов на вирусы.

Принципы создания антивирусных препаратов

Нагревание - наиболее эффективный способ уничтожения вирусов. Большинство вирусов, патогенных для человека, погибает при 60 °С в течение 30 минут; однако вирус гепатита В выдерживает эту температу­ру в течение 4 часов. Вирусы выдерживают глубокое охлаждение и могут храниться при температуре от^Ю °С до -70 °С. Высушивание губитель­но для некоторых вирусов, на других оно не действует. Ультрафиолетовое облучение инактивирует вирусы, повреждая их НК, что может быть ис­пользовано при изготовлении вирусных вакцин.

Вирусы, имеющие липидную оболочку, инактивируются органичес­кими растворителями (хлороформом, эфиром); это явление используют при классификации вирусов. Многие химические дезинфектанты, исполь­зуемые против бактерий (фенолы, спирты, ЧАС) малоэффективны про­тив вирусов. Наиболее активны хлор, гипохлориты, йод, альдегиды и ок­сид этилена.

Для профилактики и лечения вирусных инфекций применяют им- мунопрепараты и химиотерапевтические средства. По спектру действия и клинической значимости препараты, применяемые для лечения вирус­ных заболеваний, подразделяют на следующие группы: этиотропные, иммуномодулирующие, патогенетические (направленные на борьбу с интоксикацией, обезвоживанием, поражениями органов, аллергически­ми реакциями, а также на профилактику бактериальных осложнений) и симптоматические (купирующие соответствующую симптоматику, на­пример, головную боль, кашель). Симптоматическую и патогенетическую терапию проводят практически в 100 % случаев, тогда как этиотропные химиотерапевтические средства применяют ограниченно. Причиной это­го являются трудности создания препаратов, избирательно подавляющих репродукцию возбудителя и не затрагивающих процессы жизнедеятель­ности организма хозяина. Большинство ингибиторов вирусспецифичес- ких процессов, тесно связанных с клеточным метаболизмом, оказывают­ся токсичными.

Тем не менее, определены этапы жизненного цикла некоторых ви­русов, подавление которых мало влияет на клетки хозяина. Прежде всего, это адсорбция и проникновение вируса в клетку, депротеинизация НК и некоторые процессы, связанные с синтезом НК, трансляцией и сборкой вириона.

Антивирусные химиотерапевтические вещества отличаются уз­ким спектром активности (в пределах одного вида или семейства), число их ограниченно (табл. 8).

А мантадин,ремантадин - трициклические симметричные ада- мантамины активны против вирусов гриппа А и коревой краснухи. Эти вещества взаимодействуют с белком М2 вируса, что приводит к блокаде слияния оболочки клетки и вируса и проникновения нуклеокапсида в ци­топлазму. Кроме того, они блокируют первичную транскрипцию и акти­вацию гемагглютинина. Препараты проявляют профилактическое действие при приеме до заражения и на ранних стадиях инфекции.

Таблица 8 Спектр активности противовирусных препаратов, зарегистрированных в РФ
Препараты Показания к применению
Адапромин Грипп А и В
Азидотимидин Вич-инфекция, СПИД
Амантадин Грипп А
Амбен  
Аминокапроновая кислота Арбидол Грипп А и В, респираторная вирусная инфекция
Ацикловир Видарабин Герпес, опоясывающий лишай
Ганцикловир Герпес, цитомегилия
Дейтифорин Грипп А, респираторная вирусная инфекция
Идоксиуридин Герпес
Марборан Оспа
Оксолин Грипп, герпес, риновирусные инфекции
Пандовир Герпес
Ремантадин Грипп А
Рибавирин Респираторная вирусная инфекция, гепатит С, лихорадка Ласса
Теброфен Трифторидин Герпес, аденовирусные поражения глаз
Тромантадин Герпес
Флюреналь Герпетические и аденовирусные поражения глаз
Фоскарнег Герпес, цитомегалия, гепатит В, ВИЧ-инфекция
Хельпин Герпес, ветряная оспа
Цитарабин Цитомегалия

 

Видарабин (аденинарабинозид) - наименее токсичный и наибо­лее эффективный из аналогов пуринов, блокирует сборку ДНК, его ин- термедиат ингибирует вирусную ДНК-полимеразу. Применяют при лече­нии герпетических инфекций,

Цитозинарабинозид - аналог видарабина более токсичный, с меньшей избирательностью действия. Применяют при химиотерапии опухолей.

Гомогенизированные производные дезоксиуридина - йодоксиу- ри дин, три фтор и дин (трифтортимидин)фосфорилизуются вирус­ной тимидинкиназой и встраиваются в ДНК вируса, что приводит к обра­зованию дефектных вирусных белков. Применяются местно при герпети­ческих кератитах.

Аналоги нуклеозидов, избирательно активируемые вирусспеци- фической тимидинкиназой -ацикловир, фамцикловир, ганцик- л о в и р обладают избирательным действием на инфицированные вируса­ми клетки. Для активации необходимо их превращение в макроэргичес- кий трифосфат, который ингибирует вирусную ДНК-полимеразу. Первый этап фосфорилирования индуцирует вирусспецифическая тимидинкина- за. Нативная форма препаратов неактивна, поэтому они не влияют на син­тез ДНК в незараженных клетках. Применяют при герпетических инфек­циях, назначают внутрь, внутривенно и в виде глазной мази.

Ингибиторы обратной транскриптазы активны против ретрови- русов, включая ВИЧ. Зидовудин (азидотимидин), зальцитабин (ди- дезоксицитидин),диденозин (дидезоксиинозин),ставудин (дидегид- родезокситимидин) действуют как конкурентные ингибиторы фермента, кроме того, прекращают элонгацию при синтезе белка на рибосомах. Об­ладают значительной токсичностью.

Ингибиторы протеаз - негидролизующиеся синтетические пепти­ды с акцинавир,ратон авир,инд и навир конкурентно взаимодейству­ют с протеазами ВИЧ, в результате чего в ВИЧ-инфицированных клетках накапливаются нерасщепленные предшественники gag-полипротеинэ, проявляющие цитотоксическое действие. Используют в сочетании с ин­гибиторами обратной транскриптазы у ВИЧ-инфицированных больных.

Нуклеозидные аналоги широкого спектра. Рибавирин - аналог гуанозина, действует на РНК- и ДНК-геномные вирусы. Разрешен для ле­чения тяжелых респираторных инфекций у детей и других заболеваний. Вызывает побочные эффекты, включая подавление иммунитета.

Фоскарнет (тринатриеваясольфосфорномуравьинойкислоты)ин­гибирует активность обратной транскриптазы и всех ДНК-полимераз гер- песвирусов и возбудителя гепатита В. Применяют для лечения герпети­ческих инфекций.

Nj-метилизатин-р-тиосемикарбазон (метизазон, марбо- ран) угнетает синтез поздних иРНК и поздних полисом у поксвирусов. Применяется для лечения оспы.

Устойчивость вирусов к химиотерапевпшческим препаратам. Вирусам, как и всем живым существам, присуща способность адаптиро­ваться к изменяющимся условиям внешней среды, в том числе и к дей­ствию биоцидов. Адаптация происходит как в результате селекции устой­чивых штаммов, сформировавшихся в ходе предшествующей эволюции, так и в результате селективного отбора вновь возникающих штаммов. Обычно устойчивость связана с модификацией структуры мишени пре­парата. Преодоление развития резистентности в условиях клиники воз­можно при комбинированном применении препаратов с различными ме­ханизмами действия и при использовании препаратов, воздействующих на разные этапы репродукции вируса.

Интерфероны и индукторы интерфероное.

Интерфероны (ИФН) обладают универсально широким спектром антивирусной активности, поскольку действуют не на вирионы или их НК, а индуцируют антивирусное состояние клетки, стимулируя образова­ние комплекса белков, блокирующих транскрипцию вирусной иРНК. ИФН не проникают в клетки, а взаимодействуют с мембранными рецепторами, индуцируя образование цАМФ, передающего сигнал на соответствующий оперон ДНК. Кроме того, ИФН активируют гены, кодирующие продукты с прямым антивирусным действием - протеинкиназы, нарушающие сборку белковой молекулы, и аденилатсинтетазы, продукт которых активирует эндонуклеазу, разрушающую вирусные иРНК. Гамма-ИФН активирует ци- тотоксические лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, макрофаги, гранулоциты, способствующие уничтожению инфицированных клеток.

Медицинские препараты ИФН делятся на природные и рекомбинан- тные, их эффективность при различных заболеваниях указана в табл. 9.

Томища 9

Противовирусная активность препаратов ИФН
Типы ИФН Препараты Эффективны при заболеваниях
Природные:
а-ИФН (альфа-ферон ы) Лейкоцитарный ИФН человека, эгиферон, виллферон, лейкинферон Гепатиты В, С и Д, папилломавирусные заболевания, ВИЧ- инфекция, СПИД
Р-ИФН (бета-фероны) Фибробластный ИФН человека, ферон Гепатит С, герпес, папилломавирусные заболевания, ВИЧ- инфекция, СПИД, рассеянный склероз
у-ИФН (гаммафероны) Иммунный ИФН человека (у-ИФН) Гепатит В. папилломавирусные заболевания
Рекомбинантные:
а2А Реаферон, роферон, виферон, реальферон Гепатиты В, С и Д, герпес, опоясывающий лишай, папилломавирусные заболевания, ВИЧ- инфекция, СПИД

 

Окончание табл. 9
Типы ИФН Препараты Эффективны при заболеваниях
а2В Интрон, инрек Гепатиты С и Д, герпес, папилломавирусные заболевания, ВИЧ- инфекция, СПИД
а2С Берофор Гепатит В, опоясывающий лишай, папилломавирусные заболевания
Р Рекомбинантные р-ИФН (бетафероны) Рассеянный склероз

 

Спектр противовирусной активности индукторов ИФН

Индукторы ИФН - это весьма разнородная по составу группа при­родных и синтетических соединений, способных вызывать в организме образование собственного (эндогенного) ИФН. Подобно ИФН они обладают универсально широким спектром противовирусной активности (табл. 10), а также иммуномодулирующим действием, которое определяет их эффек­тивность при многих невирусных заболеваниях.

Таблица 10
Препарат Показания к применению
Акриданоны (циклоферон, не- овир) Грипп, энцефалиты, бешенство, ВИЧ- инфекция, СПИД
Флюореноны (амиксин) Грипп, ОРВИ, герпес, гепатит А, энцефа­литы, бешенство, рассеянный склероз
Поли(И): поли(У) - амплиген ВИЧ-инфекция, СПИД
Поли(Г): поли (Ц) - полигуацил Грипп, гепатит В, энцефалиты, бешенство
Двухспиральные РНК (ларифан, ридостин) Грипп, ОРВИ, герпес, энцефалиты, бешен­ство
Поли(А): поли(У) - полудан Герпетические поражения глаз
Полифенолы (мегасин, кагоцел, саврац, рагосин, гозалидон) Грипп, ОРВИ, герпес, энцефалиты, бешен­ство, гепатиты, энтеровирусные инфекции


3.5. ПриОНЫ

3.5.1. Прионы как инфекционные агенты

Прионы - это гликопротеины, которые способны индуцировать в нормальном клеточном белке конформационный переход в конформер с инфекционной активностью. Источником нормального белка является сама клетка, в которой постоянная экспрессия гена PRNP создает пул белка РгРс - нормального компонента клеточных мембран. Контакт с инфекци­онным прионом PrPsc (sc - скрепи) вызывает переход нормального белка в конформационное состояние PrPsc. Этот переход осуществляется в пе­риод посттрансляционного процессинга предобразованного нормально­го клеточного белка.

Нормальный белок РгРс локализуется в цитоплазматической мемб­ране и участвует в функционировании сигнальных систем клеток, в част­ности нейронов, и предположительно в биогенезе и развитии нервной системы. Его конформационная модификация вызывает нарушение этих процессов. Кроме того, конформеры индуцируют апоптоз инфицирован­ных клеток и генерируют нейротоксические полипептиды, предположи­тельно образующие поры в нейронах и связывающие нуклеиновые кис­лоты, а также блокируют репликацию митохондрий, вызывая их дегене­рацию. Последнее лежит в основе многих неврологических заболеваний.

Заболевания, вызываемые прионами, характеризуются поражением центральной нервной системы: болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Гертсманна-Штреуссера-Шейннера, семейная смертельная бессонница, куру, скрепи овец и коз, трансмиссивная губчатая энцефалопатия коров и др. Источником инфекции являются ткани больного организма. Зараже­ние человека возможно алиментарным путем, атакже при использовании лекарственных препаратов, полученных из тканей больных животных, или недостаточно обезвреженных медицинских инструментов. У коров и овец инфекционные агенты передаются через корма, содержащие ткани погиб­ших животных.

Для заболеваний, вызванных прионами, характерен очень длитель­ный инкубационный период. Развитие инфекции тесно связано с функци­ями генома и жизнедеятельностью клеток, обеспечивающих накопление белка PrPsc и постепенное прогрессирующее развитие симптомов, кото­рое может затягиваться на месяцы и годы.

Для прионных заболеваний характерно практически полное отсут­ствие иммунного ответа в связи с высокой консервативностью первичной структуры белка; эти инфекции не реагируют на иммуномодулирующую терапию, хотя делаются попытки получить иммунопрепараты, воздейству­ющие на отдельные этапы формирования конформированных белков.

3.5.2. Прионы в фармацевтической практике

Прионы представляют собой индивидуальные белки с молекуляр­ной массой от 20 до 30 кДа при длине полипептидной цепи около 254 аминокислотных остатков. Они фильтруются через фильтры с диа­метром пор 25-50 нм.

Прионы стабильны при температуре 90 °С в течение 30 мин, инак- тивируются только при автоклавировании при 135 °С в течение 30 мин. Однако описаны случаи инфицирования при применении автоклавиро- ванного медицинского инструмента (стоматологического, отоларинголо­гического, нейрохирургического). Прионы резистентны к воздействию хи­мических агентов (глутаровый альдегид, формальдегид, в-пропиолактон, этанол, толуол, ксилол), нуклеазам, УФ и ионизирующей радиации. Ме­нее резистентны к ацетону, натрия гидроксиду, ионным Детергентам типа натрия додецилсульфата, фенолу, хлороформу, сильным окислителям, эти- леноксиду, протеазам.

Прионы имеют ограниченный спектр хозяев, но способны адапти­роваться к новому хозяину, т. е. преодолевать межвидовые барьеры.

Опасность распространения прионных заболеваний представляет серьезную проблему для фармацевтической деятельности, включая конт­роль поставщиков животного сырья (недопущение получения сырья из регионов, где наблюдались случаи трансмиссивной губчатой энцефало­патии крупного рогатого скота) и выбор способа стерилизации. Для тер­мостабильного медицинского оборудования, загрязненного материалом, содержащим прионы, ВОЗ рекомендует погружение в раствор натрия гид- роксида (1н) или натрия гипохлорита (20000 ррпт активного хлора) на 1 час с последующим автоклавированием, очисткой и обычной стери­лизацией.

Методы контроля полноты инактивации прионов трудоемки, дли­тельны и дорогостоящи, они предусматривают заражение животных ин­фицированной тканью, подвергнутой воздействию биоцида, и математи­ческий расчет концентрации биоцида и времени, необходимых для инак­тивации приона. Поэтому на практике необходимо строго соблюдать рег­ламентированный режим обработки, гарантирующий качество стерили­зации.

Глава 4. ПРОСТЕЙШИЕ

Простейшие (Protozoa) - это одноклеточные эукариотические орга­низмы, которые имеют значительно более сложную функциональную орга­низацию по сравнению с бактериями и грибами. Их размеры составляют от 3 до 200 мкм. Наиболее крупные раковинные корненожки достигают 2-3 см в диаметре.

Снаружи тело простейших покрывает эластичная мембрана - пел­ликула. У некоторых видов клеточная мембрана может включать опор­ные фибриллы, и даже минеральный скелет. Органоиды идентичны орга­ноидам клеток других эукариот. Специфическими органоидами движе­ния являются псевдоподии, жгутики и реснички (рис. 8).

Всего насчитывают до 25000 видов простейших. Из них патогенными для растений, животных и человека являются около 7000 видов. Виды, пато­генные для человека, входят в состав 3-х типов - Sarcomastigophora, Apicom- plexa и Ciliophora. Пути проникновения патогенных простейших в организм человека аналогичны таковым для других патогенных микроорганизмов.

4.1. Споровики

Споровики принадлежат к типу Apicompiexa, классу Sporozoa, ко­торый составляют только паразитические виды. Для них характерны как исключительно половой путь развития, так и чередование полового и бес­полого циклов, обычно связанных с переменой хозяев. Своим названием споровики обязаны способности образовывать особые структуры, защи­щенные плотной оболочкой, условно называемые спорами. Наибольший ущерб здоровью человека наносят малярийные плазмодии и токсоплаз- мы, поражающие до 35% населения Земли.

Род Plasmodium включает более 100 видов, паразитирующих в орга­низмах рептилий, птиц и животных. Четыре вида патогенны для человека и вызывают малярию: Plasmodium vivax - возбудитель трехдневной ма­лярии, P. malariae - возбудитель четырехдневной малярии, P. falciparum - возбудитель тропической малярии, P. ovale - возбудитель малярии овале (типа трехдневной).

Жизненные циклы различных видов плазмодиев практически одинаковы, включают бесполую стадию (шизогония), проходящую в орга­низме человека, и половую стадию (спорогония) в организме переносчи­ка - самок комаров рода Anopheles.



Спорогония происходит в клетках эпителия кишечника комара и продолжается 1-3 нед. Процесс начинается с проникновения мужских и женских гамет (гамонтов) в организм комара с кровью больного. Гамон- ты сливаются попарно в зиготы, проникающие в стенку кишки и образу­ющие там ооцисты. Содержимое ооцист многократно делится с образо­ванием спорозоитов (веретенообразные клетки длиной 11-15 мкм), дис- симинирующие по всему организму насекомого. Часть из них проникает в слюнные железы комара, делая его переносчиком болезни.

Тканевая шизогония плазмодия происходит в гепатоцитах че­ловека и продолжается 1-2 недели. Спорозоиты проникают в клетки пече­ни с кровотоком через час после кровососания. Там они делятся, образуя мерозоиты (каждый спорозоит может образовать от 2000 до 40000 мерозо- итов), разрушающие гепатоциты и проникающие в кровоток.

Эритроцитарная шизогония происходит после проникнове­ния мерозоитов в эритроциты, где они превращаются в трофозоиты (рас­тущие формы) размером 2 мкм; микроскопия пораженных эритроцитов выявляет покоящиеся формы, содержащие ядро с одним хроматиновым зерном, и формы с псевдовакуолью, внешне напоминающие кольцо или перстень. Трофозоиты позднее увеличиваются и образуют многоядерные шизонты (делящиеся формы). Шизонты образуют новое поколение меро­зоитов, инфицирующих другие эритроциты. Каждый шизонт может об­разовать от б до 24 дочерних мерозоитов. Выход мерозоитов из эритроци­тов сопровождается их разрушением. Лихорадка наблюдается в момент выхода мерозоитов из разрушенных эритроцитов. Цикл развития для P. malariae составляет 72 часа, для других видов - 48 час. С завершением цикла размножение P. malariae и P. falciparum в печени прекращается, тог­да как у P.vivax и P.ovale часть спорозоитов (гипнозоиты) остается в гепа­тоцитах, образуя дремлющие очаги, дающие отдаленные рецидивы.

В некоторых эритроцитах развиваются женские и мужские гамон- ты, завершающие свое развитие только в организме комара в течение 7^45 сут. (в зависимости от температуры воздуха).

Toxoplasma gondii - внутриклеточный паразит, морфологически напоминающий вытянутую дольку апельсина, длина 4—7 мкм, один конец закруглен. Распространен повсеместно, вызывает токсоплазмоз. Зараже­ние человека происходит алиментарным путем при проникновении ооцист и тканевых цист (при употреблении полусырых мясных продуктов, с не­мытыми овощами и фруктами), через кожу и трансплацентарно. Инфици- рованность населения разных стран составляет от 4 до 68 %; возбудитель выделен практически от всех млекопитающих и многих птиц.

Жизненный цикл включает стадии полового и бесполого размно­жения. Первичные и основные хозяева-домашние кошки и другие предста­вители семейства кошачьих, в организме которых происходит половое раз­множение возбудителя. Первичное заражение кошек происходит при поеда­нии грызунов, содержащих ооцисты, из которых выходят паразиты - споро- зоиты, проникающие в клетки кишечника и превращающиеся в трофозоиты, размножающиеся делением (шизогония). Половое размножение также про­исходит в клетках слизистой оболочки кишечника. Образовавшиеся в резуль­тате шизогонии мерозоиты трансформируются в гаметоциты. Слияние раз­нополых гаметоцитов приводит к образованию зиготы (ооцисты). Ооцисты - округлые образования с плотной оболочкой размером 9-14 мкм, выделяются с испражнениями, длительно сохраняются в почве.

В организме человека происходит бесполый цикл размножения. Из ооцист выходят спорозоиты, активно поглощаемые макрофагами (не­завершенный фагоцитоз). С макрофагами они диссиминируют по лимфа­тическим сосудам. В макрофагах происходит процесс шизогонии, на по­здней стадии которой макрофаги погибают, а освободившиеся паразиты (тахизоиты) инвазируют в клетки организма (подвержены любые ядросо- держащие клетки).

Большинство случаев токсоплазмоза протекает бессимптомно, од­нако у людей с иммунодефицитами он приобретает тяжелый, преимуще­ственно фатальный характер.

Род Sarcocystis представлен кокцидиями, близкими к токсоплазмам, также имеющими несколько хозяев. Человек заражается, поедая терми­чески недостаточно обработанную говядину или свинину, содержащую саркоцисты, при этом может развиваться кишечный или мышечный сар- коцистоз.

Род Babesia включает виды, патогенные для животных и человека, вызывающие бабезиозы - маляриеподобные заболевания, особенно час­то у спленэктомированных пациентов.

Род Cryptosporidium объединяет виды, паразитирующие в эпители­альных клетках кишечника теплокровных. Заражение происходит с за­грязненной водой и пищей. У пациентов с иммунодефицитами вызывают хронические поражения желудочно-кишечного тракта.

4.2. Саркодовые


Саркодовые включены в тип Sarcomastigophora, класс Lobosea, от­ряд Amoebia. Это наиболее примитивные организмы, в большинстве сво- бодноживущие, но некоторые обитают в кишечнике человека и живот­ных. Среди патогенных амеб наиболее распространена Entamoeba hictolytica.

Род Entamoeba включает единственный патогенный для человека вид - Е. hictolytica, вызывающий амебиаз (амебную дизентерию). Возбу­дитель существует в виде различных форм.

Большая вегетативная форма - крупная (20-60 мкм) клетка. От прочих амеб отличается толчкообразным поступательным движени­ем, при котором образует псевдоподии. Выделяется с испражнениями при остром амебиазе.

Тканевая форма - мелкая (20-25 мкм) патогенная форма инвази- рует стенку толстой кишки с развитием специфических поражений.

Просветная форма - основная форма существования, обра­зует цисты.

Цисты - неподвижные круглые (8-15 мкм) прозрачные образова­ния, иногда содержат хроматоидные тельца (скопления РНК и протеинов). При окрашивании раствором Люголя видны 4 ядра в виде колец.

Жизненный цикл. Основной хозяин - человек. Просветные фор­мы амебы обитают в верхнем отделе толстой кишки, питаясь бактериями и клеточным детритом. Пассивно передвигаясь с кишечным содержимым, проникают в дистальные отделы кишечника и при определенных услови­ях (обезвоживание, нарушение микробного ценоза, изменение рН) обра­зуют цисты.

Из кишечника цисты попадают в воду, на руки, в пищу (переносятся мухами) и проникают в организм человека. В тонкой кишке оболочка ци­сты растворяется, каждое ядро делится, образуя 8 дочерних особей.

Амебы проникают в подслизистую оболочку кишечника, нарушая межклеточные взаимодействия, образуют некротоксин, разрушающий эпителиальные клетки и вызывающие некроз прилежащих тканей. Аме­бы проникают в кровеносные и лимфатические сосуды, а из них и в дру­гие органы.

Менее распространены другие патогенные виды саркодовых: Naegleria fowled вызывает амебный менингоэнцефалит; амебы родов Acanthamoeba и Hartmarella - возбудители спорадических заболеваний, проявляющихся некротическими поражениями кожи, роговицы и внут­ренних органов, наиболее часто у ослабленных лиц или у пациентов с иммунодефицитами. Они обитают в воде, колонизируют увлажнители кондиционеров, что может приводить к попаданию амеб в воздух.

4.3. Жгутиконосцы

Отличительной чертой представителей этого класса является нали­чие жгутиков, обеспечивающих их движение. У некоторых видов эту фун­кцию выполняет ундулирующая мембрана - тонкая перепонка, образо­ванная продольным соединением одного из жгутиков с телом простейше­го. Жгутиконосцы включают большое количество видов, паразитирую­щих в организме человека, однако патогенными признаны лишь некото­рые из них.

Trichomonas vaginalis имеет грушевидное тело 14-30 мкм длиной, удлиненное ядро, смещенное в передний конец и вакуолизированную ци­топлазму. На переднем кону имеется 4 жгутика и ундулирующая мембра­на, доходящая до середины тела. Сквозь все тело проходит осевая нить - аксостиль, выступающая на заднем конце в виде шипика.

Вызывает трихомоноз (трихомониаз), передающийся половым путем.

В организме человека обитают и другие трихомонады: Т. tenax - комменсал ротовой полости и Т. hominis - комменсал толстой кишки.

Giardia lamblia (Lamblia intestinalis) имеет грушевидное тело 5-15 х 9-21 мкм, толщина 2-4 мкм, существует в виде вегетативной фор­мы - трофозоита, образует цисты.

Трофозоиты имеют 2 ядра, 4 пары жгутиков, расположенных сверху, снизу, сзади и на боковых поверхностях. В верхнепереднем отделе распо­ложен присасывательный диск, окруженный фибриллами, для прикреп­ления к клеточному эпителию. Пищу всасывают всей поверхностью тела. Размножаются продольным делением. Обитают в верхних отделах тон­кой кишки.

Цисты неподвижные овальные, длина 10-14 мкм, имеют 4 ядра и присасывательный диск, выделяются с испражнениями.

Вызывав гиардиоз (лямблиоз), протекающий в виде латентного паразитоносительства, проявляется преимущественно в виде дисфункций кишечника.

Род Leishmania. Все виды этого рода - облигатные внутриклеточ­ные паразиты млекопитающих, у человека некоторые виды вызывают лей- шманиозы. Выделяют 4 группы возбудителей.

Жизненный цикл. Лейшмании проходят две стадии развития: безжгутиковую и жгутиковую. Жгутиковые формы (промастиготы) под­вижные, развиваются в теле насекомого-переносчика (москита). Тело вере­тенообразное длиной 10-20 мкм. Размножаются продольным делением.

Безжгутиковые формы (амастиготы) паразитируют в клетках мле­копитающих. Клетки овальные длиной 2-6 мкм. Размножаются простым делением.

Переносчиком заболевания служат москиты родов Phlebotomus и Lutzomyia, которые заражаются при кровососании на больных людях и животных. В первые же сутки заглоченные амастиготы в кишечнике москита превращаются в промаетиготы, размножаются и через 6-8 сут. скапливаются в глотке москита. При укусе человека или животного воз­будитель внедряется в клетки кожи или внутренних органов (в зависимо­сти от вида лейшманий), где промаетиготы превращаются в амастиготы.

Род Trypanosoma

Все виды патогенны для млекопитающих, у человека вызывают три- паносомозы, инфекции, весьма напоминающие лейшманиозы. Жизнен­ный цикл возбудителя проходит в организме человека и животных, у ко­торых трипаносомы вызывают тяжелые, часто смертельные заболевания.

Тело трипаносом продолговатое, узкое, имеет жгутики и ундулиру- ющую мембрану. Размножаются исключительно бесполым путем - про­дольным либо множественным делением (шизогония).

Цикл развития связан с полиморфизмом и переменой хозяев. В ки­шечнике насекомых-переносчиков трипаносомы существуют в форме э п и - мастигот - вытянутых клеток, у которых жгутик начинается в передней части тела, ундулирующая мембрана не выражена. В крови человека и животных циркулируют трипомастиготы - удлиненные клетки, жгутик которых начинается в задней части, ундулирующая мембрана выражена четко.

Dientamoeba fragilis длительное время считали непатогенной аме­бой, позднее была установлена его принадлежность к жгутиконосцам. Вызывает диареи. В кишечнике человека присутствует в амебоидной без­жгутиковой форме. Наличие цист не установлено, но доказан факт пере­дачи заболевания от человека человеку.

4.4. Инфузории

Из всех видов инфузорий, обитающих в кишечнике человека, безус­ловно патогенным видом является Balantidium coli, вызывающим балан- тидиаз (инфузорную дизентерию).

Вегетативная форма представляет собой ресничную инфузорию, тело вытянутое, яйцеобразное, 30-100x30-150 мкм. Питается бактериями, гри­бами и другими пищевыми частицами, для заглатывания которых служит цитостом (клеточный рот), окруженный ресничками. Ядерный аппарат представлен большим и малым ядром.

Цисты округлые с тонкой оболочкой, в окружающей среде могут сохраняться несколько недель. В. coli обитает в кишечнике свиней, для которых малопатогенна. Цисты выделяются с испражнениями. Источник заражения - загрязненные вода и пища.

Больных и носителей не следует рассматривать как источник зара­жения, так как в организме человека цисты образуются редко, а зараже­ние вегетативными формами практически невозможно.

4.5. Лечение протозойных инфекций

Метаболизм простейших как эукариотических организмов близок к метаболизму высших животных, что уменьшает количество мишеней для фармакологического воздействия, и делает простейших нечувствитель­ными к большинству антибактериальных препаратов. Способность к фор­мированию резистентности у простейших, особенно у малярийных плаз­модиев, выражена более чем у бактерий.

Основные препараты для лечения протозойных инфекций приведе­ны в табл.11.

Таблица 11

Препараты для лечения протозойных инфекций
Препарат Заболевание
Метронидазол Амебиаз, трихомониаз, циклоспоридиоз, гиардиоз
Хинакрин гидрохлорид Гиардиоз
Иодохинол Носительство Entamoeba histolytica; инфекции, вызванные Dientamoeba fragilis
Амфотерицин В Первичный амебный менингоэнцефалит; поражения ЦНС, вызванные акантоамебами; лейшманиозы
Пропамедин изотионат в комбинации Акантамебные кератиты
с неомицином  
Нифуртимокс Американский трипаносомоз
Аллопуринол Американский трипаносомоз, лейшманиозы
Сурам и н Африканские трипаносомозы
Меларсопрол то же
Эфлорнитин то же

 

Окончание табл. II
Препарат Заболевание
Стибиоглюконат натрия, метлумин антимонат (пятивалентные соединения окиси сурьмы) Лейшманиозы
Хлорохин Неосложненные формы малярии
Гидроксихлорохин Малярия
Фансидар (сульфадоксин- пириметамин) Осложненные формы малярии, вызванные хлорохинрезистентными плазмодиями
Примахин Малярия, для элиминации возбудителя из печени
Прогуанил Профилактика малярии
Хингхаосу (артемизинин) Малярия
Пириметамин Токсоплазмоз
Триметоприм-сульфаметоксазол то же
Доксициклин Малярия, балантидиаз
Клиндамицин Малярия, амебиаз
Тетрациклины то же

Глава 5. ОСНОВЫ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ.

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ

5.1. Патогенность и вирулентность

Патогенные (pathos —страдание, болезнь) или болезнетворные мик­роорганизмы способны вызывать заболевания (человека, животных, рас­тений). Патогенными могут быть бактерии, грибы, простейшие, вирусы.

Условно-патогенными называют микроорганизмы, вызывающие заболевания в неблагоприятных для макроорганизма условиях. Для чело­века такими условиями могут оказаться переохлаждение, радиация, нару­шение питания, интоксикация, другое заболевание и т. п.

Патогенность - это потенциальная способность определенных видов микроорганизмов вызывать инфекционные заболевания, видовой генетически детерминированный признак, результат эволюционного при­способления микроорганизма к паразитическому существованию.

Вирулентность - это степень патогенности данного штамма, его индивидуальный признак, изменяющийся под влиянием внешних усло­вий. Вирулентность можно повысить пассажами (последовательным за­ражением) через восприимчивых животных, или ослабить путем воздей­ствия неблагоприятных для микроорганизма факторов (иммунных сыво­роток, биоцидов и т. п.). Последнее используют для получения авирулен- тных вакцинных штаммов. Кроме того, вирулентность можно изменить методом генетических рекомбинаций.

5.2. Факторы защиты и агрессии

Патогенность и вирулентность микроорганизма связана с генетичес­ки детерминированными особенностями его структуры и метаболизма. Гены вирулентности образуют кластеры (островки патогенности) в хро­мосомах и плазмидах, способные к горизонтальному переносу. Сходные гены вирулентности обнаруживаются у таксономически далеких видов. Патогенность и вирулентность определяется способностью микроорга­низма уклоняться от защитных механизмов своих хозяев и продуциро­вать вещества, определяющие их инвазивность (способность к распрост­ранению в организме) и агрессивные свойства. Все эти особенности но­сят название факторов вирулентности или факторов защиты и агрессии.

Существуют разнообразные способы избежать действия защитных меха­низмов хозяина.

• Включение генома некоторых вирусов в хромосому хозяина с после­дующей вертикальной передачей (наследованием).

• Локализация паразитов (вирусов, возбудителей туберкулеза, лепры, бруцеллеза, лейшманиоза и др.) в клетках иммунной системы (мак­рофагах, лимфоцитах).

• Синтез иммунодепрессантов, т. е. веществ, подавляющих синтез и активность антител, комплемента, лизоцима, активность иммуно- компетентных клеток.

• Изменение поверхностных антигенов инфекционного агента в сто­рону сближения с антигенами хозяина (молекулярная мимикрия).

• Антигенная изменчивость паразита на протяжении инфекционного процесса, связанная с генетической рекомбинацией с участием фа­гов, плазмид, транспозонов, IS-элементов, позволяет микробам ускользать от иммунной системы хозяина.

• Образование устойчивых к внешним воздействиям стадий покоя (спо­ры, цисты).

• Особенности клеточной поверхности, обусловливающие защиту клетки: капсула у патогенных клебсиелл, клостридий, иерсиний, стрептококков, возбудителя сибирской язвы; внешняя мембрана у грамотрицательных бактерий; корд-фактор микобактерий тубер­кулеза; Fc-рецепторные белки стафилококков и стрептококков и др. Капсула защищает микробные клетки от фагоцитоза, обеспечивает их прикрепление к тканям организма. Липополисахариды внешней мембраны блокируют антитела, обладают свойствами эндотоксинов. Корд-фактор (липид, димиколат трегользы) обеспечивает склеива­ние клеток, их кислотоустойчивость. Fc-рецепторные белки, неспе­цифически связывающие иммуноглобулин, защищают клетку от дей­ствия специфических антител, подавляют фагоцитоз и иммунный ответ, инактивируют систему комплемента.

• Ворсинки (пили) обеспечивают адгезию клеток и образование мик­роколоний. Адгезия происходит за счет особых белков или глико- протеинов, названных адгезинами, которые расположены на клеточ­ной поверхности, часто на пилях, и взаимодействуют с эукариоти- ческой клеткой по типу лектинов, осуществляющих углевод-белко­вое узнавание. Это взаимодействие является лиганд-рецепторным, где роль лиганда выполняет адгезин, а рецептора - соответствую­щая структура углеводной природы на клетке хозяина. Механизм био­логического узнавания лежит в основе специфичности как процесса поражения ткани микробом, так и функционирования защитных сил организма.

• Подвижность является существенным фактором инвазии, она обес­печивает проникновение микроорганизмов в клетки и ткани. Токсины. По локализации различают экзо- и эндотоксины. Экзотоксины синтезируются возбудителями столбняка, ботулизма, анаэробной инфекции, дифтерии, коклюша, холеры, чумы, а также неко­торыми видами шигелл, стафилококков, стрептококков, псевдомонад и др. Это протеины, которые вырабатываются клеткой в виде неактивных предшественников, их активация проходит по типу ограниченного проте- олиза под действием ферментов микробной клетки или хозяина. В резуль­тате активации токсины приобретают ферментативную активность АДФ- рибозилтрансферазы, которая запускает каскад реакций, ведущих к нару­шению синтеза циклического АМФ, а, следовательно, к нарушению регу­ляции синтеза белка в клетке хозяина. Многие экзотоксины обладают из­бирательным действием на органы и ткани: дифтерийный токсин повреж­дает надпочечники и мышцу сердца, столбнячный - двигательные нервные клетки. Экзотоксины действуют на восприимчивый организм в малых дозах, например, в 1 мл дифтерийного токсина содержится 10000 Dim для морской свинки (Dim токсина - его минимальная доза, которая убивает подопытное животное). Некоторые из них термоустойчивы, не разруша­ются под влиянием пищеварительных ферментов (ботулинический, ста­филококковый). Воздействие формалина, блокирующего аминогруппы активного центра, приводит к потере токсичности, что используется для приготовления вакциных препаратов - анатоксинов.

Эндотоксины прочно связаны с клеткой и могут выделяться в сре­ду только после ее разрушения. Обычно это гликоконъюгаты (липополиса- хариды, гликопротеины, гликолипопротеины) клеточной стенки, чаще - внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Важную роль в ток­сичности этих веществ играет липид А. Их токсичность проявляется зна­чительно в более высоких концентрациях, чем экзотоксинов. Эндотокси­ны обладают пирогенным действием, на чем основан метод их определе­ния, например, в инъекционных растворах. Эндотоксины способны акти­вировать систему комплемента, систему свертывания крови, влияют на ферментные системы организма, нарушая углеводный обмен, функции печени и др. Рецепторы эндотоксинов присутствуют на мембранах тром­боцитов, макрофагов, лимфоцитов, эндотелия капилляров. Действие эн­дотоксинов зависит от их концентрации: в малых дозах они способны активировать фагоцитоз и другие защитные реакции организма, с чем свя­зано применение некоторых из них в качестве иммуномодуляторов (пи- рогенал).

Ферменты патогенности катализируют реакции, ведущие к обра­зованию токсичных продуктов или разрушение клеток и тканей организма.

Лецитиназа С (фосфолипаза). Clostridium perfringens гидролизу- ет лецитин (фосфолипид) клеточных мембран, повреждая эритроциты, и другие клетки, вызывая некроз тканей.

Нейраминидаза холерного вибриона, возбудителей анаэробной инфекции, стрептококков, вируса гриппа и др. гидролизует соединения, содержащие сиаловые кислоты. Эти вещества обусловливают вязкость органических жидкостей, участвуют в агрегации клеток, процессах био­логического узнавания, внутриклеточного транспорта и др., поэтому дей­ствие нейраминидазы может привести к нарушению разнообразных фун­кций организма.

Фибринолизин и гиалуронидаза у стрептококков и других микроорганизмов являются факторами распространения, облегчая мик­робным клеткам проникновение в ткани организма. Гиалуронидаза гид­ролизует гиалуроновую кислоту - сложный мукополисахарид, придаю­щий вязкость межклеточному веществу. Поэтому фермент может быть использован для совместного введения с лекарственными препаратами для ускорения их проникновения в ткани, для ликвидации рубцов и т. п.

Гемолизины и лейкоцидины стафилококков и стрептококков разрушают эритроциты и лейкоциты.

Плазмокоагулаза стафилококков и других микроорганизмов - пептидаза, активирующая систему свертывания крови путем каталити­ческого превращения протромбина в тромбин, обеспечивает создание за­щитного фибринового чехла вокруг микробных клеток.

Уреаза пневмококков, клебсиелл, иерсиний гидролизует амиды с образованием токсичного иона аммония.

Декарбоксилазы возбудителей анаэробной инфекции и других микроорганизмов катализируют реакции с образованием токсичных аминов.

5.3. Инфекционные болезни

Инфекционные болезни - это группа заболеваний, вызываемых па­тогенными микроорганизмами - вирусами, бактериями, простейшими. Общим признаком для большинства инфекционных болезней является возможность передачи возбудителя от больного здоровому и возможность их массового (эпидемического) распространения. В результате взаимо­действия с возбудителем в организме развивается совокупность физиоло­гических (адаптационных) и патологических процессов, сопровождаю­щихся нарушением гомеостаза. Симбиотические взаимоотношения, на­носящие хозяину вред, называют антагонистическим симбиозом, край­ним проявлением которого является паразитизм. Облигатными внутри­клеточными паразитами являются вирусы, риккетсии и хламидии.

Источником инфекции является среда, в которой возбудитель за­болевания может обитать и размножаться в естественных условиях. Забо­левания, основным источником возбудителя которого является человек, называются антропонозами; заболевания, передающиеся от животных - зоонозами. Сапронозы - заболевания, вызванные микроорганизмами, оби­тающими в воде, почве и других объектах внешней среды. Возможны слу­чаи заражения из разных источников (от человека или животного и от зараженных объектов внешней среды, благоприятных для размножения возбудителя). Так почва может служить источником возбудителей саль- монеллезов, дизентерии, сибирской язвы, столбняка, анаэробной инфек­ции; вода - кишечных инфекций, туляремии, гепатита А; пищевые про­дукты - кишечных инфекций, туберкулеза, бруцеллеза, скарлатины, диф­терии, пищевых токсикоинфекций.

Пути проникновения инфекционного агента в организм определя­ются его природой. Возбудители кишечных инфекций проникают через рот с водой и пищей; респираторных - через дыхательные пути; через кровь (укусы насекомых, загрязненные инструменты, инъекционные ра­створы) передаются малярия, риккетсиозы, энцефалит, СПИД, гепатит В и др.; через кожу и слизистые оболочки - дерматомикозы, венерические болезни. Возбудители чумы, сибирской язвы, туберкулеза, дифтерии, скар­латины способны проникать в организм любым из перечисленных путей. Некоторые заболевания способны передаваться от матери плоду, т. е. вер­тикально. Передача возбудителя (сифилиса, гонореи, брюшного и возврат­ного тифа, токсоплазмоза, стафилококков и др.) может осуществляться через плаценту или при прохождении через родовые пути.

Эпидемиология инфекционных заболеваний. Инфекционные забо­левания могут распространяться вертикально (от одного поколения к дру­гому) и горизонтально (среди неродственных членов популяции). В слу­чае горизонтальной передачи инфекционного агента заражение может происходить из какого-то общего источника (вода, пищевые продукты) или от человека к человеку, когда каждый индивидуум служит источни­ком инфекции для других. При заражении из общего источника наблюда­ется резкий скачок заболеваемости, сходные инкубационный период и течение инфекционной болезни у всех больных. При передаче инфек­ционного агента от больного здоровому происходит постепенное нарас­тание числа заболевших, а инкубационный период и течение болезни за­висят от индивидуальной чувствительности индивидуума.

Факторы, определяющие возникновение эпидемии, это:

a) инфекционность возбудителя (способность к быстрому рас­пространению и преодолению защитных сил организма);

b) плотность популяции в данном регионе;

c) число чувствительных индивидуумов в данной популяции.

Изменение хотя бы одного из этих факторов влияет на возможность

возникновения эпидемии. Например, эпидемические вспышки кори, вет­ряной оспы в начале осени среди детей, возвращающихся в школу после каникул, связаны с концентрацией чувствительных индивидуумов в од­ном месте. Возможность возникновения эпидемии снижают или предотв­ращают профилактические прививки (снижение числа людей, чувстви­тельных к данному заболеванию).


ЧАСТ Ь II. АНТИМИКРОБНЫЕАГЕНТЫ

X И VI ЙО ГЕ PA I IЕ ВП1Ч ЕСКИ Е ПРЕПАРАТЫ 6.1. Антибиотики Термин «антибиотический» впервые употребил в 1889 г. Поль Вюп- емен, говоря об антагонистических взаимоотношениях…

Глава 11. ДЕЗИНФЕКТАНТЫ, АНТИСЕПТИКИ И КОНСЕРВАНТЫ

Дезинфектанты, антисептики и консерванты - это химические ве­щества, которые способны убивать микробные клетки или угнетать их рост.

Дезинфектанты используются для обработки помещений, изделий или материалов.

Антисептики применяют для обработки кожи и слизистых оболо­чек человека, поэтому они не должны быть токсичными в используемых концентрациях.

Консерванты включают в состав фармацевтических препаратов, чтобы предупредить их микробную деградацию и поддерживать количе­ство содержащихся в них микроорганизмов на низком и безопасном уров­не. Эффективная концентрация консерванта в готовом лекарственном сред­стве должна быть значительно ниже токсичной для человека дозы.

11.1. Факторы, определяющие выбор антимикробного агента

Свойства химического вещества. Эффективность действия био­цида определяется его химической природой, концентрацией, температу­рой, рН и продолжительностью контакта с зараженным объектом. Если вещество используется как антисептик, следует учитывать его токсичность.

Характер микробиоты определяет эффективность действия хими­ческого агента. Имеет значение чувствительность микроорганизма к дан­ному веществу и уровень микробной контаминации. На практике не все­гда возможно определить, какие микроорганизмы присутствуют в дезин­фицируемом объекте, поэтому эффективность действия антимикробного агента оценивают в отношении наиболее устойчивых видов (табл. 15).

Влияние факторов окружающей среды. Органические вещества (кровь, гной, молоко, остатки пищи и т. п.) резко снижают эффективность биоцидных агентов путем их адсорбции, инактивации, или препятствуя их проникновению в микробные клетки. Поэтому по мере возможности перед дезинфекцией оборудование, посуда, инструменты должны быть тщательно вымыты. Многие материалы (ткани, резина и другие полимер­ные материалы) могут адсорбировать биоциды, снижая их концентрацию. Активность биоцидов требует присутствия воды, обеспечивающей их проникновение в клетку, и зависит от содержания в ней ионов.

Таблица 15

Антибактериальная активность некоторых химических веществ (35)

  Активность против Уровень антибакте­
Класс соединения М. tuberculo­sis спор риально» активно­сти в рабочих концентрациях
Фенолы
хлороксифенол - - низкий
бисфенолы - - низкий
Спирты
этанол, + - средний
изопропанол      
Альдегиды
глутаральдегид + + высокий
формальдегид + + высокий
ортофталиевый + + высокий
Галогены      
гипохлорит, + + высокий
хлорамины      
йод, йодофоры + + высокий
Водорода пероксид + + высокий
Надуксусная кислота + + высокий
Бигуаниды
хлоргексидин     средний
ЧАС
бензалкониума хло­ - - средний
рид      
цетримид - - средний
СоединенияHg
тиомерсал (мертиолат) низкий

 

11.2. Применение биоцидов

Биоцидные агенты широко применяются в качестве дезинфектан- тов. Они обладают в той или иной мере токсическими свойствами, по­этому работа с ними требует строгого соблюдения правил техники безо­пасности и мер предосторожности (табл. 16).

Химические вещества, используемые как антисептики, оказывают бактериостатическое или бактерицидное действие, которое проявляется дос­таточно быстро; при правильном применении они не оказывают вредного воздействия на организм человека. В медицинской практике они использу­ются для обработки кожи, инфицированных ран, местно для профилактики и лечения некоторых инфекционных заболеваний. В фармацевтическом про­изводстве антисептики применяются для гигиенической обработки рук.

Таблица 16

Особенности некоторых дезинфектантов и антисептиков

Биоцид Влияние на активность органиче­ских ве­ществ Опти­мум рН Условия примене­ния* Другие особенности
Этанол слабое   1900 мг/м3 -8ч Избегать попада­ния в глаза; плохая проникающая спо­собность: горючий
Изопропа- нол слабое 1225 мг/м3 - 10 мин 980 мг/м3 -8ч -
Глутаро- вый альде­гид слабое 0,7 мг/м3 - 10 мин Опасен для глаз, кожи, органов ды­хания. Не обладает коррозирующей ак­тивностью. Приме­нение в вентили­руемом помещении, использовать сред­ства индивидуаль­ной защиты
Формаль­дегид умеренное 0,7 мг/м3 < 10 мин Опасен для органов дыхания
Хлоргек- сидин сильное 7^8   Опасен для глаз, слизистых оболо­чек. Не совместим с анионными детер­гентами
Гипохло- рит сильное <7 3 мг/м3 - 10 мин 1,5 мг/м3 -8ч Опасен для глаз, кожи. Корродирует металлы
Водорода пероксид слабое или умеренное <7 3 мг/м3 - 10 мин 1,5 мг/м3 -8ч Раздражает кожу, слизистые. Может вызвать повышение давления в контей­нере
Препараты иода сильное <7,0 1 мг/м3 < 10 мин Вызывает раздра­жение глаз; корро­зию металлов

 

Окончание табл. 16
Биоцид Влияние на активность органиче­ских ве­ществ Опти­мум рН Условия примене­нии* Другие особенности
Растворы фенола умеренное <7,0   Опасен для глаз и кожи; абсорбирует­ся резиной и пла­стмассой
Хлорокси- ленол сильное   38 мг/м3 - 10 мин 19 мг/м3 -8ч Абсорбируется ре­зиной и пластмас­сой
Цетримид, бензалко- ниума хлорид сильное >7,0   Опасны для глаз, несовместимы с анионными детер­гентами

Примечание: * — предельно допустимые значения концентрации биоцида в воздухе и времени пребывания человека в рабочей зоне.

 

Консерванты вводят в состав как стерильных, так и нестерильных лекарственных средств (табл. 17) для предотвращения роста микроорга­низмов, попадающих в них во время технологического процесса, или при неоднократном употреблении. Они не должны использоваться, чтобы за­маскировать низкое качество производства. Учитывая возможность по­бочного действия, консерванты следует применять только при строгой необходимости. Требования к консервантам:

• широкий спектр антимикробной активности;

• быстрота биоцидного действия;

• отсутствие взаимодействия с компонентами лекарственного средства;

в стабильность;

• отсутствие раздражающего или токсического действия биоцида или продуктов его распада.

Однако немногие вещества отвечают этим идеальным требованиям. При использовании консерванта следует учитывать ряд факторов, влияю­щих на эффективность его действия: микробная нагрузка, температура, рН, состав лекарственного средства.

В мультифазной системе консервант распределяется неравномерно в соответствии с его гидрофильной или гидрофобной природой. Консер­вант может адсорбироваться на материале первичной упаковки, что сни­жает его активность. Концентрация летучих веществ (хлороформа) мо­жет снижаться при повторном открывании контейнера.

Таблица 17
Консервант Лекарственные формы и средства Концентрация, %
Альдегиды
Формальдегид Парентеральные
Дерматологические 0,05 - 0,2
Ронгалит Парентеральные 0,05
Гуанидина производные
Хлоргексидина ди- ацетат Мази до 0,1
Глазные, назальные, ушные капли 0,005-0,01
Хлоргексидина ди- гидрохлорид Глазные и назальные ЛС 0,005-0,01
Кислоты неорганические и их соли
Кислота борная Глазные и назальные капли в ^многодозовых контейнерах  
Натрия метабисуль- фат Парентеральные  
Натрия сульфит    
Кислоты органические и их натриевые соли
Кислота бензойная Оральные 0,1-0,2
Кислота дегидроаце- товая Глазные и нозалъные капли, инъек­ционные ЛС 0,2
Кислота салицило­вая ЛС наружного действия 0,1-0,5
Кислота сорбиновая Оральные и дерматологические мази 0,005 - 0,2
0,2
Ртути органические соединения*
Мертиолат (тимеро- сал) Иммунобиологические препараты, назальные, ушные, глазные, инъек­ционные ЛС 0,01-0,02
Фенидртугь азотно­кислая Глазные капли 0,1-0,2
Инъекционные ЛС 0,001 -0,002
Фенилртуть борно­кислая Глазные, назальные, инъекционные ЛС 0,002 - 0,004
ЛС наружного действия 0,01
Фенилртуть уксус­нокислая Глазные, назальные, ушные, инъек­ционные ЛС 0,002 - 0,005
ЛС наружного действия 0,007-0,01

 

Консерванты лекарственных средств

Примечание: * - органические соединения ртути могут обладать нейротокси- ческим действием, вызывать кератопатию, поэтому их не рекомендуют для длитель­ного применения. В производстве вакцин в настоящее время мертиолат заменяют феноксиэтанолом или другими альтернативными соединениями.

Применение биоцидов в комбинациях. Поскольку не существует идеального биоцида, сочетающего широкий спектр антимикробной ак­тивности, низкую токсичность, отсутствие корродирующего действия, ста­бильность, совместимость с другими веществами, улучшить их свойства удается путем сочетанного применения. Например, используют комбина­ции спиртов с хлоргексидином, ЧАС, гипохлоритом и препаратами иода.

ЧАС и фенолы используют в сочетании с альдегидами, что позволя­ет снизить концентрацию последних и их раздражающее действие. Для некоторых соединений, например, пероксидов, отмечен синергидный эф­фект при их совместном применении. Введение (инкорпорация) биоцид- ных агентов (соединения серебра, бигуаниды, триклозан) в материалы медицинского назначения и синтетические трансплантанты позволяет пре­дупредить образование на них микробных пленок. Полезно совместное применение физических и химических биоцидов (ультразвуковая обра­ботка в сочетании с альдегидами и бигуанидами, ультрафиолетовое облу­чение - с водорода пероксидом). Разработана новая технология получения моющих и дезинфицирующих средств, основанная на электрохимической активации разбавленных водных растворов натрия хлорида, приводящей к образованию свободных радикалов, обладающих высокой биоцидной ак­тивностью (НСЮ, С1СГ, С102, СЮ", С1-, НО,, но-, Н202, 03,02% О').

11.3. Оценка эффективностидезинфектантов, антисептиков и консервантов

11.3.1. Динамика дезинфекции

Процесс гибели микробных клеток, помещенных в среду с антимик­робным агентом, может быть изображен графически (рис. 10).

При этом возможна ситуация, когда процесс гибели будет подчи­няться законам кинетики первого порядка (А) и эффективность дезин­фекции можно оценить, используя константу:

и- 1 1 N ^ = - log —,

t N о

где: К - константа скорости гибели клеток; N0 - начальное число живых клеток; N - число живых клеток в момент времени t.

Однако чаще наблюдаются случаи, когда график представляет сиг- моидную кривую (В), отражающую гибель наименее устойчивой части популяции в начальный период, гибель основной части популяции, обла-

Рис. 10. Динамика гибели микробных клеток в среде с дезинфектантом

 

дающей средним уровнем резистентности, в средний период и сохране­ние наиболее устойчивых клеток в конечной стадии эксперимента.

При высокой концентрации дезинфектанта происходит быстрая ги­бель основной части популяции в начальный период времени (С).

Генетическая неоднородность бактериальной популяции не позво­ляет использовать законы кинетики первого порядка для оценки эффек­тивности дезинфектантов, однако методы, основанные на определении количества живых клеток или времени гибели популяции, дают вполне адекватные результаты. При этом необходимо учитывать влияние факто­ров внешней среды (температуры, рН, состава среды), а также микроб­ную нагрузку (количество микробных клеток в определенном объеме).

11.3.2. Методы испытания антимикробной активности

Метод оценки биоцида определяется задачей конкретного исследо­вания (табл. 18).

Качественный суспензионный тест. Взвесь микроорганизма вносят в раствор антисептика. После определенной экспозиции (2-60 мин) пробу (0,1 мл) вносят в пробирку с нейтрализатором и делают высев для определения жизнеспособности тест-культуры.

Количественный суспензионный тест. После экспозиции тест- культуры с антисептиком и нейтрализации делают количественный вы­сев с подсчетом выросших колоний. Микробиоцидную активность (МА) определяют по формуле:

МА = log Nc - log Nd ,

Классификация методов оценки биоцидов (36)

где: Nc - число колоний, выросших при посеве контрольной взвеси; N -то же из взвеси с биоцидом.

Таблица 18
Принцип оценки Метод
Вид микроорга­низма Определение активности в отношении: некислотоустойчивых бактерий; не образующих споры: кислотоустойчивых (микобактерий); спор прокариот
Действие биоцида Бактериостатическое или бактерицидное, фунгистатиче- ское или фунгицидное и т. д.
Вид испытания l.in vitro: суспензионный тест (тест-культура в виде сус­пензии); тест-организм на носителе; определение влия­ния бионагрузки; 2. В условиях, приближенных к практике (эффективность дезинфекции поверхностей в помещении, инструментов, ткани, кожи рук и т. п.); 3. Оценка эффективности дезинфекции в реальных усло­виях (в цехе, лаборатории, госпитале и др.)
Цель испытания 1. Предварительные испытания: скрининг, определение действующей концентрации, экспозиции, влияние орга­нических веществ и т. д.; 2. Уточнение концентрации биоцида для определенной це­ли дезинфекции; 3. Испытания в реальных условиях, оценка применимости метода в условиях цеха, клиники и т. п.
Требования Евро­пейского комите­та по стандарти­зации (CEN/TC 216) 1. Фаза 1. Определение эффективности биоцида в суспен­зионном тесте. 2. Фаза 2. Ступень 1. Определение применимости биоцида в конкретных условиях (суспензионный тест). 3. Фаза 2. Ступень 2. Определение эффективности биоцида в условиях, приближенных к практике

 

Определение влияния бионагрузки. Метод позволяет определить способность дезинфектанта сохранять активность в присутствии увели­чивающейся микробной нагрузки. В раствор дезинфектанта добавляют определенное количество микробной взвеси. После заданной экспозиции делают количественный высев и определяют число выросших колоний. Через 10 минут, например, в этот же дезинфектант вносят новую дозу
микроорганизма и после экспозиции определяют число выживших кле­ток. Затем операцию повторяют еще через 10 минут. Этот метод воспро­изводит практическую ситуацию, например, можно определить, как дол­го раствор сохраняет активность, когда в него последовательно погружа­ют инфицированные инструменты.

Тест с культурой на носителе (фильтровальная бумага, ткань и др.) позволяет оценить эффективность биоцида при дезинфекции по­верхностей, материалов и т. п. Стандартные образцы носителя помещают в микробную суспензию, высушивают, затем вносят в раствор биоцида, выдерживают (10 мин), далее помещают в нейтрализатор, затем в пита­тельный бульон и определяют жизнеспособность клеток.

Тест с условиями, приближенными к практическому примене­нию ставят на людях-добровольцах. На кожу кисти рук наносят взвесь Е. coli, подсушивают 3 мин на воздухе и протирают руки испытуемым раствором антисептика. Далее делают смыв с рук жидкой питательной средой и проводят количественное определение жизнеспособных клеток. Ананлогично микробную взвесь наносят на поверхность оборудования, стен и пола помещения и т. п. с последующей обработкой биоцидом.

Определение антимикробной активности антисептиков в мяг­ких и твердых формах проводят на плотной питательной среде, засеян­ной тест-культурой. Образцы размещают на поверхности среды или в лун­ках, подобно тому, как это делают при испытании антибиотиков чашеч­ным методом. Об активности препарата судят по диаметру зоны задерж­ки роста вокруг образца в сравнении со стандартным препаратом.

Кроме микробиологических методов существуют многочисленные биохимические и физико-химические методы определения жизнеспособ­ности микроорганизмов: определение активности ферментов, методы микрокалориметрии, проточной флуориметрии, флуориметрии. Однако эти методы не стандартизованы.

11.3.3. Определение эффективности консервантов

лекарственных средств

Метод испытания включает искусственное заражение лекарствен­ного средства суспензиями определенных тест-микроорганизмов, инку­бацию контаминированных образцов при определенной температуре, от­бор проб через определенные интервалы времени и подсчет жизнеспо­собных клеток микроорганизмов в 1 г (мл) лекарственного средства (ЛС).

В качестве тест-микроорганизмов используют виды бактерий и гри­бов, которые являются наиболее частыми контаминантами J1C: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Asper­gillus niger. Концентрацию микробной взвеси для заражения образцов выбирают в зависимости от категории JIC: для водорастворимых JIC МО8 КОЕ/мл; для ЛС, нерастворимых в воде 1-Ю6 КОЕ/мл,

При заражении ЛС, приготовленных на твердой мазевой основе их нагревают до 45-50 °С, при необходимости добавляют поверхностно-ак- тивное вещество и тщательно перемешивают. Контаминированные образ­цы выдерживают при температуре 20-25 °С в защищенном от света мес­те. Через 7,14 и 28 сут после инокуляции определяют количество жизне­способных клеток чашечным методом путем количественного посева на соответствующую питательную среду.

Консервант признают эффективным, если через 7 сут число КОЕ в водорастворимом ЛС уменьшается в 10 раз, через 14 сут - не менее, чем в 1000 раз, а в период с 14 по 28 сут не происходит увеличения числа бактерий. Для ЛС, нерастворимых в воде, число КОЕ через 14 сут должно уменьшиться не менее чем в 100 раз. Для всех категорий препаратов не должно быть увеличения числа грибов при всех экспозициях.

11.4. Механизмдействия дезиифектантов и антисептиков

Действие антисептиков на микробную клетку неспецифично, т. е. их мишень может находиться и в клетках млекопитающих. Мишени дей­ствия антисептиков разнообразны и присутствуют в клеточной стенке, мем­бранах и цитоплазме.

В низких концентрациях антисептики вызывают лизис микробных клеток, возможно, воздействуя на ферменты, принимающие участие в синтезе клеточной стенки, таким образом, что они изменяют свои фун­кции, дезинтегрируя ее. Лизис клеточных стенок Е. coli, стафилококков и стрептококков наблюдали в присутствии следующих веществ (указаны концентрации в %): формалин 0,12, фенол 0,32, ртути хлорид 0,0008, на­трия гипохлорит 0,005, мертиолат 0,0004. Глутаровый альдегид нарушает структуру клеточной стенки грамположительных бактерий, вызывая нео­братимое образование в ней перекрестных связей.

Воздействие на цитоплазматическую мембрану сопровождается на­рушением мембранного потенциала, ферментов мембраны и ее проница­емости. Нарушение мембранного потенциала приводит к разобщению транспорта электронов и фосфорилирования, препятствует переносу про­тонов через мембрану, т. е. к прекращению энергетических процессов, направленных к синтезу АТФ.

Ингибирование ферментов, ассоциированных с мембраной, приво­дит к нарушению многих процессов метаболизма. Гексахлорофен угнета­ет активность ферментов цепи переноса электронов, подавляя метаболи­ческую активность аэробных бактерий. Хлоргексидин ингибирует мемб­ранную АТФазу, воздействуя таким образом на анаэробные процессы. Антисептики, содержащие ртуть, бронопол и др. ингибируют ферменты, содержащие тиоловые группы (-SH). В присутствии избытка соединений, содержащих тиогруппы (цистеин, тиогликолаты), такие антисептики ут­рачивают активность.

Многие антисептики (ЧАС, фенол, гексилрезорцин и др.) нарушают проницаемость мембраны, что сопровождается утечкой цитоплазматичес- кого содержимого. Клетка теряет калий, пурины, пиримидины сахара и другие метаболиты. Если действие антисептика кратковременно, наблю­дается лишь бактериостатический эффект.

Цитоплазма представляет собою сложную многокомпонентную си­стему молекул и субклеточных частиц, каждая из которых может в той или иной степени подвергаться воздействию антисептиков. Высокие кон­центрации биоцидов, например, хлоргексидина, фенола, солей ртути вы­зывают общую коагуляцию цитоплазмы. В присутствии водорода перок- сида и n-хлормеркурбензоата происходит диссоциация рибосом на субча­стицы. Акридиновые красители способны встраиваться в структуру ДНК, нарушая тем самым ее функции. Многие антисептики взаимодействуют с тиоловыми группами белков, например, галогены могут их окислять. Формальдегид, глутаровый альдегид и серы диоксид реагируют с ами­ногруппами. Высокореактивные агенты воздействуют на многие клеточ­ные системы. Например, Р-пропиолактон алкилирует амино-, имино-, гид- роксильные и карбоксильные группы, взаимодействует с тио- и дисуль- фидными группами, нарушая структуру белков и других макромолекул. Подобной активностью обладает и этилена оксид. Высокой реактогенно- стью обладают также серы диоксид, сульфиты и бисульфиты.

В табл. 19 приведены данные о клеточных мишенях, подвергающихся воздействию различных антисептиков.

Антисептики шифч^з tmoMonir 1яс!ээ                   Примечание: + Антисептик действует в низких концентрациях; +4 + Антисептик действует в высоких концентрациях.
Sy шюз     +   +     +  
OVh       + +        
HoJ-Muiroiiuodu -Ewg     +         + +
Н1ГОНЭф + +   + + + +        
nxXid ВИНЭНИСЭОЭ -f   +   t 4- +   +  
1ГОИ     -f         +  
nxudoirxouHj +   +         + +
zOzU     +     +   +  
H3cj)0d0IfXEDM3J   + +   +        
Hnaodcj-Airj +   +   t     + +
muatrqirmsdoo +               i
ГГИЭМ0 GH3L'H1£     + +       + + +
++n э Hi/03     +   + +     +  
HnUHDHSidoiTx     +   + + +        
irouoHodg     + +       +  
гсггшшну   +   +          
mdiiiQ       +          
HirSlHOL'd-M 3H30HHlTHdMy             +    
5 2 s к 2 ? о 5 Мембранный потенциал Ферменты мембран: цепь переноса электронов | АТФаза ферменты с , тиотруппами 1 Проницаемость мембраны Коагуляция | цитоплазмы Рибосомы Нуклеиновые кислоты Тиогруппы Аминогруппы

 

11.5.Резистентность микроорганизмовк антисептикам

и дезинфектантаим

Микроорганизмы существенно различаются по своей резистентно­сти к действию биоцидов (табл. 20).

Таблица 20

Чувствительность микроорганизмов к хлоргексидину
Микроорганизмы Минимальная подавляющая концентрация, мкг/мл
Грамотрищтельные
Pseudomonas aeruginosa 10-500
P. mirabilis 25-100
Burkholderia cepacia 5-100
Serratia marcescens 3-50
Salmonella typhimurium
Klebsiella aerogenes 1-12
Escherichia coli 1-5
Грамположительные
Staphylococcus aureus 1-2
Streptococcus faecalis 1-3
Bacillus subtilis 1-3
Streptococcus mutans 0,1
Mycobacterium tuberculosis 0,7-6
Грибы
Candida albicans 7- 15
Trichophyton mentagrophytes Pemcillium notatum 3 200

 

По уровню устойчивости к биоцидам патогены распределяются сле­дующим образом (в убывающем порядке):

• прионы;

• кокцидии;

• споры прокариот;

• микобактерии;

• цисты простейших;

• малые безободочечные вирусы (пикорнавирусы, парвовирусы; не­которые ротавирусы);

• трофозоиты простейших, большие безободочечные вирусы (энтеро- вирусы);

• грамотрищтельные бактерии, грибы (грибы могут быть более устойчивыми);

• грамположительные неспорообразующие бактерии, оболочечные вирусы (ВЙЧ).

Естественная резистентность связана с природными особенно­стями строения микробной клетки и ее метаболизма: наличием защит­ных покровов, образованием биопленок, способностью к ферментатив­ной деградации или активному выбросу ксенобиотиков из клетки. Мик­робной деградации подвергаются все виды ПАВ и другие дезинфектанты в концентрации, ниже действующей, а иногда и в рабочей концентрации, например, бензалкониум хлорид, как и другие ПАВ, P. aeruginosa исполь­зует в качестве источника углерода. Этот микроорганизм наиболее часто обнаруживается в растворах дезинфектантов наряду с представителями других родов (табл. 21).

Таблица 21

Микроорганизмы, наиболее часто обнаруживаемые в дезинфектантах

Биоцид Роды загрязняющих микроорганизмов
Хлоргексидин Pseudomonas, Serratia, Enterobacter. Klebsiella, Escherichia, Chromobacter, Candida, Aspergillus
Фенол и его препараты Pseudomonas
Хлорамин Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterobacteriaceae
Водорода пероксид Staphylococcus. Escherichia, Klebsiella
Формальдегид Pseudomonas

 

Проницаемость клеточной стенки грамотрицательных бактерий во многом определяется наличием внешней мембраны, защищающей клетку от проникновения химических веществ. Активность биоцида по­вышается в присутствии веществ, увеличивающих ее проницаемость (ЭДТА, натрия гексаметафосфат, лимонная кислота и др.). Поверхност­но-активные вещества, особенно ЧАС, разрушают липополисахаридный слой внешней мембраны. Возможной причиной высокой устойчивости P. aeruginosa может быть повышенное содержание фосфатных групп в ли- пиде А, характерное для этого микроорганизма. Кроме того, у P. aeruginosa имеется система активного выброса ксенобиотиков, эффективная в от­ношении многих антимикробных агентов.

Важной особенностью грамотрицательных бактерий, определяющей их устойчивость к биоцидам, является способность к адгезии на поверх­ностях с образованием биопленок, представляющих организованное со­общество клеток, объединенных массой экзополисахарида (гликокаликс). Верхние слои гликокаликса защищают внутреннюю часть от проникно­вения биоцида. Клетки, обитающие внутри биопленки, ограничены в до­ступе питательных веществ и растут медленно, что способствует повы­шению их резистентности к неблагоприятным условиям.

Образование биопленки - одно из проявлений чувства кворума у бактерий. В биопленке устойчивость микроорганизмов к биоцидным агентам в сотни раз выше, чем у клеток, растущих в виде планктона. Био­пленка может состоять из разных видов микроорганизмов, каждый из ко­торых продуцирует полимер особой структуры, таким образом, гликока­ликс имеет гетерогенный состав. На его поверхности располагаются вне­клеточные ферменты, которые принимают участие в метаболизме, в том числе могут разрушать биоциды, присутствующие в среде. В биопленке происходит отбор устойчивых вариантов микроорганизмов. Устойчивость к биоцидам была обнаружена у растущих в виде биопленок Pseudomonas spp., Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus faecalis, Legionella pneumophila, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica и др.. Биопленки могут образовываться в системе водоснабжения, а также на имплантированных искусственных органах (суставах, сосудах, клапанах сердца), являясь, таким образом, источни­ком инфекции.

Испытание действия биоцида с использованием микробной взвеси не дает возможности оценить его активность в отношении клеток, растущих в виде биопленки. Требуется специальная методика, предусматривающая стан­дартизацию объекта (вид микроорганизма, возраст биопленки и т. п.).

Грамположительные бактерии, как правило, более чувствитель­ны к биоцидам, хотя и в этой группе появляются резистентные штаммы. Например, устойчивость Staphylococcus aureus к фенолам и ЧАС зависит от присутствия на поверхности клеток липидов, которые защищают мик­роорганизм от проникновения биоцидов.

Споры выдерживают концентрации биоцидов, в несколько тысяч раз превышающие концентрации, эффективные в отношении вегетатив­ных клеток. Соединения ртути, ЧАС, хлоргексидин, фенолы и спирты практически не обладают спороцидной активностью, хотя MoiyT задер­живать прорастание спор. Этилена оксид, b-пропиолактон, формальде­гид, глутаровый альдегид, водорода пероксид и галогены убивают споры, однако их действие достаточно медленное, процесс стерилизации должен продолжаться от 30 мин до нескольких часов. Резистентность спор обеспечивает их уникальная клеточная оболочка, которая препятствует проникновению биоцидов внутрь клетки и, возможно, нейтрализует дей­ствие некоторых из них. Споры разных микроорганизмов различаются по своей чувствительности к стерилизующим агентам. Помимо генотипи- ческой вариабельности существует и фенотипическая зависимость резис­тентности спор от условий выращивания микроорганизма.

Микобактерий высокорезистентны к действию дезинфектантов (наиболее эффективны фенолы); при возможности для их уничтожения следует применять тепловую обработку. Защитными свойствами облада­ет клеточная стенка микобактерий, содержащая большое количество вос- коподобных липидов, образующих гидрофобные слои. Существенную роль в составе липидов играют миколовые кислоты. Клеточная стенка обеспечивает кислотоустойчивость этих микроорганизмов, которая слу­жит основой их дифференциального окрашивания путем обработки кар­боловым фуксином при нагревании. При комнатной температуре процесс требует 18-часовой экспозиции. Окрашенные клетки устойчивы к обес­цвечиванию спиртом и разбавленными кислотами, с чем и связано проис­хождение термина «кислотоустойчивость».

Резистентность вирусов к биоцидам зависит от их количества (био­нагрузки), структуры капсида, числа и доступности мишеней. Наблюда­ется широкая вариабельность резистентности даже внутри одного семей­ства и клона. Не все вирусные частицы являются инфекционными, что влияет на результат испытания путем заражения культуры ткани. Боль­шое значение имеют факторы внешней среды. Например, вирусы способ­ны к адгезии на поверхности частиц и материалов, микротрещины и заг­рязнения на поверхности оборудования могут служить им укрытием от действия биоцида. Поэтому важна тщательная очистка перед дезинфек­цией, особенно для медицинского оборудования. Основные механизмы резистентности:

• способность вирионов к агрегации;

• модификация мишени (протеина), причем может иметь значение из­менение конформации молекулы;

• реактивация за счет рекомбинации вирусной нуклеиновой кислоты и элементов капсида с образованием инфекционной частицы, титр вируса при этом возрастает.

Остаточные концентрации биоцида в среде могут быть причиной перестройки популяции вируса с образованием резистентных форм. По­этому важно полностью обезвредить объект, не оставляя неповрежден­ных молекул нуклеиновой кислоты, учитывая, что заражающая доза не­которых вирусов очень мала.

Приобретенная резистентность появляется в результате измене­ний в генетическом аппарате бактерий, в результате отбора устойчивых мутантов в среде, содержащей биоциды. Большое значение в распростра­нении генов резистентности имеет их горизонтальный транспорт между различными видами и родами бактерий с помощью трансмиссивных плаз- мид и конъюгативных транспозонов. Плазмиды могут определять множе­ственную резистентность к биоцидам. У Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa описаны плазмиды, обеспечивающие ус­тойчивость к соединениям ртути. Плазмиды узкого спектра контролиру­ют образование редуктазы, переводящей Hg"14" в металлическую ртуть. Плазмиды широкого спектра помимо редуктазы кодируют одну или не­сколько гидролаз, которые освобождают Hg++ из ртутьорганических со­единений, разрывая связь ртуть - углерод. Образующаяся металлическая ртуть испаряется из среды. Существование таких процессов трансформа­ции ртутьорганических соединений делает проблематичным их исполь­зование в качестве консервантов в фармацевтике. Устойчивость к соеди­нениям серебра обеспечивается механизмом выброса ксенобиотика. Ген резистентности обычно находится в плазмиде, однако описана и его хро­мосомная локализация. Возможны мутации, обусловливающие модифи­кацию мишени или изменение проницаемости клеточной оболочки.

Широкий круг хозяев у генов резистентности способствует их со­хранению в природе, причем такие гены могут стабильно существовать даже в отсутствие селективного давления, т.е. в среде, не содержащей биоцидов. Селективные условия создаются в растворах дезинфектантов с концентрацией, ниже рекомендуемой, и при нарушении сроков их хра­нения. Например, в растворах хлорсодержащих веществ часто обнаружи­вается снижение содержания активного хлора.

Помимо концентрации биоцида для развития резистентности попу­ляции имеет значение состав среды (наличие защитных агентов, факто­ров роста), фаза развития и скорость размножения клеток. Например, Pseudomonas aeruginosa, выращенная на среде с недостаточным количе­ством магния, высокоустойчива к бензалкониума хлориду, тогда как вы­ращенная на среде с недостатком углерода - высокочувствительна. Боль­шое значение имеет температура и время культивирования. Медленнора­стущие клетки менее чувствительны к биоцидам, чем быстрорастущие. Поэтому необходимо строго соблюдать стандартные условия испытания активности антимикробных агентов.

Возможность быстрого развития резистентности в популяции сле­дует учитывать на практике при применении биоцидов для дезинфекции.

При продолжительном использовании какого-либо антимикробного агента микробиота, обитающая в данном объекте (госпиталь, аптека, цех, лабо­ратория, находящиеся там предметы, стены и пол помещений и т. д.), мо­жет приобрести высокую устойчивость к этому препарату. Для эффектив­ного проведения всех мероприятий, обеспечивающих асептичные усло­вия работы, осуществляют ротацию биоцидов, т. е. используют несколько химических веществ, применяя их в определенном порядке.


Глава 12. ОСНОВЫ ИММУНИТЕТА

Иммунитет - это состояние повышенной устойчивости организма к живым телам и веществам, несущим признаки генетической чужерод- ности. Эти чужеродные субстанции называются антигенами. Антигенами могут быть микроорганизмы, чужеродные клетки, ткани и продукты их жизнедеятельности. Реагирование против чужеродных субстанций осу­ществляет иммунная система организма, которая обеспечивает приобре­тенный (адаптивный) иммунитет. Помимо иммунной системы существу­ют факторы неспецифической защиты (факторы врожденного иммуните­та) действие которых не зависит от антигенных особенностей чужерод­ного агента. Системы врожденного и приобретенного иммунитета дей­ствуют как единый функциональный комплекс, элементы которого нахо­дятся в постоянной взаимосвязи.

12.1. Врожденный иммунитет

Врожденный (естественный, наследственный) иммунитет - это фор­ма защиты, которая определяется наличием неспецифических факторов, направленных против микроорганизмов вне зависимости от их антиген­ного состава. Барьерные функции выполняют кожа, слизистые оболоч­ки, биопленка нормальной микробиоты, которые препятствуют проник­новению микробов внутрь организма и его распространению. Химиче­ские факторы - кислая среда желудка, желчь кишечника, жирные кисло­ты пота и отделяемого сальных желез, лизоцим (мурамидаза), содержа­щийся в слюне, слезах и отделяемом слизистых оболочек, антимикроб­ные вещества, продуцируемые лимфоцитами и клетками печени, интер­ферон и др. губительно воздействуют на микроорганизмы. Сальные и потовые железы, мерцательный эпителий, слизь, слюна, выделительные системы организма обеспечивают удаление патогенов и их токсинов.

Комплекс воспалительных реакций подавляет развитие патогена и препятствует его распространению из очага воспаления.

Антимикробной активностью обладают катионные пептиды - де- фенсины, кателицидины и др., которые образуются в эпителии барьер­ных тканей и в лейцоцитах.

Система комплемента принимает участие в реакциях неспецифи­ческой защиты и в реакциях иммунного ответа. Это комплекс раствори­мых белков плазмы крови и белков клеточной поверхности, взаимодей­ствие которых опосредует различные биологические эффекты: лизис кле­ток, хемотаксис и опсонизацию при фагоцитозе, стимуляцию воспаления и реакций гиперчувствительности. Большая часть этих белков синтезиру­ется гепатоцитами и макрофагами. Они циркулируют в крови в неактив­ной форме, а при определенных условиях активируются путем каскада ферментативных реакций. Классический путь активации начинается со связывания компонента комплемента С1 комплексом антиген - антитело, далее активируются другие компоненты, в результате чего образуется ли- тический комплекс.

Альтернативный путь начинается с фракции СЗв и включает кас­кад реакций с участием пропердина. При этом образуется комплекс бел­ков, который связывается с гликоконъюгатами поверхности микробных клеток, в результате чего происходит их лизис в отсутствие антител. Мно­гие микроорганизмы способны защищать себя от действия комплемента: они имеют поверхностные структуры, устойчивые к лизису или способ­ные подавлять систему комплемента, например, сиаловые кислоты стреп­тококков, нейссерий, трепонем.

Мощным неспецифическим фактором защиты организма является система пропердина. Это белки плазмы крови, содержащие отдельные компоненты комплемента и ионы магния, которые способны обезврежи­вать многие бактерии и вирусы.

Цитокины - группа различных протеинов, которые высвобожда­ются клетками млекопитающих и действуют на другие клетки через спе­цифические рецепторы. Ответная реакция клетки-мишени зависит от ее природы и природы цитокина: пролиферация и дифференциация клеток, воспаление, гемопоэз. Цитокины передают сигналы между различными популяциями лимфоцитов и участвуют в регуляции иммунного ответа. К цитокинам относятся также фактор роста, колониестимулирующий фак­тор, интерфероны, фактор некроза опухоли.

Интерфероны (ИФН) - группа видоспецифических белков и гли- копротеинов, синтезируемых клетками организма в ответ на воздействие интерфероногенов - вирусов, бактерий, их структурных элементов, син­тетических полирибонуклеотидов и других веществ, которые вызывают дерепрессию генов, кодирующих ИФН.

ИФН как и другие цитокины в организме выполняют контрольно- регуляторные функции, направленные на сохранение клеточного гомеос- таза, важнейшие из них - антивирусная, противоопухолевая, иммуномо- дулирующая и радиопротекторная. ИФН угнетают размножение вирусов, стимулируя образование в клетке комплекса белков, блокирующих транс­ляцию вирусной иРНК. Противоопухолевая защита зависит от способно­сти ИФН активировать цитотоксические лимфоциты, макрофаги и есте­ственные киллеры. Кроме того, они активируют интерфероногенез (прай- минг) и образование антител.

Фагоцитоз - наиболее древняя по происхождению форма защиты. Она выражается в явлении захватывания и переваривания фагоцитами посторонних частиц, в том числе бактерий и разрушенных клеток. Это явление открыто русским ученым И.И. Мечниковым. Все фагоцитирующие клетки не окрашены, поэтому их называют лейкоцитами или, в отличие от эритроцитов, белыми клетками крови, они различаются по своим функциям:

нейтрофшы - адгезия к эпителию, выход за пределы кровотока,

синтез микробоцидных факторов; эозинофшы - синтез биоцидных факторов, направленных против

простейших и гельминтов; моноциты - адгезия к эпителию, выход за пределы кровотока,

синтез биоцидных факторов и цитокинов; макрофаги - адгезия к эпителию, выход за пределы кровотока, синтез биоцидных факторов, компонентов ком­племента, активаторов протеаз, участие в иммун­ных реакциях.

Процесс фагоцитоза начинается со стадии узнавания и адгезии по­сторонней частицы (например, микробной клетки) на мембране фагоци­та. Далее микроб оказывается заключенным внутри вакуоли (фагосомы), которая затем сливается с лизосомой фагоцита. В результате микроорга­низм погибает под действием биоцидных факторов фагоцита (02~, Н202, NO, НС10 ) и разрушается с помощью его гидролитических ферментов. Фагоцитоз, при котором происходит гибель и разрушение поглощенных клеток, носит название завершенного. Наряду с этим при некоторых ин­фекциях (гонорея, туберкулез, лепра, лейшманиоз, коклюш, брюшной тиф, туляремия, бруцеллез, микозы) наблюдается незавершенный фагоцитоз, при котором микроорганизмы поглощаются фагоцитами, но не погибают, а иногда размножаются. Выживанию микробов способствует ряд факто­ров (подавление процесса слияния фагосомы и лизосомы, устойчивость к действию микробоцидных агентов лизосомы и др.).

Опсонины - белки обволакивающие микробные клетки и другие частицы и усиливающие их фагацитоз. Роль опсонинов выполняют иммуноглобулины, компоненты комплемента и некоторые другие белки.

Рецепторы, распознающие определенные химические структу­ры микробов. Особой формой эволюционно древней системы врожден­ного иммунитета является способность распознавать патоген-ассоцииро- ванные молекуклярные структуры (ПАМС), которые имеются лишь у мик­роорганизмов: компоненты клеточной стенки бактерий (типид А, пепти- догликан, липоарабиноманнан), флагеллин, ДНК и РНК бактерий и виру­сов и др. Распознающие ПАМС рецепторы экспрессированы на макрофа­гах, дендритных клетках и В-лимфоцитах. Их подразделяют на группы: рецепторы передачи сигналов (Toll-англ, звонить), эндоцитозные мемб­ранные и секретируемые растворимые. Они выполняют многочисленные функции, связанные с активацией защитных реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета.

Естественные клетки-киллеры (Natural killers - NK) - это лимфо­циты, обладающие цитотоксичностью по отношению к клеткам-мише- ням (опухолевым, содержащим вирусы и другие паразиты). Они не обла­дают фагоцитирующей активностью, но убивают свою жертву с помо­щью цитотоксических веществ. Среди лейкоцитов крови человека NK составляют от 2 до 12 %.

12.2. Приобретенный иммунитет

Приобретенный (адаптивный) иммунитет отличается высокой спе­цифичностью своих реакций, основанной на тонких структурно-химичес­ких различиях антигенов и соответствующих им антител (иммуноглобу­линов), образующихся в ответ на попадание антигена в организм.

Приобретенный иммунитет по наследству не передается. Он фор­мируется по отношению к конкретному виду возбудителя и является строго специфическим. Его подразделяют на активный и пассивный. Актив­ный иммунитет вырабатывается в результате перенесенных заболеваний, инфицирования без клинических признаков заболевания, после активной иммунизации, т. е. введения вакцин и анатоксинов.Пассивный иммунитет возникает после введения препаратов, содержащих антитела (иммуногло­булины). Пассивным иммунитетом обладают новорождённые, которые получают его от матери в период внутриутробного развития. Его продол­жительность невелика - около 6 месяцев.

12.2.1. Антигены

Антигенами называют все вещества, которые несут признаки гене­тической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций. Антигенность присуща бел­кам, многим полисахаридам, гликоконъюгатам (гликопротеинам, липополи- сахаридам), некоторым искусственным высокополимерным соединениям.

Основные понятия, характеризующие антиген: антигенность (спо­собность вызывать иммунный ответ), илшуногенность (способность вызывать иммунитет, т. е. невосприимчивость к инфекции) и специфич­ность.

Специфичность определяется особенностями химической структу­ры антигена, благодаря которым один антиген отличается от другого. Хи­мическая группировка молекулы антигена, определяющая его специфич­ность, называется антигенной детерминантой {эпитопом). Например, антигенная специфичность белка определяется его первичной и надмоле­кулярными структурами, а также поверхностно расположенными груп­пами, которые могут служить антигенными детерминантами. В молеку­лах гликоконъюгатов эпитопом часто является полисахарид. Структура эпитопа комплементарна активному центру антител или Т-клеточному рецептору. Существуют индивидуальные эпитопы, распознаваемые Т- и В-клетками.

Гаптены - это вещества, обладающие специфичностью, но не вы­зывающие иммунного ответа при введении в организм. Однако с готовы­ми антителами они взаимодействуют. Гаптены приобретают свойства пол­ноценных антигенов после соединения с крупномолекулярными вещества­ми (белками, полисахаридами или искусственными полиэлектролитами). Соединение происходит за счет ко валентных связей или электростатичес­ких сил. Свойствами гаптенов могут обладать многие лекарственные пре­параты (амидопирин, хинидин, продукты распада пенициллина и др.), которые, взаимодействуя с белками организма, могут вызывать иммун­ный ответ - лекарственную аллергию.

Видовая специфичность - это специфичность, благодаря которой представители одного вида отличаются от особей другого вида. Напри­мер, различается состав сывороточных белков у человека и животных, что может быть использовано на практике, например, в судебной медицине.

Групповая специфичность обусловливает разницу среди особей одного вида. Антигены, благодаря которым особи одного вида различа­ются между собой, называются - изоантигенами. К изоантигенам отно­сятся антигены, которые содержатся в эритроцитах и определяют группы крови человека (см. «Диагностические сыворотки»).

Состав молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС - от англ. Major Histocompatibility Complex) уникален для каждого организма и определяет его биологическую индивидуальность, что по­зволяет отличать «свое» (гистосовместимое) от «чужого» (несовмести­мого). Молекулы I и II классов - это гликопротеины, которые контролиру­ют иммунный ответ и участвуют в реакциях цитотоксичности, осуществ­ляемой Т-лимфоцитами. Молекулы I класса МНС представлены на по­верхности всех ядросодержащих клеток, молекулы II класса - преимуще­ственно на мембране иммунокомпетентных клеток (макрофагов, В-лим- фоцитов, активированных Т-лимфоцитов). Гены III класса МНС кодиру­ют отдельные компоненты системы комплемента.

Типоспецифичность определяет антигенные различия внутри од­ного вида микроорганизмов (серовары). Например, известно более 80 се- роваров пневмококков, различающихся своими полисахаридными анти­генами.

Гетероспецифичностъ обусловлена наличием гетероантигенов - антигенных детерминант, общих для представителей разных видов. Об­щие антигены встречаются у весьма отдаленных видов: у человека и воз­будителя чумы, вируса гриппа и других микроорганизмов. Это так назы­ваемые мимикрирующие антигены. При сходстве антигенных структур микро- и макроорганизма формирование иммунного ответа нарушено, например, в миокарде человека имеются химические структуры, сходные с антигенами стрептококков, поэтому антитела против стрептококков спо­собны атаковать ткани сердца, что служит причиной осложнений после перенесенной скарлатины.

Антигенная структура микробной клетки представляет большой научный и практический интерес, поскольку антигены бактерий исполь­зуют с целью создания вакцинных препаратов для воспроизведения ис­кусственного иммунитета и для серологической диагностики инфекци­онных болезней. В состав бактериальной клетки и вирусной частицы вхо­дят сложные комплексы веществ, обладающих антигенной активностью. К ним относятся высокомолекулярные соединения белковой природы, полисахариды, липополисахариды и т. п. Антигенными свойствами обла­дают органоиды клеток: жгутики, мембраны, цитоплазма, рибосомы, кле­точная стенка. Токсины бактерий также являются сильными антигенами.

Суперантигены - это антигены микробов, которые блокируют спе­цифический иммунный ответ и стимулируют ложную реакцию распозна­вания антигена. Они вызывают антигеннеспецифическую пролиферацию лимфоцитов, гиперпродукцию цитокинов, способствующих развитию воспаления, деструкции тканей и гибели Т-лимфоцитов с явлениями им­мунодефицита. Суперантигены обнаружены у стафилококков, стрептокок­ков и у некоторых вирусов.

Антигены вирусов - белки, ппикоконъюгаты, иуклеопротеиды, спе­цифичны для вируса, или содержат компоненты клетки хозяина (липиды, углеводы).

Генетически модифицированные микроорганизмы (ГМО) могут иметь не существовавшие ранее в природе иммунодоминантные эпито- пы, что может привести к нарушению баланса между микроорганизмом и иммунной системой. В результате условно-патогенная микробиота пе­рейдет в разряд патогенной. Если в числе эпитопов ГМО появятся после­довательности, комплементарные участкам определенных молекул орга­низма человека, такая антигенная мимикрия способна привести к разви­тию тяжелых аутоиммунных заболеваний.

12.2.2. Антитела

Антитела - это особые белки (гликопротеины), которые образуют­ся в организме позвоночных животных и человека при введении антиге­нов и обладают способностью вступать с ними в специфическую связь. Антигены, связанные с антителами, обезвреживаются и удаляются из организма.

Особое значение имеет способность антител соединяться со специ­фической молекулой антигена, «узнавать» даже самые тонкие различия в ее структуре. Специфичность антител связана с различием в их хими­ческом строении, т. е. в последовательности аминокислот полипептид­ных цепей, составляющих их структуру. Наряду с тонкими различиями в структуре антител, определяющими их иммунологическую специфич­ность, антитела имеют общие характерные особенности строения.

Молекулы антител имеют глобулярную структуру и называются иммуноглобулинами. Основу структуры любого антитела (рис. 11) со­ставляет комплекс из четырех полипептидных цепей - двух одинаковых тяжелых и двух одинаковых легких. Тяжелые цепи обозначают буквой Н (heavy - тяжелый), а легкие - буквой L (light - легкий). Тяжелые и легкие цепи удерживаются вместе дисульфидными мостиками. Они уложены таким образом, что на поверхности образующейся структуры возникают два одинаковых участка, которые обозначаются Fab. Эти участки содер­жат центры связывания антигена. Третий участок Fc содержит структу­ры, обеспечивающие связывание антител с определенными клетками, не­сущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента, например, лей­коцитами, тучными клетками.

Utn*. (И)

 

COOK соон

Рис. 11. Структура мономера молекулы иммуноглобулина

Как тяжелые, так и легкие цепи в своей структуре имеют две катего­рии областей: вариабельные (V) и постоянные (С) по содержанию состав­ляющих их аминокислот. Вариабельная область, располагающаяся на уча­стке Fab, сформирована полипептидными цепями, первичная структура которых индивидуальна и сильно варьирует от молекулы к молекуле, что обеспечивает специфическое узнавание и связывание молекул антигенов. Вторичная структура иммуноглобулинов - а-спирапь, перемежающаяся сложными (3-структурами - «клубками», возникающими при сшивании аминокислотных остатков каждой цепи. Эти клубки называют доменами, они находятся на тяжелых и легких цепях вариабельных и константных участков. Активные центры антител формируются доменами вариабель­ных участков, которые располагаются в гипервариабельных областях тя­желых и легких цепей и обозначаются как фрагмент Fv.

Взаимодействие антигена с антителом осуществляется за счет элек­тростатических, гидрофобных взаимодействий и сил Ван-дер-Ваальса. Молекулы полных антител имеют как минимум два центра связывания с антигеном. Антитела, имеющие только один центр связывания, называ­ют неполными.

Иммуноглобулины представляют собой гетерогенную группу бел­ков, их гетерогенность связана с существованием разных типов тяжелых и легких цепей. У человека имеется два типа легких цепей: к и А, (каппа и лямбда) и 5 классов тяжелых цепей а, у, ц, 5, s. В соответствии с класса­ми тяжелых цепей иммуноглобулины подразделяют на 5 классов (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), различающихся по своим физико-химическим свойствам и биологической активности.

IgM - пентамер из 5 субъединиц, имеет 10 центров связывания с антигеном. Филогенетически наиболее древний, наиболее ранний, об­наруживаемый при первичном попадании антигена в организм, основной класс, синтезируемый у новорожденных и младенцев. .

IgG составляют до 75 % всех иммуноглобулинов, это основной класс, защищающий организм от бактерий, вирусов, токсинов и обеспечиваю­щий формирование пассивного иммунитета у плода, поскольку только эти иммуноглобулины способны преодолевать плацентарный барьер.

IgA присутствуют в слюне, слезах, молоке, секретируются на повер­хности эпителия и слизистых оболочек, усиливая их защитные функции.

IgE специфически взаимодействуют с тучными клетками и базофиль- ными лейкоцитами и принимают участие в развитии аллергических реак­ций. Их защитные функции направлены в основном против гельминтов.

IgD функционируют как мембранные рецепторы антигена на В-лим- фоцитах.

Кроме различных классов (изотипов) иммуноглобулинов, между ними существуют аллотипические и идиотипические различия. Аллоти- пы (маркеры константной области) генетически детерминированы и на­следуются. Идиотины определяют индивидуальную характеристику каж­дого антитела. Идиотипические маркеры (антигенные детерминанты) ло­кализуются в гипервариабельных областях и соответствуют антигенсвязы- вающим участкам антител. Все молекулы иммуноглобулинов, продуцируе­мые одним клоном лимфоцитов, несут один и тот же идиотип и называются моноклоналъными антителами. Источником разнообразия идиотипов слу­жат рекомбинации ДНК и гипермутации V-генов иммуноглобулинов.

Иммунитет, опосредованный антителами, находящимися в плазме крови и других жидкостях организма, называется гуморальным. Его ме­ханизм связан со способностью антител нейтрализовать возбудитель и его токсины посредством опсонизации, антитоксического действия, актива­ции комплемента и других воздействий на инфекционный агент. Опсони- зация происходит путем связывания антител с поверхностью микробной клетки. Такой комплекс активно поглощается фагоцитом при взаимодей­ствии Fc-фрагмента антитела с соответствующим Fc-рецептором фаго­цита. Антитела способны взаимодействовать с рецепторами клеток, свя­зывающими бактерии или вирусы, препятствуя их адгезии и проникнове­нию в клетки организма-хозяина. Кроме того, антитела обладают катали­тической активностью, действуя как гидролазы и оксидоредуктазы, при­нимают участие в нейтрализации инфекционного агента.

12.2.3. Иммунная система

Иммунная система представляет собою совокупность лимфоидных органов и лимфоидных клеток, которые распространяются по всему телу организма и связаны системой кровообращения, лимфотока и единой си­стемой иммунорегуляции. Иммунная система обладает уникальной спо­собностью вырабатывать молекулы антител, специфичные для каждого антигена. Органы иммунной системы подразделяются на первичные - цен­тральные (красный костный мозг и тимус) и вторичные - периферичес­кие (селезенка, лимфатические узлы, скопления лимфоидной ткани).

Первичные - центральные органы иммунной системы (красный костный мозг и тимус) обеспечивают ее самообновление. Здесь проис­ходят процессы пролиферации клеток - предшественников, их дифферен- цировка и созревание, в результате чего они превращаются в иммуноком- петентные клетки, выходят в циркуляцию и заселяют периферические органы иммунной системы.

Красный костный мозг - место образования полипотентной стволовой клетки, которая дает начало разным росткам кроветворения, в том числе миело-моноцитарному и лимфоцитарному. В костном мозге образуются цитокины; у млекопитающих это место созревания В-лимфо- цитов (см. ниже).

Тимус (вилочковая железа) - место созревания и дифференциации Т-лимфоцитов. Тимус активно вырабатывает лимфоциты в период эмбри­огенеза, достигает максимального размера у большинства позвоночных вскоре после рождения, затем постепенно инволюционирует. У человека самая высокая продукция Т-лимфоцитов сохраняется до двух лет жизни, затем быстро падает. Однако количество Т-лимфоцитов сохраняется на достаточном уровне, так как это долгоживущие клетки, кроме того, они способны пролиферировать в ответ на встречу со специфичным антиге­ном. В процессе созревания и дифференциации предшественники Т-лим­фоцитов из костного мозга поступают в корковый слой тимуса, постепен­но мигрируют внутрь и приобретают свои маркеры, контактируя с клет­ками тимуса и продуцируемыми ими медиаторами (специфическими пеп­тидами) и цитокинами.

В тимусе происходит элиминация потенциально аутореактивных клеток. Основная функция зрелых Т-лимфоцитов - распознавание чуже­родных антигенов, но не антигенов собственного организма (аутоантиге- нов). Элиминация состоит в том, что Т-лимфоциты, имеющие рецепторы для аутоантигенов (их в популяции 95-98 %), получают сигнал для апоп- тоза, а Т-клетки, обладающие рецепторами для чужеродных антигенов - сигнал для пролиферации. Апоптоз (программированная гибель) - это про­цесс распада клетки на отдельные фрагменты, которые могут быть ис­пользованы для построения других клеток.

Вторичные - периферические органы иммунной системы - это ме­сто встречи иммунокомпетентных клеток с антигеном, его распознавания и развития специфического иммунного ответа (взаимодействия иммуно­компетентных клеток и синтеза иммуноглобулинов).

Лимфатические узлы распространены по всему телу организ­ма. Один лимфоузел имеет массу около 1 г и содержит приблизительно 2х 109 лимфоцитов. Каждый час из него выходит в лимфу количество лим­фоцитов, равное его утроенному весу. Он отфильтровывает микробные клетки и другие частицы, в нем развивается иммунный ответ на антиге­ны, попадающие в лимфу.

В селезенке развивается иммунный ответ на антигены, попадающие в кровь. Она удаляет из крови чужеродные частицы, а также состарившие­ся и поврежденные эритроциты. При удалении селезенки ее функцию бе­рут на себя лимфоидные органы, у таких пациентов иммунитет ослаблен.

Лимфоидная ткань ассоциирована со слизистой оболочкой ки­шечника, глотки, дыхательных путей, мочеполового тракта. Располагаю­щиеся под эпителием макрофаги и дендритные клетки поглощают, пере­рабатывают антиген и передают его Т-лимфоцитам.

Илшунокомпетентные клетки — это клетки, принимающие учас­тие в иммунном ответе. Они постоянно циркулируют между кровью, лим­фой и лимфоидными органами, чтобы обеспечить встречу со «своим» антигеном, так как каждый антиген распознается лишь небольшой час­тью популяции лимфоцитов. Лимфоциты - это клетки, способные рас­познавать антиген и отвечать на контакт с ним. Индивидуальные лимфо­циты специализированы: они способны (коммитированы) отвечать лишь на определенную группу структурно сходных антигенов. Эта коммитиро- ванность существует еще до первого контакта с антигеном и выражается в наличии у лимфоцита мембранных рецепторов, специфичных для де­терминант определенного антигена. Лимфоциты являются исключитель­но неоднородной популяцией клеток: считают, что число рецепторов лим­фоцитов с различными антигенсвязывающими центрами составляет не менее 106. Кроме того, лимфоциты различаются по их функциям в про­цессе иммунного ответа и другим физиологическим особенностям.

В-лимфоциты получили свое название потому, что исследования, проведенные на птицах, показали, что местом их дифференциации явля­ется особый лимфоидный орган - бурса (сумка) Фабрициуса. У млекопи­тающих местом созревания В-лимфоцитов является красный костный мозг.

В-лимфоциты в ходе иммунного ответа дифференцируются в клет­ки, продуцирующие иммуноглобулины. Они распознают антигенные де­терминанты с помощью рецепторов, представляющих иммуноглобулины классов D или М. Кроме того они обладают другими рецепторами, для распознавания сигналов в процессе иммунного ответа.

Т-лимфоциты -основные клетки иммунологической памяти, они различаются по своим функциям, дифференцируются по поверхностным маркерам, определяемым серологическими методами.

Т-хелперы (Th от англ. helper-помощник) участвуют в распознава­нии комплекса антиген + МНС 2 класса. Т-хелперы под действием раз­личных факторов дифференцируются на группы.

Thl-лимфоциты стимулируют клеточный иммунитет, участвуют в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, активируя макро­фаги. Thl ответ стимулируется внутриклеточными возбудителями (виру­сами, микобактериями, некоторыми грибами и простейшими) и напрвлен к уничтожению инфицированной клетки.

ТЬ2-лимфоциты активируют В-лимфоциты, стимулируют антитело- образование, т. е. отвечают за развитие гуморального иммунитета. Th2 ответ стимулируется внеклеточными возбудителями.

ТЬЗ-лимфоциты и Treg (регуляторные) лимфоциты выделяют цито­кины, блокирующие иммунокомпетентные клетки, оказывающие имму- носупрессирующее и противовспалительное действие. Они могут предотв­ращать отторжение трансплантата и развитие аутоиммунных реакций.

Цитотоксические лимфоциты (CTL, Т-киплеры) распознают анти­ген в комплексе с МНС 1 класса и уничтожают чужеродные клетки с по­мощью цитотоксинов, которые индуцируют апоптоз клетки-мишени; осо­бые белки перфорины образуют поры, нарушающие проницаемость мем­браны клетки-мишени и прокладывают путь цитотоксинам. Контакт CTL и клетки-мишени непродолжителен, после чего CTL движется к новой жертве.

Макрофаги обеспечивают неспецифическую защиту за счет фа­гоцитоза и играют важную роль в развитии иммунного ответа как анти- генпроцессирующие и антигенпредставляющие клетки. Они происходят из стволовой клетки костного мозга, проходят стадии циркулирующих в крови промоноцита и моноцита и мигрируют в ткани (стадия гистиоцита или тканевого макрофага). Они несут на своей поверхности рецепторы, не­обходимые для захвата микробных клеток, а также рецепторы Fe-области иммуноглобулинов и комплемента, необходимые для осуществления ре­акций с участием антител.

Макрофаги и цитотоксические лимфоциты осуществляют клеточ­ный иммунный ответ (реакции гиперчувствительности замедленного типа, уничтожение собственных инфицированных и опухолевых клеток).

Дендритные клетки участвуют в иммунном ответе как антиген- представляющие клетки. Они происходят из костного мозга, локализуют­ся в лимфоидных органах, эпидермисе кожи и в слизистых оболочкак ды­хательных путей. Обладают рецепторами, распознающими патоген-ассо- циированные молекулярные структуры микробов. Фагоцитирующей ак­тивностью обладают только их незрелые формы, которые захватывают антиген, после чего начинают созревать. Зрелые дендритные клетки про- цессируют антиген и представляют его Т-лимфоцитам.

12.2.4. Формирование специфического иммунного ответа

Процессинг антигена - это его модификация (ферментативная об­работка, например, микробной клетки), в результате которой:

" антигенная детерминанта делается доступной для лимфоцитов;

■ крупные белковые молекулы превращаются в пептиды, при этом сгла­живаются конформационные различия, что требует меньшего раз­нообразия Т-рецепторов;

■ глубокий протеолиз делает возможным распознавание внутренних антигенных структур микробной клетки, которые меньше, чем вне­шние подвержены мимикрии под «свое».

Функцию процессинга и представления антигена Т-лимфоциту вы­полняют макрофаги, В-лимфоциты, дендритные клетки, купферовские клетки печени и др. Процессированный антиген в комплексе с молекулой МНС II класса экспрессируется на поверхности антигенпредставляющей клетки и распознается Т-хелпером.

Взаимодействие иммунокомпетентных клеток (рис. 12). Узна­вание Т-хелпером антигенного комплекса приводит к его активации, в ре­зультате которой лимфоцит синтезирует интерлейкины, стимулирующие пролиферацию (деление).

В-лимфоцит распознает «свой» антиген, перерабатывает его и пред­ставляет на своей поверхности его фрагмент в комплексе с молекулой МНС II класса. Этот комплекс распознается активированным Т-хелпером, ко­торый в ответ секретирует ряд интерлейкинов, под действием которых В-клетка дифференцируется, образуя клон плазматических клеток. Плаз­
матические клетки синтезируют иммуноглобулины, их секрецию стиму­лирует ИЛ-6, выделяемый активированными Т-хелперами.

Тимуснезависмые антигены могут вызывать выработку антител без участия Т-лимфоцитов. Как правило, это крупные молекулы с молекуляр­ной массой более 106, имеющие форму длинной, иногда разветвленной цепочки, на которых располагаются повторяющиеся идентичные эпито- пы. К ним относятся высокополимерные белки (флагеллин, ферритин), полисахариды (декстран, леван), бактериальные липополисахариды, не­которые синтетические полимеры (поливинилпирролидон). Многие из этих антигенов способны к длительному персистированию в организме. Они легко индуцируют антителообразование, но антитела к ним облада­ют низким аффинитетом.

12.2.5. Развитие иммунной системы

Рис. 12. Взаимодействие иммунокомпетентных кле­ток. Антиген: а - В-клеточный эпитоп, б - Т-клеточ- ныйэпитоп; 1 - антигенпредставляющая клетка (мак­рофаг); 2 - неактивированный Т-хелпер; TCR - Т-клеточный рецептор: 3 - активированный Т-хел­пер: ЦР - цитокиновый рецептор; 4 - В-лимфоцит.
првл>!ф»рац/<я. продукция UHtSKHHUS
пролиферация, лифференцироока.

Филогенез. На ранних этапах эволюционного развития защитные реакции носят неспецифический характер. У простейших они ограничи­ваются поглощением и ферментативным расщеплением чужеродных аген­тов, у примитивных многоклеточных имеются защитные барьеры и спе­циализированные фагоциты. Лимфоидные клетки, способные к распоз­
наванию антигена и обладающие иммунологической памятью, появляют­ся только у низших хордовых. Рыбы имеют один класс иммуноглобули­нов, сходный с IgM. У лягушек и рептилий уже есть IgM и IgG. Классы и подклассы иммуноглобулинов человека имеют наибольшее сходство с иммуноглобулинами человекообразных обезьян. В эволюции иммуно­глобулинов отмечают три основных этапа: 1) появление V и С областей тяжелых и легких цепей, 2) появление основных классов тяжелых цепей и типов легких цепей, 3) появление подклассов иммуноглобулинов.

Онтогенез. У человека лимфоциты на ранних этапах кроветворе­ния образуются в желточном мешке. На 4-й неделе внутриутробного раз­вития их основным источником становится печень, а позже - костный мозг, где В-лимфоциты проходят антигеннезависимую дифференцировку и приобретают IgM на своей поверхности. Затем они покидают костный мозг и заселяют периферические органы иммунной системы. Контакт с антигеном стимулирует их антигензависимую дифференцировку в плазматические клетки. Последние начинают синтезировать иммуноглобу­лины: IgM-на 10-й, IgG - на 12-й, IgA- на 30-й неделе внутриутробного развития. У новорожденных уровень собственных иммуноглобулинов не­значителен, а присутствуют в основном материнские IgG, которые исче­зают к 9 месяцам, когда иммунная защита обеспечивается выработкой соб­ственных антител. Предшественники Т-лимфоцитов на 6-8-й неделе внут­риутробного развития заселяют тимус, где происходит их антигеннезави- симая дифференцировка. Начало синтеза компонентов комплемента во вре­мени почти совпадает с началом синтеза иммуноглобулинов.

12.3. Аллергия

Обычно, говоря об иммунитете, имеют в виду полезные для организ­ма защитные реакции. Однако следствием иммунных реакций могут быть и патологические изменения в организме. Эта измененная реактивность, возникающая под влиянием антигенов, носит название аллергии, а вызывающие ее вещества - аллергенов. Аллергены подразделяют на бы­товые (пыль пуховых подушек, эпидермис и шерсть домашних животных), растительные (пыльца), производственные (пыль хлопка, шерсти, красите­ли, лаки и т. д.); пищевые (яйца, земляника, цитрусовые, шоколад и др.), лекарственные (ацетилсалициловая кислота, сульфаниламиды, антибиоти­ки и др.). Аллергические реакции подразделяют на 5 основных типов.

Реакции I типа (анафилактические) могут быть вызваны пыльцой растений, органическими компонентами пыли. Аллергены активируют спе­цифическую популяцию Т-хелперов, которые в свою очередь активируют

В-лимфоциты, вырабатывающие IgE. Эти антитела способны прочно свя­зываться с Fc-рецепторами клеток-мишеней (тучные клетки, базофилы).

Повторно попадающий в организм аллерген взаимодействует с IgE, фиксированными на клетках, что сопровождается цепной реакцией клет- ки-мишени, которая начинает выделять медиаторы (гистамин, кинины, гепарин, факторы хемотаксиса), воздействующие на клетки гладкой мус­кулатуры, кровеносных сосудов, желез внутренней секреции. В результа­те развивается клиническая картина анафилактических заболеваний, симп­томы которых зависят от локализации сенсибилизированных клеток: ри­нит, конъюнктивит, бронхиальная астма, анафилактический шок.

Аллергические реакции II типа называют цитотоксическими, они связаны с выработкой IgG против антигенных компонентов мембран кле­ток организма. Такими компонентами могут быть аутоантигены клеток организма или антигены, вторично фиксированные на клеточных мемб­ранах, например, лекарственные аллергены. Комплекс IgG с этими анти­генами способен связывать комплемент и активировать его по классичес­кому пути. В результате клетка погибает (комплементзависимый цитолиз). Таков механизм аллергических реакций к пенициллину, сульфанилами­дам, при переливании крови, отторжении трансплантата, аутоиммунных заболеваниях. В то же время реакции этого типа играют защитную роль, обеспечивая элиминацию поврежденных, опухолевых и инфицированных паразитами клеток.

Реакции III типа - это реакции, обусловленные образованием им­мунных комплексов (ИК). Образование ИК является перманентно проте­кающей физиологической реакцией, а патологические реакции на ИК могут быть связаны с нарушением механизмов их уничтожения клетками фагоцитарной системы. ИК способны активировать компоненты плазмы (системы комплемента, свертывания крови, хемотаксис) и определенные клетки (гранулоциты, тромбоциты и др.). Активированные клетки выде­ляют биогенные амины, ферменты, кинины и другие медиаторы, обус­ловливающие патологический процесс. В зависимости от вида антигена и его локализации, наблюдаются различные клинические проявления за­болевания.

Эндогенные антигены вызывают аутоиммунные заболевания: сис­темную красную волчанку, ревматоидный артрит, пузырчатку и др. Ответ на экзогенные антигены проявляется как сывороточная болезнь, феномен Артюса, ряд инфекционных заболеваний. Сывороточная болезнь разви­вается при введении сывороток и других лекарственных препаратов, ее клинические проявления - артрит, эндокардит, гломерулонефрит и др.

Феномен Артюса - это местная реакция, которая развивается в локусе попадания антигена (укус насекомых, введение лекарственных препара­тов) на коже и прилегающих тканях. С образованием ИК связан патогенез инфекционных заболеваний различной этиологии: вирусных (гепатит В, корь), бактериальных (стрептококковых, менингококковых, вызванных микоплазмами и др.), протозойных (малярия, трипаносомоз), гельминто- зов. Кроме того, ИК участвуют в патогенезе опухолевых заболеваний и при отторжении трансплантата.

Рассмотренные три типа аллергических реакций обусловлены ан­тителами и развиваются через несколько минут после введения антигена, поэтому их называют реакциями немедленного типа. Они существенно отличаются от реакций IVтипа, опосредованных клетками, или реак­ций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), которые про­являются не ранее 6-8 ч, обычно через 24-48 ч после введения антигена. Основой этих реакций является не гуморальный, а клеточный иммунитет. В реакции принимают участие Thl-лимфоциты, несущие специфические для данного антигена рецепторы. В результате распознавания комплекса антигена с молекулами МНС И класса начинается пролиферация лимфо­цитов, высвобождение лимфокинов и реализация цитотоксического эф­фекта. Лимфокины (фосфолипиды, пептиды) - медиаторы клеточного иммунитета активируют макрофаги или непосредственно воздействуют на клетки-мишени. Активированные макрофаги обладают повышенной фагоцитарной и микробоцидной активностью. Активированные лимфо­циты (Т-киллеры) вступают в тесный контакт с клеткой-мишенью, обус­ловленный одновременным связыванием антигена и молекул МНС соот­ветствующими рецепторами. Активируются ферменты Т-лимфоцита, на­рушающие проницаемость мембраны клетки-мишени, которая в резуль­тате лизируется. Контакт Т-лимфоцита и клетки-мишени продолжается около 1 часа, лимфокины появляются в течение 1-12 ч, а первые некрозы - через 24-48 ч.

Т-клеточная цитотоксичность проявляется при противоопухолевом, противовирусном и трансплантационном иммунитете. Гиперчувствитель­ность замедленного типа развивается при туберкулезе, лепре, бруцеллезе, пневмококковых и стрептококковых инфекциях, дифтерии, микозах, гель- минтозах. Возможно развитие ГЗТ при контакте с гаптенами — химичес­кими веществами, в том числе лекарственными, которые образуют комп­лексные антигены с белками кожи.

Аллергические реакции IV типа выполняют не только патогенети­ческие, но и защитные функции, повышая активность клеточного имму­нитета. На этом принципе построена активная иммунизация против ту­беркулеза, когда детям в первые часы их жизни вводят ослабленную куль­туру туберкулезной палочки (вакцину BCG), которая повышает реактив­ность организма и предотвращает развитие заболевания.

Сенсибилизированные Т-лимфоциты годами сохраняются в организ­ме и при повторном попадании антигена вступают с ним в реакцию. На этом основаны кожные диагностические реакции на инфекционные забо­левания (туберкулез, микозы).

В естественных условиях часто наблюдаются комбинированные формы клеточных и гуморальных аллергических реакций.

Реакции V типа обусловлены образованием антител к рецепторам или медиаторам определенных физиологических реакций, например, к рецепторам гормонов, в результате чего нарушается гормональная регу­ляция организма.

Лечение и профилактика аллергии предусматривает выявление аллергенов и прекращение контактов с ними, применение препаратов, угнетающих иммунный ответ (иммунодепрессантов), при анафилаксии - неспецифических средств (новокаин, димедрол, кальция хлорид), или используют метод десенсибилизации. Одним из способов десенсибили­зации является дробное введение антигена. Небольшие порции антигена, вводимого дробно, связывают циркулирующие в крови антитела и пре­дотвращают развитие аллергической реакции. Иммунные комплексы воз­можно удалить с помощью плазмафереза. На производстве необходимо соблюдать меры безопасности для предотвращения контакта с аллергена­ми (микробными клетками, их продуктами, химическими веществами). Эти меры предусматривают герметизацию оборудования, автоматизацию процессов производства, индивидуальные меры защиты.

Толерантностьи аутоиммунитет

При нарушении толерантности к собственным антигенами развива­ются аутоиммунные заболевания, например, системная красная волчан­ка, ревматоидный… ® повреждение клеточных мембран, например, при вирусных инфек­циях; • попадание в организм антигена, эпитопы которого близки к эпито- пам аутоантигена (мимикрирующие антигены);

Контроль качества иммунобиопрепаратов

Производство и контроль биопрепаратов регламентируется специ­альными требованиями. Критерии и параметры, которым должен соот­ветствовать каждый… Этапы развития системы качества в производстве включают обес­печение и… Высокое качество продукта может быть достигнуто только путем пос­ледовательного соблюдения принятых правил…

Клостридии

С. perfringens размножается во внешней среде. Однако размноже­ние происходит при температуре не менее 18-20 °С и при достаточном количестве… Для прорастания спор необходим температурный шок, т. е. прогре­вание при 70 °С… В отечественной практике о давности фекального загрязнения су­дят, сопоставляя индексы БГКП и С. perfringens. Если оба…

Стафилококки

Превосходство этих бактерий как СПМ над стрептококками зак­лючается в более простой и быстрой индикации, неприхотливости к пи­тательным средам.… Бактериофаги В качестве СПМ предложено использовать бактериофаги кишечных бактерий (эшерихий, сальмонелл и шигелл). Кишечные фаги…

Роль м и к р о о р г а н и з м о в - к о н т а м и н а н т о в лекарствен­ных средств впатологи и человека

Инфекционные заболевания, возникающие в результате использо­вания контаминированных ЛС, могут иметь разную локализацию и кли­ническую форму: ^1) гнойно-септические инфекции (местные или генерализованные); 2) грибковые поражения кожи, слизистых, глаз и других органов;

Количественное определение энтеробактерий за исключением Escherichia coli и Salmonella spp.

Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, исполь­зуя для этого среду № 3. В три пробирки с 10 мл среды № 3 вносят 1 мл гомогената в… Таблица 29 Количественное определение энтеробактерий …  

Испытание на наличие Escherichia coli и Salmonella

spp.

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл пита­тельной среды № 11 (лакгозный бульон). В случае если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубиру­ют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 2-5 ч 10 мл среды № 11 пере­носят в 100 мл среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32,5± 2,5) °С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде № 3 (сре­да прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испы­тания продолжают.

Испытание па Е. coli

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую- щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизи­рующие цитрат натрия и…

Испытание на виды Salmonella

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую- щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не фермен­тирующие сахарозу и…

Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

При наличии на среде № 9 подозрительных на Pseudomonas aeruginosa колоний зеленоватых или серовато-зеленоватых, прозрачных, плоских, с изменением… Если в препарате обнаружены грамотрицательные неспорообразу- ющие палочки,… При наличии на среде № 10 золотисто-желтых колоний, образован­ных грамположительными кокками и окруженных желтыми…

Способы устранения антимикробного действия ле­карственных средств

увеличение рабочего разбавления препарата (за счет большого объе­ма фосфатного буферного раствора); добавление специфических инактиваторов (например, пеницилли- назы для… использование неспецифических инактиваторов-нейтрализаторов, особенно для препаратов с консервантами, например,…

Глава 17. БОРЬБА СМИКРОБАМИ-КОНТАМИНАНТАМИ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

17.1. Действие физических и химических факторов

на микроорганизмы

Микроорганизмы обладают значительно большей толерантностью к физическим и химическим факторам окружающей среды, чем растения и животные. Некоторые из бактерий способны размножаться при темпе­ратуре от-12 °С до +104 °С, в диапазоне значений рН от 1 до 13, гидро­статическом давлении от 0 до 1400 атм, не погибают при интенсивном облучении, живут в бидистиллированной воде и в насыщенных раство­рах солей. Вместе с этим каждый вид микроорганизмов имеет свои на­следственно закрепленные зоны влияния конкретных воздействий: опти­мальные, подавления роста, гибели.

Физические факторы, влияющие на рост микроорга­низмов

Мезофилы обитают главным образом в организме человека и тепло­кровных животных. Оптимальная температура их роста составляет 30-37 °С, максимальная… Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее… Реакция среды. Для большинства бактерий оптимальными для рос­та и размножения являются среды с нейтральным значением…

Чувствительность микроорганизмов к поврежда­ющим факторам

Воздействие на микроорганизмы высоких температур Повышенная температура вызывает денатурацию и разрушение жизненно важных молекул клетки; при… По показателю устойчивости (резистентности) различают следую­щие группы… 1) чувствительные - неспорообразующие бактерии, плесневые грибы, вирусы;

Воздействие на микроорганизмы химических ве­ществ с неспецифической антимикробной активностью

Влияние температуры на активность биоцида выражается фор­мулой: К, или

Требования, предъявляемые к химическим дезинфек- та и там и антисептикам

2. Низкая токсичность и отсутствие раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки персонала. 3. Широкий спектр антимикробной активности, с ее проявлением в мак­симально… 4. Способность хорошо смачивать объекты и не оказывать на них кор­розирующего или другого разрушающего действия.

Микробная контаминация растворов антисептиков и дезинфектантов

Микроорганизмы попадают в растворы в процессе их приготовления, хранения и использования. Источниками являются исходные сухие вещества,… Вторичная контаминация может появиться в результате неправиль­ного хранения и… Последствием использования контаминированных растворов дезин­фектантов и антисептиков является опасность загрязнения…

Мероприятия по созданию помещений нормируемых классов чистоты

Типы зон по GMP ЕС для различных операций стерильного производства

1. Строительно-планировочные мероприятия предусматрива­ют правильное размещение помещений того или иного класса чистоты в производственном здании. Помещения классов чистоты А, В и С нельзя
размещать в цокольном этаже, подвале. Необходимо исключить любую возможность скапливания пыли как источника механических и микроб­ных частиц, поэтому не должно быть труднодоступных мест, не поддаю­щихся очистке, следует избегать установки полок, планок, шкафов, стел­лажей и др. В помещениях должны быть гладкие поверхности стен, пола, потолка, без шероховатостей и трещин. Запрещено применение деревян­ных поверхностей. Покрытия выбирают с учетом их устойчивости к дей­ствию моющих и дезинфицирующих средств, а для пола - и к механичес­ким воздействиям. Используют закругленные сопряжения между полом, потолком и стенами. Должна быть предусмотрена тщательная герметиза­ция подвесных потолков с целью предотвращения загрязнения из про­странства над ними. В зонах А и В запрещается устанавливать раковины, сточные трубы, открытые коммуникации.

2.Подготовка вентиляционного воздуха При подготовке и подаче воздуха в производственные помещения необходимо правильно расположить воздухозаборные устройства по вы­соте и направлению ветра: не менее 2-х метров над крышей с подветрен­ной стороны. Очистка приточного воздуха должна быть ступенчатой. Ко­личество ступеней обуславливается требуемой чистотой воздуха в поме­щениях (табл. 35).

Таблица 35

Принцип ступенчатой системы подготовки воздуха
Класс помещений Количество ступеней очистки Уровень очистки от микробных клеток и механических частиц, %
D ] 40-60
С до 80
А и В

 

В помещениях класса А создают горизонтальные или вертикальные ламинарные потоки стерильного воздуха, который поступает со скорос­тью 0,3-0,6 мсч. На каждой ступени очистки следует предусмотреть шту­церы для отбора проб воздуха и определения концентраций механичес­ких частиц до и после фильтра. Производительность системы вытяжной вентиляции должна составлять 80-90 % от производительности системы приточной вентиляции для обеспечения подпора воздуха в «чистых по­мещениях».

Необходимо соблюдать кратность воздухообмена, которая пропор­циональна удельному тепловыделению и обратно пропорциональна вы­соте помещения.

3. Санитарная подготовка оборудования и помещения к работе

До и после технологического процесса проводится мойка и стери­лизация съемных частей или обработка внутренних и наружных поверх­ностей моющими и дезинфицирующими средствами.

В качестве моющих средств применяют вещества из группы ПАВ: «Сульфонол», «Катамин-АБ», «Прогресс», а в качестве дезинфицирую­щих - пероксид водорода, «Гибитан», трикрезол, спирт этиловый. Съем­ные части (узлы) оборудования, непосредственно соприкасающиеся с ле­карственными веществами, тщательно моют в растворе моющего сред­ства, затем споласкивают водой очищенной, и водой для инъекций, про­фильтрованной через мембранный фильтр с порами диаметром не менее 5 мкм. Вымытые узлы заворачивают в 2 слоя пергаментной бумаги и пе­редают на стерилизацию. Стерилизуют при избыточном давлении 0,11 МПа (120 ± 1) °С в течение 45 мин с последующей подсушкой при остаточном давлении 0,07 МПа не менее 10 мин. Стерилизацию нераз­борных участков технологического оборудования рекомендуется осуще­ствлять острым паром 60 мин при температуре (120 ± 1) °С. Наружные поверхности обрабатываются дезинфицирующими растворами.

Под подготовкой чистых помещений к работе подразумевают комп­лекс мероприятий в соответствии с письменной инструкцией, состоящий из влажной уборки и дезинфекции стен, полов и различных поверхнос­тей, направленный на достижение соответствующего класса чистоты. Следует использовать разные дезинфицирующие вещества и проводить регулярный контроль окружающей среды с целью обнаружения устойчи­вых штаммов бактерий. Обязательно необходимо проверять микробное загрязнение дезинфицирующих растворов. Все моющие и дезинфициру­ющие средства, применяемые в производстве стерильных препаратов, должны быть стерильными.

4. Подбор и гигиеническая подготовка персонала

Персонал фармацевтических предприятий является одним из основ­ных источников контаминации ГЛС и полупродуктов механическими ча­стицами и микроорганизмами.

Весь персонал, работающий на предприятии, должен иметь знания и опыт, необходимые для выполнения соответствующих обязанностей, а также должен быть ознакомлен с правилами GMP.

Состояние здоровья персонала является важным фактором в систе­ме обеспечения качества ГЛС, поскольку человек может быть источником инфекции или способствовать ее переносу. Весь персонал, занятый на производстве, должен проходить регулярные медицинские осмотры. К работе в помещениях классов чистоты А - С не должны допускаться люди страдающие аллергическими и кожными заболеваниями, повышен­ным отделением перхоти, а также курящие. Временно (до нормализации состояния здоровья) к работе не допускаются больные инфекционными заболеваниями и сотрудники, имеющие загар или различные поврежде­ния кожи. Персонал должен ставить в известность руководителей о лю­бых недомоганиях (острых респираторных, кожных) способных оказать нежелательное воздействие на качество ЛС.

Личная гигиена персонала. Персонал, работающий в производстве стерильных лекарственных средств, должен строго соблюдать правила личной гигиены: регулярно принимать душ, мыть голову не реже 2-х раз в неделю. Подготовка персонала к работе должна осуществляться в опре­деленном порядке. Во время работы необходимо носить технологичес­кую одежду, соответствующую выполняемым производственным опера­циям (ГОСТ Р 52538-2006).

Во время работы запрещается использование косметики, а также запрещается носить часы и ювелирные изделия, вносить в производствен­ные помещения личные вещи, запрещается принимать пищу и хранить еду, личные лекарства.

Правила поведения персонала. В производстве стерильных лекар­ственных средств необходимо строго ограничивать число работающих до минимально необходимого уровня. Вход персонала в производственные помещения классов чистоты А и В должен осуществляться через воздуш­ный шлюз. Перемещения персонала внутри помещений должны осуще­ствляться в определенном порядке в зависимости от выполняемых опера­ций. Запрещается бесцельное хождение во время работы. Все движения должны быть медленными и плавными. Запрещаются разговоры на по­сторонние темы; устное общение с людьми, находящимися вне производ­ственных помещений, осуществляется через телефон или селектор. Зап­рещается смех, крики, так как при этом увеличивается число выделяемых изо рта микроорганизмов. Нельзя поднимать и использовать упавшие на пол во время работы предметы. Запрещается использование карандашей, перьевых ручек, разрешается применение шариковых ручек или фломас­теров, которые один раз в смену протирают салфеткой из специальной ткани, смоченной этиловым спиртом.

Обо всех нарушениях и неблагоприятных изменениях санитарного режима персонал должен сообщать руководителю.

Неправильная подготовка и поведение персонала приводит к резко­му снижению показателей микробиологической чистоты и может превра­тить помещения класса чистоты А в класс С.

Изолирующая технология

Одним из способов создания асептичных условий производства яв­ляется изолирующая технология. Эта технология предусматривает физи­ческую изоляцию рабочей зоны от окружающего пространства за счет применения герметичного изолятора. Изолятор - это локальное контро­лируемое пространство, ограниченное оболочкой с целью изоляции внут­ренней среды от наружной таким образом, чтобы перенос потенциаль­ных загрязнений из одной среды в другую был сведен до минимума или исключен. Правилами GMP установлено, что для асептического произ­водства пространство, окружающее изолятор, должно, по крайней мере, соответствовать зоне D. Это существенно более простое условие, чем требование к чистоте в обычной технологии чистых помещений. Оно по­зволяет значительно снизить затраты на строительство и эксплуатацию чистых помещений.

Изолятор обеспечивает:

■ разделение процесса и оператора;

■ разделение циркуляции воздуха внутри изолятора и вне его;

■ возможность эффективной биологической деконтаминации внутрен­него пространства изолятора;

■ стерильную передачу материалов в изолятор и из него.

18.3.2. Микробиологический контроль эффективности

подготовительных мероприятий до и в процессе работы

В помещениях высоких классов чистоты показатели микробиологи­ческой загрязненности обычно очень низкие, поэтому путем взятия еди­ничной пробы трудно получить статистически значимые результаты. Для получения достоверной информации используют программу текущего мониторинга производственной среды по всем контролируемым парамет­рам (влажность, температура, скорость воздушных потоков, уровень пе­репада давления между помещениями, уровень контаминации бактери­альными и механическими частицами), предусматривающую мероприя­тия, проводимые при нарушении нормируемых показателей.

Программа микробиологического мониторинга включает:

• определение микробной контаминации воздуха (КОЕ/м3);

• контроль критических поверхностей (непосредственно контактиру­ющих со стерильным материалом), рук и одежды персонала, рабо­тающего в асептических производственных зонах;

• оценку эффективности дезинфекции;

• проверку активности дезинфектантов;

• контроль эффективности работы стерилизующих воздушных филь­тров;

• валидацию методов микробиологического контроля (состав питатель­ных сред, способ их стерилизации, контроль стерильности, темпе­ратура и время инкубации и т. п.).

Расположение точек отбора проб воздуха и смывов с поверхностей устанавливают в процессе аттестации чистого помещения.

Ключевыми точками при текущем мониторинге являются:

• зоны наиболее высокой вероятности контаминации продукта;

• зоны наибольшего скопления микроорганизмов;

• труднодоступные зоны для уборки и дезинфекции;

• точки смежных зон (помещений классов А и В);

• зоны возмущения воздушных потоков рельефом поверхности. Микробиологическому мониторингу подлежат: воздух помещений,

технологическое оборудование, рабочие поверхности, руки оператора в перчатках, одежда персонала, контейнеры, в которых хранится продукт, вода, сжатый воздух (табл. 36). Реже контролируют стены, потолок и пол помещения, двери, транспортные тележки, контейнеры для сбора отхо­дов, приборы для тестирования.

Частота отбора проб зависит от класса чистоты помещения и харак­тера технологического процесса. Зоны класса А проверяют каждую рабо­чую смену, зоны класса В - каждую смену или ежедневно, класса С - два раза в неделю, класса D - еженедельно.

Отбор проб проводят в одно и то же фиксированное время. Обяза­тельными являются:

• контроль воздуха во время работы;

• контроль поверхности перед работой;

• руки оператора перед выполнением асептических манипуляций. Периодичность проведения микробиологического мониторинга мо­жет значительно варьировать в зависимости от конкретных показателей:

• типа производимого продукта;

• степени вмешательства человека в процесс;

• использования финишной стерилизации;

• данных предшествующего контроля.

Таблица 36 Примеры точек отбора проб
Система Точка отбора пробы Число контролируемых точек на одно помещение
Воздух (линия розли­ва) Около наполняемых ем­костей > 3
Воздух помещения Точки входа и выхода вентиляционной систе­мы, зона манипуляций с продуктом >3
Вода Кран водопользования или наполнительной ем­кости каждый кран или емкость
Поверхность (поме­щение) Рабочий стол >3
Поверхность (обору­дование) Поверхности, контакти­рующие с продуктом >3
Оператор линии розлива Руки в перчатках у каждого оператора
Сжатый воздух Наиболее удаленная от компрессора точка >3
Ламинарный поток Около объектов, создаю­щих возмущение потока >3

 

Объем пробы воздуха должны быть достаточным как для обнаруже­ния микроорганизмов в заданном объеме воздуха, так и для роста диск­ретных и пригодных к подсчету колоний на фильтрующей мембране или агаровой пластине.

Для снятия смывов с плоских поверхностей рекомендуемой являет­ся площадь 24-30 см2; при контроле рук оператора делают отпечатки паль­цев на агаре, смыв тампоном с одежды.

При контроле поверхностей, предварительно обработанных дезин­фицирующими растворами, для их инактивации необходимо добавлять в питательные среды нейтрализаторы, например, твин-80, лецитин и др.

Все выявленные в процессе мониторинга окружающей среды мик­роорганизмы подлежат обязательной макроскопической и микроскопи­ческой идентификации. При обнаружении споровых бактерий или гри­бов необходимо проводить дополнительную дезинфекцию помещений.

Идентификация дает возможность предположить источник конта­минации, основываясь на преимущественном распространении микроор­ганизмов во внешней среде.

Данные табл. 37 конкретизируют требования к классам чистоты, данные по КОЕ относятся к неспорообразующим микроорганизмам. При­сутствие спорообразующих бактерий и грибов недопустимо.

Таблица 37

Рекомендуемые пределы допустимого загрязнения чистых зон в эксплуатируемом состоянии (ГОСТ Р 52249-2004)
Тип зоны Рекомендуемые пределы микробного загрязнения
в воздухе, КОЕ/м3 седиментация ча чашку диаметром 90 мм, КОЕ за 4 часа контактные пластины диаметром 55 мм, КОЕ/пластина отпечаток перчаток (5 пальцев), КОЕ/перчатка
А <1 <1 <1 <1
В
С -
D -

 

Приведенные уровни микробной контаминации одежды и рук пер­сонала устанавливаются на конец рабочей смены, в начале смены перчат­ки и одежда должны быть стерильными.

18.3.3. Валидация

Валидация заключается в документированном подтверждении со­ответствия оборудования, условий производства, технологического про­цесса, методов контроля, качества полупродукта и готовой продукции действующим регламентам и требованиям нормативной документации. Валидация является неотъемлемой частью обеспечения качества J1C, в том числе и по микробиологическим показателям.


Рекомендуемая литература

1. Асептическое производство медицинских иммунобиологических препаратов: Методические рекомендации. МУ 44-116. -М., 1997.

2. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности. Санитар­ные правила СП 1.2.011-94. - Госкомсанэпиднадзор России. - М.. 1994. - 252 с.

3. Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности и гель­минтами. Санитарные правила СП 1.2.731-99. - М.: Федеральный центр Госса­нэпиднадзора Минздрава России. 1999. - 107 с.

4. Брок Т. Мембранная фильтрация. -М.: Мир, 1987. - 462 с.

5. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Миндукшев И.В., Юрлова Н.А. Промышленная микология. СПб.: 2003. -217 с.

6. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Кочеровец В.И., Курбанова И.З. Питательные сре­ды. Справочник. - СПб.: Проспект Науки, 2006. - 336 с.

7. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Каграманова К.А., Карцев В.В., Потехина Т.С. Са- нитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической про­мышленности. - СПб., 2004. - 248 с.

8. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Кочеровец В.И., Потехина Т.С. Фармацевтичес­кая микробиология. - М.: Арнебия, 2003. - 352 с.

9. Глик Б., Пастренак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и примене­ние. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

10. Государственная Фармакопея. Выпуск 2. МЗ СССР, 11-е изд., -М.: Медицина, 1989. -400 с.

11. Изменения к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекарствен­ных средств (ГФ-XI, вып.2, с. 187), введенные с 1.06.1996. - 17 с.

12. Изменение № 1 к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекар­ственных средств от 26.12.1995 г.

13. Изменение № 2 к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекар­ственных средств от 14.08.2001 г.

14. Изменение № 3 к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекар­ственных средств от 19.03.2003 г.

15. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 356 с.

16. ЗаикинаН.А., Галынкин В.А., Гарабаджиу А.В. Иммунобиотехнология. -СПб., 2005.-354 с.

17. Кочеровец В.И., Галынкин В.А., Заикина Н.А. Фармацевтическая микробиоло­гия. Словарь терминов. - М.: Арнебия, 2004. - 182 с.

18. Красильников А.П. Справочник по антисептике. Мн.: Высшая школа, 1995. - 367 с.

19. Машковский М.Д. Лекарственные средства, ч. II. М.: Медицина, 1994. - 686 с.

20. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев O.K. - М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - 1200 с.

21. Микробиологический мониторинг производственной среды. МУК 4.2.734-99. М„ 1999.-31 с.

22. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. М.: Мир, 1995. - 343 с.

23. Определитель бактерий Берджи / Под. ред. Дж. Хоулта и др. М.: Мир, 1997. - 800 с.

24. Организация и контроль производства лекарственных средств. Стерильные ЛС. МУ 42-51-1-93, МУ 42-51-26-93. М„ 1993.-73 с.

25. ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества ле­карственных средств.

26. Панарин Е.Ф. Полимерные лекарства и биологически активные вещества. Итоги полувековых исследований и перспективы // Полимеры и медицина. - 2005. - №1. - С. 20-24.

27. Сборник руководящих нормативных документов по предупреждению микроб­ной обсемененности нестерильных лекарственных средств (РДИ 64-28-84, 4-31-84).

28. Страчунский Л.С., Козлов С.П. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. - М.: Боргес, 2002. - 436 с.

29. Фундаментальные направления молекулярной медицины. - СПб.: Росток, 2005. - 399 с.

30. «Чистые помещения» / под. ред. Федотова А.Е. М.: Асинком. 2003. - 576 с.

31. Щелкунов С.П. Генетическая инженерия. Новосибирск: Изд. Новосибирского университета. 1994. - 303 с.

32. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина. 1999. - 607 с.

33. Biology of the Procaryotes. Edited by J.W. Lengeler, G. Drews, H.G. Schlegel. Thieme, Stuttgart, New-York, 1999. - 955 p.

34. Biotechnology of Antibiotics. 2-d ed. New-York-Basel-Hong Kong, 1997. - 842 p.

35. Pharmaceutical Microbiology. 7Л Ed. by W.B. Hugo, H.D. Russel. Blackwell Science, 2004.-481 p.

36. Russel, Hugo, Ayliff's. Principles and Practice of Desinfection, Preservation and Sterilization. 4>h Ed. Blackwell Publishing, 2004. - 678 p.


Предметный указатель

«с» - после номера страницы - термин упоминается на последующих страницах Автоклав 25

Автотрофные бактерии 23 Адаптация 72 Адгезины 62 Адгезия 69 Аддитивность 108 Адсорбция 46 Адъюванты 176с Азот 29с

Азотфиксирующие бактерии 29 Аксостиль 64 Активный выброс 143 Актиномицеты 11,31 Аллергены 162с, 177с Аллергия 162с Амебоидное движение 63 Амебы 63 Аминокислоты И Аммонификация 30 Амфиболизм 21 Анаболизм 21 Аналоги нуклеозидов 53 Анаморфы 34 Анатоксины 172 Анафилаксия 162 Анаэробные бактерии 27 Аноксигенные бактерии 28 Антагонизм 196 Антеридии 36 Антибиотики 74с

- влияние на нормальную микробиоту 199

- промышленное производство 74с

- спектр действия 74с

- устойчивость к ним 117с Антивирусные препараты 53 Антигены 151с, 161 Антиметаболиты 121 Антимикробное действие ЛС 237с, 244


Антисептика 254с Антисептики 130

- методы оценки 135с

- механизм действия 139с

- резистентность к ним 142с Антитела 152с, 197

- моноклональные 183с

- неполные 155

- структура 153 Апоптоз 158с Архебактерии 9 Асептика 254с Аск (сумка) 37

Аскомицеты (сумчатые грибы) 41 Ауксотрофные организмы 24, 91 Аутоиммунные заболевания 165с Аутоиндукция 20 Аэробы 26

Базальное тельце 15 Базидии 36 Базидиомицеты 39 Бактериальная клетка 11 с Бактериофаги (фаги) 46с, 206 Банк клеток 175 Безопасность 102, 181с Белки 29, 45, 152

- биосинтез 49, 118 Биодеградация 226 Биоиндикаторы 91, 263 Биолюминесценция 20 Бионагрузка 255 Биопленка 124, 144 Бифидобактерии 199 Брожение 26

Вакцины 170с Валидация 264, 282 Векторы 96 Вирионы 45 Вирулентность 68с, 174 Вирусы 45с, 142с, 154 Витамины 92

Внешняя мембрана 13, 143 Вода 206с, 219с, 228


Воздух 221с, 274с Воздушная микробиота 209 Волоски, ворсинки (см. Пили) 69 Воска 145 Воспаление 148 Время генерации 25 Выборочная проба 237

Гаптены 152 Генная инженерия 94с Генные кассеты (кластеры) 126 Гены 20с

- регуляторные 22 -резистентности 125с

Гибридомы 183с

Гигиена на производстве 269с

Гифы 36

Главный комплекс гистосовместимости 152с Гликозидные связи 11, 36 Гликоконъюгаты 36, 152 Госпитальные инфекции 128 Грамотрицательные бактерии 13, 142, 230 Грамположительные бактерии 13, 142 Грибы 33с, 219, 229

Дезинфектанты 130с Дезинфекция 130с

- промышленная 264с Декстран (а-1,6-глюкан) 92, 194 Дендритные клетки 160 Денитрификация 30 Депротеинизация 49 Дерепрессированные мутанты 22 Дефенсины 148

.ието-Диаминопимелиновая кислота 11 Дигидроптеровая кислота 121 Дипиколиновая кислота 16 Дисбактериоз (дисбиоз) 199 ДНК 94с

- вирусов 45

- гибридизация 94с ДНК-лигаза 95 ДНК-полимераза 96 ДНК-содержащие вирусы 45 Домены 155

Доноры водорода (электронов) 23

- углерода 23 Дрожжи 37, 235 Дыхание 26с

Дыхательные пути, микробиота 195 Естественные клетки-киллеры 151 Жгутики 15, 59

Жгутиковые (жгутиконосцы) 64

Зигомицеты 34

Идиотипы 156 Идиотрофы 24 Изоантигены 152 Изолирующая технология 280 Иммунитет 148с Иммунная система 157с Иммунные комплексы 163

-сыворотки 179с Иммуногенность 151с, 173 Иммуноглобулины 153с, 179с Иммунокомпетентные клетки 159с Иммуномодуляторы 165, 178с Иммунопрепараты 170с Индикаторные бактерии 263 Интерлейкины 160 Интерфероны 53, 149

- индукторы 54 Инфекционные заболевания 71с Инфузории 65с Ионизирующая радиация 258с

Капсид 46 Капсомеры 46 Капсулы 14, 37, 69 Карантин 222 Каротиноиды 92 Катионные пептиды 79, 148 Кворума чувство 20 Кинетика роста 25с Кислотоустойчивые бактерии 15 Кишечная микробиота 192 Классы чистоты 275с

Клеточная стенка 11, 36, 117 Клеточное деление 19,25 -ядро 18, 37

- цикл 19 Клонирование 98 Клостридии 204

КОЕ (колониеобразуюшая единица) 202 Кожная микробиота 193 Колиформные бактерии 195с, 203, 231 Комплемент 148с Конидии 34 Консерванты 133с Константа скорости деления 25 Контаминация микробная 212с, 268 Контроль качества вакцин 185

- иммуноглобулинов 184

- лекарственных средств 272с Конъюгация 19, 97 Ксенобиотики 143

Культивирование микроорганизмов 175с

Культура ткани 176

(З-Лактамаза 75с, 91

Лейкоциты 150

Лекарственные вещества 211

- препараты 211

- средства (ЛС) 211

- сырье 211с

- формы 211

- их качество 227с, 272с

- контроль 235с

- микробиота 211 с, 225с Лектины 69

Лизогенные бактерии 48 Лимфатические узлы 158 Лимфоидная ткань 158 Лимфоциты 159с ЛипидА 13 Липиды 37

Липополисахариды 69 Липосомы 177 Литический цикл 48 Литотрофные организмы 23 Лишайники 39 Лучистая энергия 251с, 258с Люминесценция 39

Макрофаги 150, 159с Мезосомы 15

Мезофильные бактерии 249

Мейоз (редукционное деление) 33

Мембранная фильтрация 239, 247, 260

Мембраны 15, 121

Метаболизм (обмен веществ) 21 с

Мигрирующие генетические элементы 19

Миелома 183

Микобактерии 118, 142

Миколовые кислоты 118, 145

Микоплазмы 9, 113

Микориза 39

Микотоксин 40

Микробиологические производства 213 Микробиота воды 206с

- воздуха 209

- почвы 208

- тела человека 192с Микробная трансформация 91 Микробоносительство 222 Микротрубочки 38 Микрофибриллы 38 Микрофиламенты 36 Мимикрирующие антигены 69, 153 Митохондрии 37

Мицелий 33 Мишень 125с, 140 Мониторинг 264с, 281 Муреин 9с, 117 Мутации (мутанты) 22, 98

Наружная (внешняя) мембрана 13, 143 Нейраминидаза 45 Нейтрофилы 150 Нестерильные ЛС 211с Нормальная микробиота 167, 191с Нуклеоид 18 Нуклеокапсид 45 Нуклеоплазма 37

Облигатно-паразитические бактерии 72 Обрастание 213

Обратная транскриптаза 46с, 127 Окрашивание по Граму 13

Опсонины 150

Органотрофные организмы 23

Передача информации 20 Перенос генов 19, 91 Персонал 222с, 279 Пили 16, 69

Пирогенны См. также Эндотоксины 13

Питание микроорганизмов 24

Питательные среды 24с, 174, 239

Плазматические клетки 160

Плазмиды 18, 125

Плазмокоагулаза 71

Плодовые тела 34с

Подвижность бактерий 15

Полипептиды 14с

Полисахариды 15с, 36

Половое размножение 33с

Посевной материал 91, 174, 224

Почва 209

Почкование 34

Правила GMP 86, 227, 269с

Прионы 57с

Производственные помещения 278 Прокариоты 9с Пролиферация 161

Промежуточный обмен (амфиболизм) 21 Простейшие 59с Протопласты 14, 99 Прототрофные организмы 24 Профаги 47 Процессинг 160 Псевдомонады 30, 97, 112 Психрофильные бактерии 249

Растения

- болезни 215с Регуляция метаболизма 22 Резистентность 105с, 123с. 142 Репродукционное размножение 33 Реснички 59

Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) 94с Рецепторы 46, 151, 159 Рибосомы 11, 37 Ризоиды 34

Риккетсии 72, 113 Риск 272с

РНК-содержащие вирусы 45 Рост микроорганизмов 25с

Санитарная микробиология 200с

Санитарно-показательные микроорганизмы 199с

Сапронозы 72

Селезенка 157

Селективные условия 236

Сенсорные системы 20

Серия (партия) 237

Симбиоз 39, 72

Синергизм 108

Скрининг 128

S-слой 13

Совершенные грибы 36 Специфичность антигенов 151с Споровики 59 Спорообразование 16 Спорообразующие бактерии 15 Споры 16с, 142с

- грибов 33с

- прокариот 16, 131 Стафилококки 109, 205 Стволовые клетки 157 Стерилизация 254с

- контроль 245, 262с Стерильные ЛС 218, 225 Суперантигены 153 Суспензионный тест 136 Сферопласты 14

Таксис 20

Таллом (вегетативное тело) 36 Тейхоевые кислоты 13 Телеоморфы 34 Термофильные бактерии 250 Тимус 157 Токсины 70 Толерантность 165с Транспозоны (Тп) 19, 125 Трансфекция 97 Трансформация 19, 97 Тучные клетки 163 Тяжелые металлы 168

Ультраструктура 33с Ультрафиолетовое облучение 251с Ундулирующая мембрана 64 Упаковочный материал 221с

Фаговая конверсия 48 Фагорезистентность 48 Фаготипирование 49 Фагоцитоз 150 Фактор(ы) роста 24

- виртулентности 126 Фармацевтическая промышленность 211с Фенотип 17

Ферментация 213 Ферменты

- ингибирование 22, 140

- индуцибельные 22

- патогенности 71

- регуляция 22 Фибринолизин 71 Фиксация азота 23 Фильтрация 200 Фимбрии 16

Фитопатогенные микроорганизмы 44 Фотореактивация 252 Фотосинтез 23 Фототрофные бактерии 23

Хемолитотрофные бактерии 23 Хемоорганотрофные бактерии 23 Химиотерапевтические препараты 104с, 117с

- механизм действия 117с -устойчивость к ним 105с, 117с

Химиотерапия 104с Хитин 37 Хламидоспоры 34 Хромосомы 37, 120

Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) 23

Цикл клеточный 18

Цисты 60с, 142

Цитокины 157с

Цитоплазма 15, 140

Цитоскелет 38

Цитотоксические реакции 159

Чистые помещения 275с, 282 Чувство кворума 20

Шизогония 61 Шизонты 61

Эволюция 161 Экзотоксины 70 Экология 38, 191с Экспоненциальный рост 26 Эндоплазматический ретикулум 37 Эндоспоры 16с

Эндотоксины См. также Пирогены 70

Энтеробактерии 195с, 219, 242

Энтерококки 203

Эозинофилы 150

Эпидемиология 72

Эпитоп 152

Эпифитная микробиота 215 Эубиотики (пробиотики) 199 Эукариоты 9

Ядерная мембрана 37 Ядро см. Клеточное ядро

- бактериальной клетки см. Нуклеоид


УКАЗАТЕЛЬ ЛАТИНСКИХ НАЗВАНИЙ

Acanthaamoeba 63 Acetobacter 92 Acremonium chrysogenum 75 Actinomyces 3J Agrobacterium 215 Ajellomyces 42 Altemaria 41 Amoebia 62 Apicomplexa 59 Arthrobacter 92 Ascomycetes 41, 216 Aschbya gossypii 92 Aspergillus 35, 41, 143, 216

Babesia 62 Bacillus 97, 143

- anihracis 30 -brevis 97

- cereus 30, 207

- licheniformis 199 -pumilits 263

- stearothermophilus 97, 263 -subtilis 97, 142, 199, 263

Bacteroides 194 Balantidium coli 65 Basidiomycetes 41 Bifidobacterium 199 Blakeslea 92

Blastomyces dermatitidis 42 Bordetell apertussis 30 Borrelia 30, 194 Botritis cinerea 216 Brevibacterium 92 Brucella 30

Burkholderia 30, 142, 225

Campylobacter 30 Candida 41, 142c, 193 Chlamydia 30 Choanephora 92 Chromatium 23

Chromobacterium 207 Chytridiomycetes 216 Ciliophora 59 Citrobacter 191, 231 Cladosporium 41, 216 Claviceps purpurea 216 Clostridium 30, 207, 225, 250 Corynebacterium 30, 92, 215 Cryptococcus 41 Cryptosporidium 62

Deuteromycetes 41, 216 Dientamoeba fragilis 67

Entamoeba 60c, 194 Enterobacter 143, 191, 225, 231 Enterococcus 199, 204, 234 Entomophthora 42 Epidermophyton 193 Erwinia 92, 215, 225 Erysiphe graminis 216 Escherichia 31, 148

-coli 92, 97, 142, 191, 199

Flavobacterium 207 Francisella 30 Fungi 33 Fusarium 41

Fusidium coccineum 80, 216 Fusobacterium 194

Giardia lamblia (Lamblia intestinalis) 64 Gluconobacter 92 Gymnosporangium 216

Haemophilus 31, 81

- influenzae 31, 124 Helicobacter 30, 195 Histoplasma capsulatum 42

Klebsiella 31, 124, 142c, 191, 225

Lactobacillus 92, 199 Lactococcus 79 Lamblia intestinalis 60c


Legionella 30 Leishmania 30, 60с Leptospira 194, 207 Leuconostoc 92 Lobosea 61

Malassezia 42 Micrococcus 209 Microsporum 42, 193 Mucor 34, 20

Mycobacterium 31, 111, 131, 143 Mycoplasma 9, 31, 194 Mycota 33

Neisseria 30, 81 Nitrobacter 23 Nitrococcus 23 Nitrosococcus 23 Nitrosomonas 23 Nitrosospira 23 Nitrospina 23 Nocardia 76, 79

Olpidium brassicae 216 Oomycetes 216

Paracoccidioides 39c Penicillium 216 -chrysogenum 75 - griseofidvum 80 -notatum 75, 142 Peptococcus 195 Phialophora 41 Phytium debarianum 216 Phytophtora infestans 216 Pityrosporum 193 Plasmodiophora brassicae 216 Plasmodium 59c Plasmopara viticola 216 Pneumocystis carinii 42 Propionibacterium 92 Proteus 31, 112, 124, 142, 191, 207 Protozoa 59 Providencia 233

Pseudomonas 30, 97, 112, 124, 142c, 191, 207, 215, 225


Ramilaria 216 Rhinosporidium 42 Rhizopus 34, 92 Rhodobacter 23 Rhodococcus 23 Rhodomicrobium 23 Rhodotorula 41 Rickettsia 31

Saccharomyces 34, 41, 199

Salmonella 31, 124, 142c, 191, 225

Sarcina 207

Sarcocystis 62

Sarcomastigophora 59

Sclerotinia 216

Serratia 124, 142c, 225, 233

Shigella 31, 233

Siderocapsaceae 23

Spirillum 30

Sporomusa 17

Sporosarcina 17

Sporothrix schenckii 41

Sporozoa 59

Staphylococcus 142, 234

-aureus 125, 142

- epidermidis 193 Streptococcus 125, 142, 193

-faecium 199

- pyogenes 195 Streptomyces 75c, 92, 97, 207

Thermoactinomyces 17 Thiobacterium 23 Thiocapsa 23 Thiothrix 23 Toxoplasma gondii 61 Treponema 30, 194 Trichomonas 64, 194 Trichosporon 60 Trichophyton 42, 142, 193 Trypanosoma 60c

Urocystis occulta 216 Ustilago 216

Veillonella 194 Verticillium 216 Vibrio 31,92

Xanthomonas 215

Yersinia 233

- enterocolitica 31, 249 -pestis 31

- pseudotuberculosis 31 Zygomycetes 42


fJ~f£? '' www.prospekMauki.ru, E-mail: info@prospektnauki.ru

Иммуно- и налобиотехнология: Учебное пособие. I В. А. Галынкин, О. И. Киселев, Н. А. Заикина и др. — СПб.: «Проспект Науки», 2008. — 224 с. ISBN 978-5-903090-16-7.

В книге представлены основные положения учения об иммунитете и вопросы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных, аллергических и других заболеваний. Описаны основные этапы получения классических вакцин и вакцин нового поколения, иммуномодуляторов, сывороток, иммуноглобулинов и моноклональных антител. Особое внимание уделяется вопросам качества иммунопрепаратов и безопасности их производства в соответствии с требованиями GMP. Книга предназначена для биотехнологов, микробиологов, инфекционистов и других специалистов, работающих в области производства и применения иммунопрепаратов, она

служит пособием при изучении курса иммунологии и биотехнологии.__________________________________

Вопросы обшей вирусологии: Учебное пособие. / Под ред. О. И. Киселёва и И. Н. Жилинской — СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова, 2007. — 374 с. ISBN 978-5-94542-209-4. Эксклюзивный продавец — «Проспект Науки».

Представлены данные о природе вирусов, их новейшая классификация. Проанализировано современное состояние проблемы вакцинации и перспективы ее развития. Рассмотрены вопросы общей иммунологии, основы антивирусного иммунитета, роль цитокинов в регуляции иммунологических процессов, особенности применения цитокинов в противовирусной терапии. Основу пособия составляют материалы лекций государственных сертификационных курсов по специальности «Вирусология», проводимых на базе ГУ НИИ гриппа РАМН совместно с СПбГМА им. И. И. Мечникова._______

Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов: Справочник. / В. А. Галынкин, Н. А. Заикина, В. И. Кочеровец, И. 3. Курбанова. — СПб.: «Проспект Науки», 2006. — 336 с. ISBN 5-903090-01-Х.

Книга содержит современные сведения о принципах изготовления питательных сред и их применения для выделения, идентификации и культивирования микроорганизмов разных таксономических групп с учетом их физиологических особенностей. Основное внимание уделяется видам, регламентированным для определения качества продукции пищевой и фармацевтической промышленности, с приложением справочника питательных сред, рекомендованных для этой цели. Книга предназначена микробиологам, эпидемиологам, биотехнологам и другим специалистам, занятым в сфере производства и микробиологического контроля качества продукции широкого

потреблении, а также студентам вузов и научным работникам._____________________________________

Санитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности / В. А. Галынкин и др. — СПб.: СПХФА, 2004. — 248 с. Эксклюзивный продавец — «Проспект Науки».

В книге рассматриваются микробиологические методы, регламентированные нормативной документацией для анализа гигиенических параметров производства и контроля качества продукции пищевой и фармацевтической промышленности. Показано значение микробиологического мониторинга производственной среды в соответствии с принципами системы анализа риска в критических контрольных точках и валидации как части системы обеспечения качества продукции. Книга предназначена для технологов пищевой и фармацевтической промышленности, микробиологов и специалистов, работающих в сфере государственного контроля и надзора за качеством продуктов

питания и лекарственных средств.______________________________________________________________

Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии с основами асептики и биотехнологии: Учебное пособие I В. А. Галынкин, Н. А. Заикина, Т. С. Потехина. — Курск: КГМУ, 2002. — 236 с. ISBN 5-7487-0563-Х. Эксклюзивный продавец — «Проспект Науки».

В книге изложены этапы практикума, которые студенты выполняют при прохождении курсов общей и санитарной микробиологии, основ промышленной асептики и биотехнологии, генетической и клеточной инженерии. Даны представления о современных методах обнаружения патогенных микроорганизмов и реакциях иммунитета. Рассматриваются методы промышленного культивирования микроорганизмов, основные параметры их роста и цитология развития некоторых продуцентов. Приведены основные сведения о генетической и клеточной инженерии и методах

генетического конструирования.________________________________________________________________

ИЗДАТЕЛЬСТВО «Проспект Науки» peklnauki.ru, E-mail: info@prospek Аннотированный указатель книг

Основы биотехнологии высших грибов: Учебное пособие. / Н. А. Заикина, А. Е. Коваленко, В. А. Галынкин и др. — СПб.: «Проспект Науки», 2007. — 336 с. ISBN 978-5-903090-10-5.

Валерий Абрамович Галынкин, Надежда Александровна Заикина, Владимир Иванович Кочеровец, Татьяна Сергеевна Потехина, Наталья Дмитриевна Бунатян

ОСНОВЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Учебное пособие

Верстка И. А. Яблоковой Дизайн обложки Л. Л. Прядко

ООО «Проспект Науки» www.prospektnauki.ru e-mail: infofflprospektnauki.ru

Подписано в печать 04.02.2008. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 19,0. Тираж 1000 экз. (1-й завод 1...400). Заказ 37.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ОАО «Петроцентр». Обособленное подразделение «Пушкинская типография». 196601, Санкт-Петербург, г. Пушкин, Средняя ул., 3/8.

– Конец работы –

Используемые теги: основы, фармацевтической, микробиологии0.074

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Основы ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Еще рефераты, курсовые, дипломные работы на эту тему:

Основы планирования. Теоретические основы управления проектами. Основы планирования. Планирование проекта в MS Project 7
Использованная литература В В Богданов Управление проектами в Microsoft Project Учебный курс Санкт Петербург Питер г...

РУКОВОДСТВО К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ по дисциплине ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ
ФГОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия... Феоктистова Н А Васильев Д А...

ОСНОВИ ТЕОРIЇ КIЛ, ОСНОВИ РАДІОЕЛЕКТРОНІКИ
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ... ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ РАДІОЕЛЕКТРОНІКИ...

Ведение в курс "Основы экономической теории" (Введення в курс "Основи економiчної теорiї)
В працях Ксенофонта 430 355 рр. до н. е Платона 427 347 рр. .о н. Аристотеля 384 322 рр. до н. е а також мислителв стародавнього Риму, нд, Китаю… Але не кожна економчна думка розвиваться у систему поглядв ста економчним… Н в рабовласницькому, н у феодальному суспльств ще не снувало струнко системи економчних поглядв на економчн процеси.…

Функциональные основы проектирования: антропометрия, эргономика и технология процессов, как основа назначения основных габаритов здания
Семестр... специальности Промышленное и гражданское строительство... Городское строительство и хозяйство Лекция Функциональные основы...

Экономические основы технологического развития тема “ Основы технологического и экономического развития”
Особенностью современного развития технологий является переход к целостным технолого-экономическим системам высокой эффективности, охватывающим… В практической деятельности экономиста и финансиста технология является… Именно за счет прибыли, полученной от своевременно и разумно вложенных в технологию средств, и достигается…

Логические основы работы ЭВМ. Основы понятия и операции алгебры логики
Введение... Логические основы работы ЭВМ Основы понятия и операции алгебры логики Прикладное программное обеспечение...

ОСНОВИ НАУКОВО-ДОСЛІДНОЇ РОБОТИ ОСНОВИ ТЕОРІЇ ПЛАНУВАННЯ ЕКСПЕРИМЕНТУ
Рубаненко О Є... Лук яненко Ю В...

Деление клеток - основа размножения и роста организмов Деление клеток - процесс, лежащий в основе размножения и индивидуального развития всех живых организмов. Основную роль в делении клеток играет ядро. На окрашенных препаратах клетки содержимое ядра в
В процессе деления ядра нуклеопротеины спирализуются, укорачиваются и становятся видны а световой микроскоп в виде компактных палочковидных… Она в десятки раз продолжительнее митоза. В эту фазу происходит синтез молекул… В анафазе центромеры делятся, сестринские хроматиды отделяются друг от друга и за счет сокращения нитей веретена…

Истоки и теоретические основы паблик рилейшнз. Истоки и теоретические основы паблик рилейшнз (ПР)
Смоленский государственный университет... Н Н Розанова ПАБЛИК РИЛЕЙШНЗ Пособие к семинарским занятиям...

0.06
Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • По категориям
  • По работам