основы
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
В. А. Галынкин, Я А. Заикииа, В. И. Кочеровец, Т. С. Потехина, Н. Д. Бунатян
ОСНОВЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования
ЩуЩ
Санкт-Петербург 2008
УДК 615.281:579 (075.8) ББК 52.81я73 0 75
Основы фармацевтической микробиологии: Учебное пособие/В. А. Галын- кин, Н. А. Заикина, В. И. Кочеровец и др. - СПб: «Проспект Науки», 2008. -304 с.
ISBN 978-5-903090-14-3
Современные сведения о микроорганизмах-продуцентах БАВ, контаминан- тах фармацевтического производства, возбудителях инфекционных заболеваний, а также о биоцидных агентах - химиотерапевтических веществах, дезинфектантах и антисептиках, механизме их действия и проблемах микробной резистентности представлены в свете применимости этих знаний для специалистов в области промышленного производства, асептичного изготовления, контроля качества и использования лекарственных средств. Основы иммунитета изложены в связи с особенностями производства иммунопрепаратов. В разделе «Микробиологические аспекты фармацевтического производства» рассматриваются требования к качеству лекарственных средств и проблемы повышения качества путем борьбы с микробами-кон- таминантами и соблюдения принципов GMP.
ISBN 978-5-903090-14-3 © ООО «Проспект Науки», 2008 © Коллектив авторов, 2008 |
Для студентов, микробиологов, провизоров, технологов по производству фармпрепаратов и широкого круга специалистов, занятых в сфере лекарственного обращения.
ISBN 97S-5-903090-14-3
9785903090143
СОДЕРЖАНИЕ
Введение................................................................................................................ 7
Часть I. БИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ......................................... 9
Глава 1. Прокариоты (бактерии).................................................................... 9
1.1. Морфология и ультрастуктура................................................ 11
1.2. Генетический аппарат............................................................... 17
1.3. Физиология.................................................................................... 20
1.4. Возбудители бактериальных заболеваний человека........ 30
Глава 2. Грибы.................................................................................................. 33
2.1. Морфология и ультраструктура......................................... ....33
2.2. Экология........................................................................................ 38
2.3. Использование в промышленности........................................ 39
2.4. Грибы - возбудители болезней человека и животных....... 40
2.5. Фитопатогенные грибы............................................................. 44
Глава 3. Вирусы и прионы.......................................................................... 45
3.1. Структура вирусов...................................................................... 45
3.2. Взаимодействие вирусов с клеткой хозяина........................ 46
3.3. Культивирование вирусов........................................................ 51
3.4. Действие химических и физических факторов на вирусы.
. Принципы создания антивирусных препаратов...................... 51
3.5. Прионы............................................................................................ 57
Глава 4. Простейшие....................................................................................... 59
4.1. Споровики...................................................................................... 59
4.2. Саркодовые................................................................................... 62
4.3. Жгутиконосцы.............................................................................. 64
4.4. Инфузории...................................................................................... 65
4.5. Лечение протозойных инфекций............................................. 66
Глава 5. Основы патогенности микроорганизмов Инфекционные болезни 68
5.1. Патогенность и вирулентность................................................ 68
5.2. Факторы защиты и агрессии..................................................... 68
5.3. Инфекционные болезни.............................................................. 71
Часть II. АНТИМИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ Глава 6. Антибиотики и синтетические
химиотерапевтические препараты........................................................... 74
6.1. Антибиотики................................................................................. 74
6.2. Синтетические химиотерапевтические препараты........... 81
6.3. Полимерные производные антимикробных препаратов....83
Глава 7. Производство химиотерапевтических препаратов............ 84
7.1. Общие представления о промышленном производстве лекарственных препаратов 84
7.2. Производство антибиотиков.................................................... 87
7.3. Микроорганизмы как продуценты биологически активных веществ и биоиндикаторы 91
Глава 8. Получение биологически-активных веществ методами генетической и клеточной инженерии 94
8.1. Методы генетического конструирования микроорганизмов in vitro 94
8.2. Направленный мутагенез..;....................................................... 98
8.3. Клеточная инженерия................................................................. 99
8.4. Генная терапия........................................................................... 100
8.5. Контроль безопасности в области молекулярной биотехнологии 102
Глава 9. Применение химиотераиевтических препаратов............. 104
9.1. Химиотерапия инфекционных заболеваний...................... 104
9.2. Применение химиотераиевтических препаратов для лечения инфекционных заболеваний 109
9.3. Применение химиотерапевтических препаратов
в сельском хозяйстве........................................................................ 115
Глава 10. Механизм действия химиотерапевтических препаратов. Резистентность 117
10.1.Ингибиторы биосинтеза компонентов клеточной стенки. .117
10.2. Ингибиторы синтеза белка................................................... 118
10.3.Препараты, нарушающие функции хромосомы............. 120
10.4. Антагонисты фолатов............................................................ 120
10.5. Антимикробные агенты, воздействующие
на цитоплазматическую мембрану............................................. 121
10.6. Устойчивость микроорганизмов
к химиотерапевтическим веществам........................................... 123
Глава 11. Дезинфектанты, антисептики и консерванты................... 130
11.1.Факторы, определяющие выбор антимикробного агента..130
11.2.Применение биоцидов............................................................ 131
11.3.Оценка эффективности........................................................... 135
11.4. Механизм действия дезинфектантов и антисептиков... 139
11.5. Резистентность микроорганизмов к антисептикам
и дезинфектантам............................................................................. 142
Глава 12. Основы иммунитета................................................................... 148
12.1. Неспецифические факторы защиты................................... 148
12.2.Иммунитет,................................................................................ 151
12.3. Аллергия.................................................................................... 162
12.4. Толерантность и аутоиммунитет....................................... 165
12.5. Влияние факторов внешней среды на формирование защитных сил организма 166
Глава 13. Иммунопрепараты: производство и контроль качества.... 170
13.1. Вакцины..................................................................................... 170
13.2. Иммуномодуляторы............................................................... 178
13.3. Сыворотки и иммуноглобулины......................................... 179
13.4. Контроль качества иммунопрепаратов............................ 184
Часть III. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА Глава 14. Экология микроорганизмов и ее связь с фармацевтической промышленностью 191
14.1.Нормальная микробиота человека.................................... 191
14.2. Микробиота окружающей среды.
Санитарно-показательные микроорганизмы........................... 199
Глава 15. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве 211
Глава 16. Микробиологические требования к качеству лекарственных средств 225
16.1. Микробиота нестерильных лекарственных средств.... 225
16.2. Микроорганизмы, контролируемые в НДС..................... 227
16.3. Принципы микробиологического контроля нестерильных лекарственных средств 235
16.4. Контроль стерильности лекарственных препаратов... 245
Глава 17.Борьба с микробами-контаминангами в фармацевтическом производстве 249
17.1. Действие физических и химических факторов
на микроорганизмы.......................................................................... 249
17.2.Асептика, антисептика, стерилизация............................... 254
17.3. Промышленная дезинфекция................................................ 264
Глава 18. Гигиена на производстве. Принципы GMP....................... 269
18.1. Правила GMP в обеспечении качества лекарственных средств 269
18.2. Гарантия качества и контроль микробиологического риска в фармацевтическом производстве 272
18.3. Микробиологические требования к организации производства фармацевтической продукции 274
Рекомендуемая литература.......................................................................... 284
Предметный указатель................................................................................ 286
Указатель латинских названий.............................................................. 298
ВВЕДЕНИЕ
Трудности лечения и профилактики инфекционных заболеваний связаны с разнообразием биологических форм их возбудителей, постоянным возникновением резистентных штаммов, появлением новых видов опасных патогенов, угрозой биотерроризма, что определяет актуальность проблемы разработки, изготовления, контроля качества и использования эффективных лекарственных срдств - антимикробных агентов. Современная фармацевтическая промышленность во многих странах является одной из наиболее успешно развивающихся отраслей индустрии. Необходимым показателем качества лекарственного препарата является его эффективность и безопасность, в том числе по микробиологическим показателям. Специалистам, работающим в этой отрасли, и студентам фармацевтических ВУЗов необходимо владеть современными знаниями о микроорганизмах-продуцентах биологически активных веществ, контаминан- тах фармацевтического производства и готовой продукции, а также о возбудителях инфекционных заболеваний (прокариотах, грибах, вирусах, простейших), вызываемых ими заболеваниях, биологических особенностях патогенов, обеспечивающих их устойчивость к лекарственным препаратам, чтобы находить способы ее преодоления.
Глубокое понимание особенностей структуры и механизма действия антимикробных препаратов необходимо для творческого подхода к созданию качественной фармацевтической продукции. Особой отраслью медицинской промышленности является производство иммунопрепара- тов, которое требует от работников отрасли знаний основ иммунитета.
Для провизоров и работников фармацевтической промышленности необходимым этапом деятельности является обеспечение условий, исключающих возможность проникновения микробов-контаминантов в сферу производства, а также мероприятия по снижению их численности до допустимых пределов.
В книге обобщен многолетний опыт преподавания на кафедре микробиологии СПХФА курсов «Общая микробиология», «Микробиология продуцентов БАВ», «Основы промышленной асептики», атакже опыт преподавания методов микробиологического контроля качества лекарственных средств на факультете усовершенствования провизоров ММА им. И. М. Сеченова.
Учебное пособие рекомендовано для студентов, микробиологов, провизоров, технологов и широкого круга специалистов, занятых в сфере лекарственного обращения с целью подготовки к работе в условиях строгого соблюдения правил GMP, принятых в России (ОСТ 42-510-18).
ЧАСТЬ I. БИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Глава 1. ПРОКАРИОТЫ (БАКТЕРИИ)
Прокариоты составляют отдельную классификационную группу микроорганизмов, они существенно отличаются от эукариот, к которым принадлежат грибы, растения, животные и человек (табл. 1). В литературе традиционно принято называть представителей прокариот бактериями. В зависимости от особенностей клеточной оболочки бактерии подразделяют на четыре основные категории: (1) грамотрицательные бактерии, (2) грамположительные бактерии, (3) бактерии, лишенные клеточных стенок, (4) архебактерии. Первые две группы имеют ригидные клеточные стенки, жесткий каркас которых составляет пептидогликан му- реин, содержащий мурамовую кислоту. К ним относится большинство возбудителей инфекционных заболеваний и сапротрофных микроорганизмов. Бактерии, лишенные ригидной клеточной и поэтому не имеющие постоянной формы клеток, называют микоплазмами. Среди них имеются виды, патогенные для человека (Mycoplasma pneumoniae, M.hominis, M.fermentans), животных и растений.
Архебактерии не содержат муреина в клеточной стенке, что делает их устойчивыми к b-лактамным антибиотикам. По особенностям молекулярного строения они значительно отличаются от других прокариот. Преимущественно это почвенные или водные микроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях (в средах с высоким содержанием солей, сильнокислой и при высокой температуре). Кроме того, среди них имеются симбионты в пищеварительном тракте теплокровных.
Таблица I
Некоторые дифференцирующие признаки прокариот и эукариот
Признак | Прокариоты | Эу кар ноты |
Цитологические свойства | ||
Нуклеоид (нукяеоплазма, генофор) отделен от цитоплазмы мембраной | — | + |
Диаметр клетки: | + | - |
обычно 0,2-2 мкм | ||
обычно > 2 мкм | ||
Митохондрии | - | + |
Хлоропласта (у фототрофов) | - | + |
Продолжение табл. 1
|
Окончание табл. 1
|
1.1. Морфология и ультраструктура
Прокариоты - это одноклеточные микроорганизмы, диаметр клеток которых обычно составляет от 0,2 до 2 мкм. По форме клеток их подразделяют на три основные группы: сферические (кокки), цилиндрические (бактерии, бациллы) и спиралевидные (рис. 1). Более сложное строение имеют актиномицеты.
Клеточная стенка обеспечивает поддержание жесткости структуры клетки, постоянства ее формы и механической прочности; кроме того, она является осмотическим барьером, имеющим зоны избирательной проницаемости для веществ различной химической природы. В качестве опорного каркаса она содержит пептидогликан муреин. Основу муреина составляют цепи чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетил- мурамовой кислоты, соединенные |3-1,4-гликозидными связями. Остатки мурамовой кислоты соединены полипептидными цепочками, в состав которых входят а-аланин, D-аланин, лизин, D-глутаминовая и мезодиа- минопимелиновая кислоты.
а ц Н-
Z 3 = сл
О
С 5 О |
\ Л \ «—• ^
о о -а
S О О Е
П. О 3" о
а о я к
о s а. |
^С7 |
'С £ а. й
£7 w ч
_ к я
в 5 о
«19
5 3 ?
я а, 2
<х> |
a 55 §
Зой о. о £
О Я
5' О- §•
р г г
•О" U |
ч\
О
Аминокислоты D-ряда и мурамовая кислота уникальны для прокариот, своеобразие структуры клеточной стенки служит основой избирательного действия некоторых антибиотиков, например, пенициллина и других р-лактамов. Клеточные стенки грамположительных и грамотри- цательных бактерий существенно различаются по своей структуре.
У грамотрицательных бактерий муреиновая сеть однослойная, иногда двуслойная. На ней располагаются белки, липопротеиды, липополиса- хариды и фосфолипиды, входящие в состав внешней мембраны. Стабилизация этих компонентов обеспечивается ионами Са^ и Mg4^. Существенное значение для структуры и функции внешней мембраны имеет липид А. Его скелет содержит дисахарид, состоящий из остатков D-глюкозамина, соединенных |3-1,6-связью, имеющих в положении 1 и 4 фосфатные группы. Скелет этерифицирован жирными кислотами С)2, С14 и С]6. Липид А имеет уникальную конформацию - компактную и высокоупорядоченную, благодаря чему создает в мембране вязкую структуру, которая затрудняет диффузию желчных кислот, детергентов и некоторых антибиотиков. Липид А обеспечивает токсичность и пирогенность липополисахарида. Антигенная специфичность грамотрицательных бактерий главным образом определяется углеводами О-замещенных боковых цепей, выступающих наружу с поверхности клетки. Внешняя мембрана обеспечивает высокую устойчивость грамотрицательных бактерий по сравнению с грамположи- тельными к антимикробным агентам.
У грамположительных бактерий внешняя мембрана отсутствует, а муреиновая сеть составляет 30-70 % сухой массы клеточной стенки и достигает 40 слоев. Характерно наличие тейхоевых и тейхуроновых кислот, обеспечивающих отрицательный заряд клетки и способствующих сорбции катионов из окружающей среды. У некоторых микроорганизмов могут присутствовать добавочные компоненты - липиды, воска, миколовые кислоты, протеины, полисахариды.
Различие в структуре клеточной стенки двух групп микроорганизмов выявляют с помощью окрашивания по Граму. Препарат обрабатывают раствором кристаллического фиолетового, затем йода. Образующийся комплекс красителя с йодом располагается на (в) протопласте. При обработке препарата спиртом он удерживается клеточной стенкой грамположительных бактерий и вымывается - у грамотрицательных. Способность окрашиваться по Граму - важный таксономический признак, с которым коррелируют другие свойства бактерий.
S-слой (surface - поверхность) располагается на поверхности клеток всех прокариот и покрывает целиком всю клетку. Он состоит из структурных единиц-протеинов или глико протеинов, образующих монослой, структура которого типична для двухмерных кристаллов (решетка гексагональной, косой или квадратной симметрии). Взаимодействие между субъединицами и подлежащими структурами происходит за счет некова- лентных связей. S-слой обеспечивает защиту клетки от внешних воздействий, однако при продолжительном культивировании он может быть утрачен без потери жизнеспособности штамма.
Капсулы и слизь образуются у некоторых бактерий снаружи от клеточной стенки как ее внешний слой. Способность к их формированию не является видовым признаком: могут существовать капсульные и бескап- сульные штаммы. У патогенных микроорганизмов капсула обеспечивает защиту от фагоцитоза, повышая вирулентность штамма. У микробов, обитающих в почве и на растениях, капсула защищает клетки от высыхания, солнечной радиации, биоцидов. Капсулы и слизь создают для микробных клеток осмотические условия, благоприятствующие сорбции питательных веществ из субстрата, способствуют адгезии клеток между собой и субстратом. Многие экзоферменты локализуются в капсуле, где происходят превращения веществ, поступающих в клетку.
У большинства бактерий капсулы и слизь имеют полисахаридную природу. У некоторых бацилл это полипептиды в основном D- и L-глута- миновой кислоты.
Капсульные полисахариды обладают антигенной специфичностью и используются для изготовления вакцин (у пневмококков, менингококков), для идентификации и классификации (у сальмонелл). Растворимые слизи (декстран Leuconostoc dextranicum, L.mesenteroides, ксантан Xanthomonas campestris) получают в промышленных масштабах и широко используют в фармации и других областях.
Протопласты и сферопласты - это структуры полностью (протопласты) или частично (сферопласты) утратившие клеточную стенку, например, под действием лизоцима или пенициллина. Это осмотически лабильные элементы, которые могут существовать только в гипертонических растворах. Они сохраняют биологическую активность и способны в специальных условиях ревертировать в нормальные клетки. Используются в клеточной инженерии для получения гибридных форм микроорганизмов.
L-формы, получившие свое название в честь института Листера в Лондоне, образуются в условиях, приводящих к нарушению синтеза клеточной стенки; например, у больного туберкулезом возбудитель под влиянием лекарственных веществ может превратиться в L-форму. При этом микобактерии теряют характерную кислотоустойчивость, что затрудняет их выявление и диагностику заболевания. Для таких клеток характерны неправильные формы, иногда нитевидные, способные проходить через поры бактериальных фильтров. Лабильные L-формы способны реверти- ровать в нормальные клетки. Стабильные не образуют клеточной стенки, поскольку ее утрата связана с изменением генотипа (мутацией).
Лериплазматическое пространство располагается между слоем муреина и цитоплазматической мембраной. В нем находятся ферменты гидролазы, расщепляющие вещества, поступающие в клетку, и полимера- зы, участвующие в синтезе клеточной стенки и капсулы, а также белки, принимающие участие в транспорте субстратов в цитоплазму и белки - рецепторы хемотаксических стимулов.
Цшпоплазматическая мембрана располагается под клеточной стенкой и отделяет от внешней среды цитоплазму. Имеет толщину 6-8 нм и составляет 8-15 % сухого вещества клетки. Ее структура соответствует общему принципу организации мембран про- и эукариотических клеток.
Цитоплазматическая мембрана служит осмотическим барьером, в ней локализуются системы активного транспорта веществ в клетку и из клетки.
Мезосомы - особые структуры, образуемые путем инвагинации (втачивания) мембраны, содержат ферменты системы окислительного фос- форилирования и выполняют у прокариот функции митохондрий.
Цитоплазма составляет внутреннюю среду клетки. Это сложная высокогетерогенная система, в ней располагается генетический материал клетки (нуклеоид, плазмиды), 70S рибосомы, ферментные системы, выполняющие метаболические функции, резервные вещества (полисахариды, липиды, полигидроксимаеляная кислота, полифосфаты, сера у серобактерий). Основная часть метаболических процессов осуществляется в цитоплазме. Мембранные структуры, располагающиеся в цитоплазме, наиболее развиты в клетках эукариот, у бактерий имеются их аналоги (мезосомы, вакуоли, лизосомы).
Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Перемещаться без жгутиков способны скользящие бактерии и спирохеты. Число жгутиков и их расположение на клетке - таксономический признак, характерный для определенных видов. Жгутики построены из белка - флагелли- на, их диаметр 10-20 нм, длина до 20 мкм. Жгутик закреплен в цитоплазматической мембране и клеточной стенке с помощью базального тельца, состоящего из центрального стержня и двух пар (у грамотрицательных бактерий) и одной пары (у грамположительных) дисков. Жгутики вращаются благодаря тому, что через диски проходит поток заряженных частиц (Н+, ОН-, Na+) за счет разности потенциалов внутри и вне клетки. Жгутики находятся под контролем системы, воспринимающей информацию о состоянии окружающей среды. Поэтому они позволяют клеткам перемещаться в область с оптимальными условиями (таксис).
Фимбрии (пили или волоски) располагаются на поверхности клеток многих бактерий. Их число на клетке может доходить до 10000. Их диаметр 3-25 нм, длина около 12 мкм. Они обеспечивают сцепление клеток, например, при конъюгации, их адгезию к субстрату. Белки фимбрий служат рецепторами, обеспечивающими биологическое узнавание. Некоторые фимбрии являются капиллярами, связанными с мезосомами и участвуют в водно-солевом обмене.
F-волоски (F-numi) по структуре напоминают фимбрии, однако на клетке их не более одного-двух. Они находятся лишь у клеток, способных к передаче генетического материала при конъюгации, и принимают участие в этом процессе как рецепторы и связывающие структуры. Кроме того, они являются рецепторами специфических фагов.
Споры прокариот - это особая структура, предназначенная для сохранения в неблагоприятных условиях. Споры по сравнению с вегетативными клетками намного устойчивее к воздействию высокой температуры, радиации, химических агентов. Споры образуются внутри бактериальной клетки обычно при истощении в культуральной среде питательных веществ и накоплении продуктов обмена. Биохимическим сигналом для спорообразования служит снижение концентрации в клетке гуанило- вых нуклеотидов - ГТФ и ГДФ. Спорообразование зависит от плотности популяции: при малой концентрации клеток споры не образуются. Спорообразование включает синтез специфических протеинов и активацию соответствующих генов, продукты которых катализируют серию процессов, приводящих к формированию споры.
Белки споры содержат значительно больше цистеина, чем вегетативные клетки. Предполагают, что многочисленные дисульфидные связи в белке обеспечивают высокую механическую прочность оболочек спор. На ранней стадии споруляции образуются особые кор-специфические белки, которые связываются с ДНК, слегка раскручивая ее, что изменяет геометрию пиримидиновых оснований и повышает их устойчивость к ультрафиолетовому излучению. В период споруляции образуется специфическое вещество - дипиколиновая (пиридин-2,6-дикарбоновая) кислота, которая в виде соли кальция входит в состав оболочки споры.
Зрелая спора содержит минимальное количество свободной воды и повышенное по сравнению с вегетативной клеткой количество липи-
дов. На долю ее оболочки приходится до 50% сухой массы. Все эти особенности обеспечивают ее устойчивость к факторам внешней среды.
Многослойная оболочка споры (рис. 2) окружает ее центральную часть (кор), содержащий геном клетки.
1 - кор (кор-специфические белки, тесно связанные с ДНК)
2 - кортекс (перекрестно сшитый пептидогли- кан)
3 - оболочки споры (белки с высоким содержанием цистеина)
4 - экзоспориум (протеин)
Рис. 2. Схема строения эндоспоры
Спорообразование присуще преимущественно палочковидным микроорганизмам (бациллам, клостридиям). К ним относятся возбудители сибирской язвы, столбняка, анаэробной инфекции, ботулизма и некоторые сапротрофные виды. Помимо этого споры образуют виды родов Thermoactinomyces, Sporosarcina, Sporomusa. Все они за исключением последнего по Граму окрашиваются положительно.
Спора - это покоящаяся форма. В благоприятных условиях споры прорастают. При этом спора набухает, поглощая воду, возрастает ее метаболическая активность, выделяется дипиколиновая кислота, спора утрачивает свою устойчивость. Происходит деградация кор-специфических протеинов, которые служат источником энергии при прорастании споры, синтез новых молекул РНК, ДНК и белков. Наконец, оболочка споры разрывается, и из нее выходит вегетативная клетка.
Способность микроорганизмов к спорообразованию учитывают при выборе методов дезинфекции и стерилизации, имея в виду высокую устойчивость спор к биоцидным агентам. Наиболее устойчивые виды используют в качестве тест-культур для оценки эффективности стерилизации: Bac.stearothermophilus - паром под давлением, Bac.subtilis var. niger - сухим паром, Bac.pumilus - радиационной.
1.2. Генетический аппарат
Геном прокариотической клетки включает нуклеотид (бактериальную хромосому) и внехромосомные факторы наследственности.
Совокупность наследственных детерминант клетки называют генотипом, ему противоцастапляют фоиотип - совокупность наблюдаемых
признаков. Фенотипическое проявление одного и того же генотипа может быть различным в зависимости от внешней среды.
Нуклеоид- ядро прокариотической клетки, представлен одной двойной фибриллой ДНК, замкнутой в кольцо. ДНК связана с гистоноподоб- ными белками. У архебактерий белки, стабилизирующие ДНК, не имеют сходства с гистонами. Геном организован из независимых доменов, ограниченных взаимодействием белков и ДНК. Структура доменов лабильна: для транскрипции экспонируется только необходимая часть ДНК.
Величина генома у прокариот варьирует от вида к виду в пределах 0,8-8 • 103 тысяч пар оснований (тпо) и имеет молекулярную массу порядка 1-2-109 Da.
Хромосома прокариот расположена в участке цитоплазмы, свободном от рибосом и не окружена мембраной. Как правило, нуклеоид несет гены, контролирующие необходимые функции клетки, связанные с ее метаболизмом и обеспечивающие процессы воспроизводства. Помимо этого геном содержит добавочные гены, контролирующие факультативные свойства: гены, обеспечивающие горизонтальный перенос ДНК, гены резистентности, вирулентности и т. д., которые располагаются на транспортабельных (мигрирующих) генетических элементах - инсерционных последовательностях, транспозонах и плазмидах.
Плазм иды по своим свойствам аналогичны умеренным фагам (см. гл. 3), но исторически сложилось так, что их рассматривают раздельно. Это автономно реплицирующиеся элементы ДНК (репликоны), которые могут быть циркулярными или линейными от маленьких (около 10 тпо) без фенотипических проявлений до близких к бактериальной хромосоме (более 500 тпо), придающих бактериям новые свойства - устойчивость к биоцидам, вирулентность, синтез антибиотиков и т.д. Транс- миссибельные (конъюгативные) плазмиды способны передаваться из клетки донора в клетку реципиента при конъюгации, нетрансмиссибельные - путем трансдукции или трансформации (см. ниже).
Плазмиды используют в генетической инженерии для получения ре- комбинантных штаммов, например, продуцентов БАВ.
Транспозоны - это короткие двойные цепи ДНК (2-20 тпо), способные перемещаться из одного участка генома в другой, обычно по маршруту: хромосома плазмида (1) плазмида (2) -> хромосома, перенося таким образом определенные гены, например, кодирующие устойчивость к какому-либо антибиотику, что приводит к формированию плазмид, обусловливающих множественную лекарственную резистентность микроорганизмов. По современным представлениям большая часть спонтанных мутаций является результатом внедрения в ген мигрирующих генетических элементов, например, инсерционных последовательностей (участков ДНК, содержащих менее 2 тпн).
Передача генетического материала у прокариот происходит вертикально и горизонтально. Первый способ осуществляется при размножении, которое у прокариот происходит путем прямого бинарного деления. Процесс сопровождается репликацией ДНК, в результате чего дочерние клетки получают идентичные наборы генетической информации.
Вегетативный клеточный цикл - это период, в течение которого происходит рост массы клетки, удвоение генетического материала, разделение вновь образованных хромосом и деление клетки. Плазмиды реплицируются автономно и независимо от клеточного цикла, одни могут не реплицироваться, в результате чего происходит их элиминация, другие реплицируются 2-3 раза. Горизонтальный перенос ДНК осуществляется путем трансформации, трансдукции (см. гл. 3) и конъюгации.
Трансформация - это передача изолированной ДНК из клетки донора в клетку реципиента без каких-либо посредников. Трансформированными могут быть лишь компетентные клетки, т.е. такие, в которые может проникнуть экзогенная ДНК. Состояние компетентности может быть естественным или искусственным, т.е. достигнутым путем обработки клеток химическими или физическими агентами, повышающими проницаемость клеточной стенки. Трансформация широко используется в генетической инженерии для создания рекомбинантных культур микроорганизмов.
Конъюгация - главный путь обмена генами в природе, таким способом гены могут быть переданы не только от бактерии к бактерии, но и от прокариот эукариотам (грибам, растениям). Механизм конъюгации кодируется плазмидами и транспозонами. Плазмида F (fertility - плодовитость) контролирует образование у клеток-доноров (F+) F-пилей, которые служат для межклеточного узнавания, распознавания сайта рецептора на поверхности клетки реципиента (F") и прикрепления к нему. F-пили образуются только у грамотрицательных бактерий. Предполагают, что у грам- положительных микроорганизмов конъюгация обеспечивается особыми веществами типа адгезинов.
Конъюгативный перенос генов играет значительную роль в обмене генетической информацией в мире прокариот. Он возможен как внутри одного вида, так и между разными видами бактерий. Путем передачи R-плазмиды, контролирующей резистентность к антимикробным агентам, от устойчивого штамма чувствительные к биоцидам микроорганизмы получают блок генетической информации, обеспечивающей их полирезистентность, без длительной эволюционной перестройки. Возможна также передача других признаков: синтеза токсинов, ферментов, капсулы ит. д.
1.3. Физиология
1.3.1. Передача информации в мире микробов
Одноклеточные организмы должны распознавать изменения в окружающей среде и быстро на них реагировать, адаптируя свой метаболизм. Прокариоты распознают свое окружение посредством мембранос- вязанных и внутриклеточных сенсоров (рецепторов) транспортных систем. Сенсоры связаны с комплексом путей передачи сигналов в систему контроля метаболизма, определяющую процессы клеточной дифференциации и поведения бактериальной популяции. Передача сигнала связана с явлением таксиса - направленным движением в зону оптимального химического состава, температуры, освещенности. Бактерии имеют также сенсорные системы для оценки направления магнитного поля, механического и электрохимического стимула.
При переходе микроорганизма из некультивируемого состояния в фазу роста сенсоры передают клетке сигнал об изменении внешних условий (например, при попадании в макроорганизм). Таким образом, бактерии могут не обнаруживаться в воде, почве и т. п., но при попадании в организм вызывать инфекционный процесс. Экспрессия генов вирулентности часто происходит только в организме хозяина (принцип экономии энергии и адаптации к условиям in vivo).
Особая контрольная система (аутоиндукция) позволяет бактериям общаться на межклеточном уровне и оценивать плотность своей популяции (чувство кворума). Аутоиндукция является причиной того, что популяция при высокой плотности клеток ведет себя иначе, чем при низкой плотности, например, при споруляции, биолюминесценции и т. п. Передача сигналов от клетки к клетке происходит у микроорганизмов с участием веществ, подобных гормонам млекопитающих, в том числе стероидов и полипептидов и рецепторов для этих веществ. Принцип механизма чувства кворума - активация транскрипции специфических генов при достижении порогового уровня связывания белка-активатора транскрипции с низкомолекулярным аутоиндуктором. Этот механизм обеспечивает быстрый рост культуры при больших посевных дозах, участвует в экспрессии генов вирулентности и в других процессах.
1.3.2. Метаболизм
Процессы метаболизма микроорганизмов включают всю совокупность ферментативных реакций, происходящих в клетке. Это высокоин- тегрированный и целенаправленный процесс, в котором участвует комплекс мультиферментных систем, обеспечивающих обмен веществом и энергией между клеткой и средой. Этот обмен складывается из двух процессов - катаболизма и анаболизма.
Катаболизм включает реакции ферментативного расщепления сравнительно крупных молекул питательных веществ, получаемых из внешней среды или содержащихся в клетке в качестве запасных (углеводов, липидов, белков); реакции катаболизма (в основном окислительно-восстановительные) сопровождаются выделением энергии, которая запасается в виде АТФ.
Анаболизм представляет собой совокупность процессов ферментативного синтеза крупных молекул из простых предшественников; эти процессы проходят с потреблением энергии, которая поставляется в виде АТФ и других макроэргических соединений (КоА, ГТФ, УТФ, ЦТФ).
Реакции катаболизма и анаболизма протекают в клетках одновременно, их пути объединяет общая стадия, называемая амфибол и ческой. на которой завершается разрушение продуктов катаболизма, а ее интермедиа™ служат предшественниками продуктов анаболизма.
Системы регуляции микробного метаболизма позволяют координировать общую метаболическую активность растущего микроорганизма, которая представляет собой одновременное действие многочисленных биохимических реакций, катализируемых отдельными ферментами. Чтобы процесс роста был быстрым и эффективным, клетка должна управлять скоростями отдельных реакций каждого метаболического пути и общими скоростями различных путей. Кроме того, клетка должна изменять скорость и направление отдельных метаболических путей в ответ на изменения условия окружающей среды. Для этого у микроорганизмов существуют многочисленные регуляторные механизмы. В клетке существует два основных типа регуляции: регуляция синтеза ферментов и регуляции активности ферментов. Оба они действуют при посредстве низкомолекулярных соединений - эффекторов, которые или образуются в клетке, или поступают в нее из окружающей среды. В обоих регулятор- ных механизмах участвует особый класс белков, называемых аллостери- ческими, свойства которых изменяются при связывании с молекулами эффекторов.
Регуляция активности ферментов заключается в том, что эффектор соединяется с регуляторным центром молекулы фермента, изменяя таким образом его активность. Эффектором может быть конечный продукт данной реакции или конечный продукт данного метаболического пути. В этом случае говорят об ингибировании по принципу обратной связи. У фермента, чувствительного к ингибированию конечным продуктом, каталитический (активный) и аллостерический центры пространственно разобщены. Ингибирование по принципу обратной связи, как правило, обратимо, т. е. связанный конечный продукт может отделяться от фермента, тем самым, восстанавливая его активность. Аллостерическое ингибирование позволяет клетке расходовать вещества-предшественники и энергию со скоростью, необходимой для биосинтеза, но не выше. Аллостерическое ингибирование следует отличать от изостерического, или конкурентного, при котором субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же каталитический центр фермента. Конкурентный ингибитор по своей структуре обычно аналогичен структуре субстрата.
Регуляция синтеза ферментов. Ингибирование конечным продуктом, осуществляемое аллостерическими ферментами, в основном достаточно для того, чтобы все реакции метаболизма протекали в равновесии друг с другом. Однако, если продукт какой-либо реакции не нужен, ферменты, катализирующие эту реакцию, становятся избыточными. В этом случае действует механизм регуляции, изменяющий ферментативный состав клетки. Эта регуляция осуществляется на уровне генов и включает индукцию и репрессию синтеза ферментов.
Помимо индуцибельных ферментов, т. е. тех, которые образуются клеткой при наличии соответствующего индуктора в питательной среде и при том условии, что в геноме клетки имеется соответствующий структурный ген, существуют конститутивные ферменты, образование которых не зависит от наличия индуктора в среде. Индуцибельная ферментная система может стать конститутивной в результате мутации, затрагивающей область оператора, либо ген-регулятор. Если мутации затрагивают пути, ведущие к синтезу какого-либо полезного продукта, то у таких дерепрессированных мутантов имеет место перепроизводство конечного продукта, и они с успехом могут быть использованы в промышленности, например, при получении микробиологическим путем аминокислот, витаминов и т. д.
1.3.3. Питание микроорганизмов
Прокариоты отличаются от других живых существ на Земле исключительным разнообразием своего метаболизма, которое проявляется в их способности использовать источники питательных веществ и осуществлять биохимические превращения, недоступные другим организмам.
В качестве источника энергии они могут использовать как солнечный свет (фототрофы), так и энергию химических соединений (хемотро- фы); в качестве источника углерода - неорганические (литотрофы или автотрофы) и органические соединения (органотрофы или гетеротрофы). Примеры различных форм потребления энергии и углерода приведены в табл. 2.
Таблица 2
Типы питания прокариот
Тип питания | Источник углерода | Источник энергин | Донор электронов | Примеры (роды, семейства) |
Фотолитотроф- ный | СО, СО?, карбонаты | Свет | Н20 | Цианобактерии (зеленые растения) |
H2S S | Chromatium Thiocapsa | |||
Фотооргано- трофный | Органические соединения и С02 | Свет | Органические соединения | Rhodobacter Rhodomi- crobium |
Хемолитотроф- ный | СО, С02, карбонаты | Окислительно- восстановительные реакции | н2 | Метаногены |
Н2, S, H2S | Thiothrix Thiobacterium Beggiatoa | |||
Fe^, Fe'bt+ | Siderocapsaceae | |||
NHj, NOJ | Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus | |||
NOJ, NOJ | Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina | |||
Хемоорганотроф- ный | Органические соединения | Окислительно- восстановительные реакции | Большинство бактерий (грибы, высшие животные, не- фотосинтези- рующие клетки растений) |
Питательные вещества, используемые гетеротрофными микроорганизмами . весьма разнообразны. Практически для каждого природного органического соединения можно найти микроорганизм, обеспечивающий его разложение. Прокариоты способны утилизировать и многие синтетические вещества, в том числе биоциды. Поэтому микроорганизмам принадлежит ведущая роль в круговороте веществ в природе.
Наиболее доступны для гетеротрофов в качестве источника углерода разнообразные углеводы, аминокислоты, органические кислоты, нук- леотиды. Источниками азота, фосфора и серы могут служить как органические (пептиды, аминокислоты, нуклеотиды) так и неорганические соединения.
Некоторые микроорганизмы не способны синтезировать все органические соединения (витамины, аминокислоты, нуклеотиды), необходимые для их роста и размножения. Чтобы обеспечить рост, данные вещества необходимо вносить в питательную среду, поэтому они получили название факторов роста. Микроорганизмы, нуждающиеся в каком-либо факторе роста, называют ауксотрофными, не нуждающиеся - прото- трофными. Ауксотрофные штаммы используют в генетических исследованиях как маркерные, а также для микробиологического анализа определенных веществ.
Для культивирования различных микроорганизмов используют питательные среды разного химического состава, соответствующие требованиям данного вида.
Всякая питательная среда должна удовлетворять следующим требованиям: содержать все необходимые для роста и размножения микроба вещества; иметь достаточную влажность; соответствующую реакцию среды (рН); быть стерильной, изотоничной для микробных клеток, обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом. Среды должны быть по возможности унифицированными в отношении основных компонентов: содержание суммарного азота аминогрупп, аминокислот и низших полипептидов должно составлять 0,8-1,2 г/л, общего азота 2,5-3 г/л, хлоридов (в пересчете на хлорид натрия) - 0,5-0,8 %.
Среды стерилизуют при различных режимах, в зависимости от состава (табл. 3).
Таблица 3
Режимы стерилизации питательных сред
|
1.3.4. Кинетика роста
Кинетика роста бактерий отражает их отношение к конкретным условиям культивирования. Интенсивность роста оценивают путем подсчета количества клеток или определения биомассы, образовавшихся за определенный период времени. Типичная кривая роста микробной популяции (рис. 3) позволяет определить основные константы, характеризующие динамику роста: константу скорости роста
t lg2 -{t-t0)'
где: n — число клеточных делений, К— число клеточных делений за 1 час, N0 - исходная (при tQ) концентрация клеток в популяции, N-концентрация клеток в период времени t; и время генерации
G = - = —, п К
где G - время, необходимое для одного клеточного деления.
Рис. 3. Кривая роста бактерий: 1 - исходная стационарная фаза, в течение которой внесенные в среду клетки адаптируются к новым условиям; 2- фаза ускоренного роста; 3 - логарифмическая или экспоненциальная фаза, когда число клеток растет в геометрической прогрессии; 4 - фаза уменьшения скорости роста; 5 - стационарная фаза максимума; 6 - фаза отмирания |
1.3.5. Энергетика роста микроорганизмов
Все реакции биосинтеза требуют участия АТФ. Это соединение имеет две макроэргические связи, обладающие высокой реакционной способностью. АТФ служит донором фосфатной группы для множества интер- медиатов метаболизма, переводя их таким образом в активированную форму, что позволяет им участвовать в термодинамически выгодных реакциях биосинтеза. Помимо АТФ имеются и другие соединения, имеющие макроэргические связи, которые участвуют в реакциях биосинтеза: например, ГТФ - в синтезе белков, УТФ - пептидогликана клеточной стенки, ЦТФ - фосфолипидов, ацил~КоА функционирует как переносчик ацильных радикалов при синтезе жирных кислот и в реакциях катаболизма.
АТФ образуется в результате двух принципиально различных процессов: субстратного фосфорилирования и транспорта электронов при окислительном или фотофосфорилировании.
Брожение. Примером метаболического процесса, при котором АТФ образуется путем субстратного фосфорилирования (переноса богатой энергией фосфатной группы от интермедиата катаболизма на АДФ), является брожение. При брожении органические соединения служат как донорами, так и акцепторами электронов. В результате субстрат, подвергающийся брожению, превращается в смесь конечных продуктов, состав которых различается в зависимости от особенностей метаболизма данного микроорганизма. В соответствии с главными конечными продуктами различают спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, уксуснокислое и др. брожения.
Процессы брожения могут проходить только в анаэробных условиях. Микроорганизмы, осуществляющие брожение, подразделяются на строгих и факультативных анаэробов. Строгие анаэробы не могут расти в присутствии кислорода, поскольку не имеют ферментов, разрушающих его токсичные соединения - Н,0, и О, (каталаза и супероксиддис- мутаза). Факультативные анаэробы в присутствии кислорода переходят к аэробному метаболизму, энергетически более выгодному, чем брожение.
Дыхание - это метаболический процесс, идущий с образованием АТФ, в ходе которого донорами электронов служат органические или неорганические соединения, а акцепторами электронов - неорганические соединения: при аэробном дыхании - молекулярный кислород, а при анаэробном дыхании - сульфаты, нитраты и карбонаты. Отличительная особенность дыхательных процессов - наличие цепи переноси электронов, т.е. ряда специфических соединений, способных подвергаться обратимому окислению и восстановлению, т. е. принимать электроны от одного соединения и передавать их другому. Электроны, отнятые от субстрата, попадают в эту цепь и по ней достигают конечного акцептора (02, NO 3,S0~~, СО ~~). В ходе этого процесса образуется АТФ путем окислительного фосфорилирования, сопряженного с транспортом электронов.
К аэробному дыханию способно большинство микроорганизмов, составляющих нормальную микробиоту человека, и патогенных. Карбонаты (С02) в процессе анаэробного дыхания используют метанообразую- щие бактерии, сульфаты - виды родов Desulfovibrio, Desulfotomacuium, и др., обитающие в водоемах, где имеются органические осадки и сульфаты. Восстановление нитратов характерно для многих хемогетеротро- фов, осуществляющих реакции денитрификации
глюкоза + N0 " + Н+ СО, +N, + Н,0 и нитрат-нитритного дыхания
глюкоза + N0 ~ -» СО, + Н,0 + N0 ".
Последний тип дыхания характерен для большинства энтеробакте- рий. Избыток нитратов в пищевых продуктах опасен потому, что в кишечнике при их восстановлении с участием бактерий образуются токсичные нитриты.
Фотофосфорилирование - это процесс, при котором АТФ образуется при переносе энергии света, поглощенного фотосинтетической пигментной системой, через цепь переноса электронов. Большинство фото- синтезирующих организмов (цианобактерии, зеленые растения) используют в качестве основного восстановителя воду, при окислении которой образуется кислород (оксигенный фотосинтез). Некоторые фотосинтези- рующие бактерии в качестве восстановителя используют водород или сероводород (аноксигенный фотосинтез).
Пути образования АТФ у хемоорганотрофов. Одним из основных путей расщепления глюкозы у хемоорганотрофов, например E.coli, является гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа. Глюкоза поступает в клетку с помощью специфической системы транспорта, сопряженной с фосфорилированием до глюкозо-6-фосфата, который расщепляется до пирувата. Пируват используется в реакции окислительного карбоксили- рования для образования ацетил-КоА. Ацетильный радикал поступает в цикл трикарбоновых кислот или цикл Кребса, где он окисляется до С02, а водород, который при этом образуется, сохраняется в виде восстановленных коферментов (НАДН,, НАДФН,, ФАДН2).
Окисленные формы коферментов регенерируются в дыхательной цепи, где конечным акцептором водорода является кислород. Основными компонентами дыхательной цепи являются белки, несущие простетичес- кие группы, окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) которых лежат между потенциалами НАД (- 0,32В) и молекулярного кислорода (+ 0,81В). Таким образом, восстановительные элементы (электроны) от НАДН, переходят на кислород по цепи переносчиков с последовательно возрастающими значениями ОВП, как бы по каскаду. Компоненты дыхательной цепи располагаются на инвагинантах цитоплазматической мембраны (мезосомах) прокариот и мембранах митохондрий у эукариот.
Другие пути метаболизма углеводов помимо пути Эмбдена-Мейергофа или наряду с ним у некоторых микроорганизмов приводят к образованию необходимых для них продуктов.
Важнейшим назначением пентозофосфатного (фосфоглюконат- ного) пути или гексозомонофосфатного шунта являются генерация восстановительного НАДФН,, необходимого для синтеза жидких кислот, стероидов, некоторых антибиотиков, и пентоз (Д-рибозы) для синтеза нуклеиновых кислот.
Кетодезоксифосфоглюконатный путь Энтнера-Дудорова у некоторых микроорганизмов может иметь место как основной (у псевдомонад) или как запасной. Его суммарное уравнение:
глюкоза пируват (2) + АТФ + НАДФН, (2).
Гликолитический, пентозофосфатный и кетодезоксифосфоглюконат- ный - это основные катаболические пути, в которых органические молекулы (клеточное «топливо») расщепляются до определенных промежуточных продуктов, еще обладающих значительной энергией. Дальнейшее превращение этих веществ с освобождением их энергии происходит при дыхании или брожении.
Люминесценция микроорганизмов, как и других организмов (простейших, грибов, насекомых) является окислительным процессом, в котором фермент люцифераза окисляет молекулярным кислородом особый длинноцепочечный алифатический радикал и восстановленный ФМНН2:
RCHO + ФМНН, + О, -» RCOOH + ФМН + Н20 + hn (квант света).
Реакция, приводящая к свечению, требует присутствия АТФ, имеется прямая зависимость между количеством АТФ и интенсивностью свечения; поэтому тест-систему, содержащую люциферазу, используют для определения АТФ. Реакция биолюминесценции высокочувствительна и может быть использована для определения микробной контаминации продукта, а также для определения микроколичеств токсинов и наркотиков, подавляющих свечение.
Метаболизм белка и аминокислот включает процессы протеоли- за (ферментативного гидролиза белка до аминокислот) и отщепления а-аминогруппы аминокислот, которое осуществляется с помощью двух процессов -трансаминирования или окислительного дезаминирования.
Азотфиксчцию - уникальный процесс связывания атмосферного азота с образованием аммиака, осуществляют исключительно прокариотичес- кие организмы, число которых достаточно велико. Микроорганизмы, способные к симбиотической (в ассоциации с растениями) и несимбиотичес- кой азотфиксации, обладают особой ферментной системой, включающей белки, азоферредоксин, молибдоферредоксин и катализирующей реакцию:
N2 + H2 + АТФ NH+ + АДФ + Фн.
Круговорот азота в природе (рис. 4) помимо описанных выше процессов включает реакцию нитрификации (NH3 -» NO~2 -» NOT), которую осуществляют хемолитотрофные бактерии.
Таким образом, процессы метаболизма микроорганизмов не только обеспечивают их существование, но являются неотъемлемой частью экологической системы Земли, а также широко используются в хозяйственной деятельности человека.
Многочисленные представители прокариот могут вызывать заболевания у человека (табл. 4), животных и растений. Основы их патогенно- сти рассматриваются в главе 5.
Таблица 4
Нитрификац; |
Атмосферный азот Ин |
фиксация азота ™осферы |
Синтез белка |
Рис. 4. Схема превращений азота в природе 1.4. Возбудители бактериальных заболевание человека |
Денитрификация NO? |
Бе; [икроорганизмов |
Основные возбудители бактериальных заболеваний человека
Морфолого- бнологическая группа | Род или вид микроорганизма | Заболевание |
Спирохеты | Treponema pallidum Leptospira interrogans Borrelia recurrentis | Сифилис Лептоспироз Возвратный тиф |
Аэробные (микроаэро- фильные) подвижные спиралевидные бактерии | Campilobacter Helicobacter Spirillum minor | Язва желудка, гастриты То же Содоку (зоонозное заболевание) |
Грамотрицательные аэробные (микроаэро- фильные) палочки и кокки | Bordetella pertussis Brucella Francisella tularensis Legionella pneumophila | Коклюш Бруцеллез Туляремия Легионеллез |
Грамотрицательные кокки | Neisseria gonorrhoeae N. meningitidis Pseudomonas aeruginosa Burkholderia mallei B. pseudomallei | Гонорея, эндокардиты, менингиты, артриты, септицемия и др. Менингит, назофарингит, септицемия Местные и общие нагноитель- ные процессы Сап Мелиоидоз |
Окончание табл. 4
|
ВСЕРОССИЙСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ФГУП ГосНИИгенетика
Н Россия, Москва, 117545 1-й Дорожный проезд, 1
Я Тел: (495)315 12 10 Факс:(495)315 07 74 @ vkpm@genetika.ni В www.genetika.ru
вкпм
(Всероссийская Коллекция Промышленных микроорганизмов)
крупнейшая национальная сервисная коллекция, коллекционный фонд которой насчитывает в настоящее время более 15000 штаммов непатогенных микроорганизмов, предназначенных для использования в различных исследовательских и прикладных целях.
ВКПМ имеет статус международного органа по депонированию и является членом всемирной федерации коллекций культур (WFCC) и европейской организации коллекций культур (ЕССО).
Среди коллекционных микроорганизмов: бактерии (в том числе актино- мицеты), дрожжи, мицелиалъные грибы, генетически модифицированные штаммы, плазмиды, илазмидосодержащие штаммы и фаги.
ВКПМ предоставляет различные сервисные услуги исследовательским, промышленным и учебным организациям: депонирование микроорганизмов (депонирование включает в себя передачу штамма в коллекцию с целью регистрации, хранения и выдачи образца микроорганизма заинтересованным лицам в соответствии с установленными правилами), таксономическая идентификация микроорганизмов, паспортизация микроорганизмов, лиофилизация микроорганизмов, выделение микроорганизмов из различных экологических ниш для скрининговых целей, консультации по вопросам длительного хранения микроорганизмов, патентного депонирования и патентования микроорганизмов, проведение семинаров и индивидуальных научных стажировок, предоставление культур из коллекции по запросам заинтересованных лиц в соответствии с правилами ВКПМ, осуществление договорных работ.
В ВКПМ работают высококвалифицированные микробиологи, генетики, специалисты по криобиологии и информационным базам данных, патентный поверенный РФ.
В ВКПМ регулярно проходят практику студенты различных учебных заведений, выполняющие курсовые и дипломные работы, проводится обучение аспирантов с последующей защитой кандидатских диссертаций по различным тематикам как биотехнологии и микробиологии, так и молекулярной биологии.
ВКПМ активно сотрудничает с отечественными и зарубежными научными центрами в том числе с коллекциями культур.
Глава 2. ГРИБЫ
Грибы составляют особое царство Fungi (Mycota), они обладают признаками, характерными как для растений, так и для животных. Признаки растений: голофитный способ питания (поглощение питательных веществ через клеточную стенку), способность к синтезу витаминов, наличие ригидной клеточной стенки, вакуолей, поперечных перегородок в мицелии, полярность клетки, способность к неограниченному росту, размножение спорами. Признаки животных: отсутствие хлорофилла, гетеротрофный тип питания, образование мочевины в ходе азотистого обмена и гликогена - в процессе углеводного обмена, наличие хитина в клеточной стенке, формирование лизосом в цитоплазме, особенности первичной структуры цитохромов и тРНК. Своеобразие грибов проявляется не только в сочетании признаков, присущих растениям и животным, но и в наличии специфических черт и свойств, характерных только для членов царства Mycota: мицелиальной структуры вегетативного тела; сложных ядерных циклов и плеоморфизма; многоядерности и гетерокариоза (разнокачественность ядер в одной клетке); дикариоза (длительное существование в одной клетке двух ядер, одновременно делящихся и имитирующих диплоидное ядро).
Разнообразие представителей этого царства отражает их классификация, построенная на основании структурно-химических и морфологических признаков.
2.1. Морфология и ультраструктура
В ходе жизненного цикла грибов происходит образование вегетативных и репродуктивных структур. Вегетативная структура - это мицелий и его видоизменения. Любая часть мицелия в благоприятных условиях может дать начало новой особи.
Репродуктивными называют структуры, специально предназначенные для размножения (рис. 5). Репродукционное бесполое размножение происходит с помощью особых клеток - спор, образующихся без участия полового акта. Репродукционное половое размножение включает обмен генетическим материалом при слиянии ядер (кариогамии) и редукционное деление (мейоз), связанные с образованием определенных морфологических структур.
©= |
Рис. 5. Морфология грибов. (Начало) Вегетативные структуры: столоны (1) и ризоиды (2) Rhizopus nigricans; оидии (3) и хламидоспоры (4) Mucor chibinensis; псевдомицелий (5) и бластоконидии (6) Candida spp.; почкующиеся клетки (7) Saccharomyces cerevisiae. Анаморфы: спорангий со спорами (8), спорангиеносец (9), конидиеносец (10), стеригмы (11), конидии (12) Aspergillus spp. (А) и Peniciliium spp. (В) Телеоморфы: сумки с аскоспорами (13) S. cerevisiae (Endomycetes), перитеций, содержащий сумки с аскоспорами (14) Sordariaspp. (Ascomycetes), зигоспора
(15) Mucor spp. (Zygomycetes).
Рис. 5. Морфология грибов. (Окончание) |
U) Ui
Бесполые репродуктивные структуры называют анаморфами, а половые — телеоморфами. Грибы, имеющие половую стадию развития, называют совершенными. Грибы, в жизненном цикле которых отсутствует половое размножение, называют несовершенными, дейтеромицетами или мшпоспоровыми грибами.
Анаморфы и телеоморфы строго приурочены к определенной фазе жизненного цикла гриба, образуются при наличии особых условий внешней среды и выполняют дифференцированные функции (табл. 5).
Таблица 5
Функциональная и морфологическая дифференцировка таллома
|
Клеточная стенка обеспечивает механическую прочность клетки, постоянство ее формы, служит барьером проницаемости и защищает клетку от внешних воздействий. Характерная черта клеточной стенки - способность к росту и интенсивной перестройке в течение развития грибов (в их онтогенезе). Компоненты клеточной стенки можно подразделить на две группы: структурные компоненты (сеть микрофибрилл) и соединения, заполняющие пространство между ними (матрикс). Первые представлены полисахаридами, включающими полиаминосахара (хитин и хито- зан) и глюканы, имеющие (3-(1,3), Р~(1,4) и (3-(1,б) связи. Вторые являются маннопротеинами, галактоманнопротеинами, глюкуронманнопротеи- нами, ксиломаннопротеинами и а-(1,3) глюканами. У мицелиальных и дрожжевых грибов имеются существенные различия в химическом составе и структуре клеточной стенки. Так, содержание хитина составляет у мицелиальных грибов 0,2-26,2 % от сухой массы клеточных стенок, а у дрожжевых 1-4 %. Помимо полисахаридов в клеточной стенке присутствуют белки и липиды. Некоторые белки являются ферментами. Ли- пиды клеточной стенки определяют ее гидрофобность и принимают участие в синтезе компонентов клеточной стенки, активируя хитинсинтетазу.
У многих грибов, особенно дрожжевых, внешняя часть клеточной стенки образует капсулу - сильно оводненный слизистый слой полисаха- ридной природы. В капсуле локализованы многие ферменты, она принимает участие в поглощении питательных веществ из субстрата, участвует в адгезии клеток между собой и субстратом, защищает клетку от внешних воздействий (высушивания, радиации и т.п.).
Органеллы грибной клетки характерны для большинства эукари- от. В ней имеется ядро, содержащее наследственную информацию в виде ДНК, оформленной в хромосомы. Ядро заполнено нуклеоплазмой, имеет ядрышко - место синтеза прорибосом, окружено двойной оболочкой (ядерной мембраной). Ядерная мембрана имеет поры, которые связывают нук- леоплазму с цитоплазмой.
Митохондрии содержат ферменты дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования, а также цикла трикарбоновых кислот, обеспечивая энергетические потребности клетки.
Рибосомы 80S частично располагаются в цитоплазме, однако большинство их прикреплено к мембранам эндоплазматического ретикулума, митохондриям и другим органеллам.
Одним из основных компонентов клеточных органоидов являются мембраны. С ними связано большинство метаболических процессов. Они составляют от 40 до 90 % общей массы клеток. Цитоплазматическая мембрана служит осмотическим барьером, в ней локализуется система активного транспорта, она способна к пиноцитозу и фагоцитозу. Эндоп- лазматический ретикулум (ЭР) расположен в цитоплазме в виде сети канальцев, цистерн и трубочек, не имеющих фиксированной ориентации, выполняет транспортную функцию, связывает цитоплазматическую мембрану с ядерной, образует поверхности раздела в цитоплазме, на его мембранах могут располагаться рибосомы.
Аппарат Гольджи представляет собой систему вакуолей, он обеспечивает экскрецию (выведение) по типу обратного пиноцитоза с помощью пузырьков, аккумулирующих выводимые продукты, и транспорт веществ, синтезированных в ЭР, к другим органоидам. Кроме того, аппарат Гольджи - место синтеза новых мембран и образования лизосом.
Лизосомы содержат около сотни ферментов, преимущественно гид- ролаз, осуществляющих функцию пищеварения.
Вакуоли образуются из ЭР и выполняют многообразные функции. В них могут накапливаться вредные продукты метаболизма, они участвуют в компартментализации веществ в клетке (их разделении и концентрации), в них накапливаются необходимые клетке метаболиты (полифосфаты, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания). Вакуоли обеспечивают тургор клеток. Новообразование мембран ЭР и Гольджи происходит на матрице ядерной мембраны.
Цитоплазма содержит включения, которые служат запасными питательными веществами: гликоген, волютин (полифосфат), липиды.
Цитоскелет наряду с мембранными структурами обеспечивает внутриклеточную организацию и высокую биологическую упорядоченность всех метаболических процессов, протекающих в клетке. Цитоскелет представляет собой развитую сеть белковых нитей (филаментов), из которых наиболее важная роль принадлежит микрофиламентам и микротрубочкам. Те и другие состоят из глобулярных белковых субъединиц, которые в клетке могут легко соединяться между собой и разъединяться. Помимо этого существуют вспомогательные белки, которые либо связывают филаменты друг с другом или с другими клеточными структурами, либо влияют на скорость и степень полимеризации филаментов. Цитоскелет связан с движением органоидов клетки и амебоидным движением, присущим некоторым грибам.
Другие подвижные клетки грибов (зооспоры, планогаметы) передвигаются с помощью жгутиков. Жгутики грибов по строению отличаются от жгутиков бактерий, но сходны с аналогичными органеллами простейших и многих подвижных гамет растений и животных.
2.2. Экология
Грибы широко распространены в природе на самых различных субстратах. Они предпочитают водные или влажные местообитания, но встречаются и в относительно сухих средах. Грибы являются гетеротрофами, потребляют органические соединения углерода. Азот, фосфор, сера, ионы металлов могут поглощаться в неорганической форме. Питательные вещества грибы получают, принимая участие в разложении органического вещества или паразитируя на животных и растениях.
Многие грибы переносят значительные изменения температуры, ме- зофильные грибы предпочтительно развиваются в пределах (24±30) °С. Термофильные - в диапазоне (33±55) °С, психрофильные - от -2 °С до +20 °С. Свет, особенно в коротковолновой области, может влиять на спо- роношение грибов.
Экологические группы грибов сформировались в процессе эволюции. Сапротрофные грибы принимают участие в минерализации органических веществ, образовании гумуса, ксилотрофные грибы разлагают древесину, кератинофилы способны жить на волосах, перьях, рогах и т. п. павших животных. Симбиотрофные грибы образуют микоризу, имеющую огромное значение для жизни многих растений. Лишайники - это стабильные симбиотические ассоциации гриба с водорослями или циано- бактериями. Грибы - паразиты растений и животных описаны ниже.
Грибы являются активными биодеструкторами, вызывая повреждения разнообразных материалов и изделий, в том числе и фармацевтической продукции. Содержание грибов в нестерильных лекарственных средствах регламентируется фармакопеей.
Грибы, как и другие организмы, способны существовать в относительно узком диапазоне температур, влажности, почвенных условий и других факторов среды. Эти условия определяют их географическое распространение. Распространению популяций препятствуют географические преграды (океаны, пустыни, горные цепи) и способствуют агенты, действующие как средства переноса: воздух, вода, животные и человек.
Для некоторых грибов характерна способность обитать длительное время в неизменных и ограниченных зонах - эндемических областях (очагах). К таким грибам относятся возбудители глубоких микозов Coccidioides immitis и Paracoccidioides brasiliensis, которые встречаются в зонах с определенными климатическими условиями (Центральная Америка для первого гриба и Южная Америка для второго). Дерматофиты Trichophyton soudanense обнаруживается только в Африке, a T.concentricum - в Южной Океании. Многие грибы являются космополитами, их можно обнаружить в любой местности, где условия для них окажутся благоприятными. Таковы возбудители многих микозов человека и фитопатогенные грибы.
2.3. Использование грибов в промышленности
С древних времен человек использует дрожжи Saccharomyces cerevisiae для изготовления хлеба, пива, вина. В современной промышленной микробиологии грибы служат продуцентами антибиотиков, алкалоидов, белков, витаминов, гербицидов, ферментов, коферментов, ингибиторов ферментов, полисахаридов, липидов, органических кислот и др. Некоторые дрожжевые грибы используют для получения кормового белка на непищевом сырье. Многие грибы из класса базидиомицетов (макро- мицеты, образующие крупные плодовые тела) обладают целебными свойствами, их культивируют поверхностным и глубинным (в ферментерах) способами и используют как лекарственные препараты и пищевые добавки.
2.4. Грибы - возбудители болезней человека и животных
Грибы могут наносить вред человеку и животным путем отравления их метаболитами, вызывая состояние повышенной чувствительности к различным веществам, входящим в состав их клеток или продуцируемым ими (микогенная аллергия), и вызывая инфекционные заболевания (микозы).
Отравление может происходить при поедании ядовитых или испорченных грибов, при неправильном приготовлении и хранении шляпочных грибов. Их токсины действуют из пищеварительную, нервную системы или на другие ткани тела.
Другая группа заболеваний, вызванных отравлением метаболитами грибов (микотоксикозы), связана с тем, что токсинообразующие грибы заселяют растения, продуцируя при этом или во время хранения урожая ядовитые вещества, действующие и после переработки растительных продуктов в корма или продовольствие.
Микогенные аллергии возникают у чувствительных людей в ответ на антигенные вещества грибов. Они проявляются в виде кожной сыпи, насморка, конъюнктивита, диареи, астматических явлений и т. п. Аллергенами могут быть клетки мицелия, споры гриба и продукты их обмена или распада. Эти заболевания могут возникать и развиваться у персонала биотехнологических предприятий, использующих грибы как продуценты БАВ, и у населения близлежащих районов за счет загрязнения воздуха при плохой очистке заводских выбросов. Меры предупреждения состоят в строгом соблюдении техники безопасности (защитная одежда, маски, респираторы, герметизация оборудования) и тщательной очистки воздуха, контактировавшегося с микроорганизмами.
Опасна также работа в складских помещениях, где плесневые грибы могут развиваться при неправильном хранении сырья в условиях высокой влажности, образовании конденсата на поверхностях и т. д. Такие помещения должны быть снабжены приточно-вытяжной вентиляцией, а температуру необходимо поддерживать постоянной, чтобы предотвратить появление конденсата.
Микозы человека. В последние десятилетия наиболее часто встречаются оппортунистические микозы, возникающие при ослабленном иммунитете и вызываемые условно-патогенными грибами, которые ветре- чаются среди представителей родов Penicillium, Aspergillus, Mucor, Alemaria, Cladosporium, Fusarium, Candida, Geotrichum, Saccharomyces, Rhodotorula, Sporobomyces, Trichosporon и др. Они могут входить в состав нормальной микробиоты человека и животных и активируют свои паразитарные свойства под влиянием нерациональной антибиотической и кортикостероид- ной терапии, при использовании иммунодепрессантов и при ослаблении реактивности организма в связи с предшествующим заболеванием.
Наряду с этим существуют и микозы, вызванные патогенными грибами. К ним относятся дерматомикозы и глубокие микозы (кокцидиои- доз, паракокцидиоидоз, бластомикоз, гистоплазмоз). Всего патогенных грибов насчитывают около 100 видов, тогда как грибов-оппортунистов - несколько сотен видов.
В табл. 6 приведены наиболее важные возбудители (этиологические агенты) микозов человека. Этиологический агент - либо один паразитический вид, либо группа близких микроорганизмов. Клиническая картина микоза сильно варьирует в зависимости от фонового заболевания, локализации очага или тяжести поражения. Например, аспергиллы могут вызывать поражение кожи, подкожных тканей, легких, грибы рода Candida - слизистых оболочек рта и половых органов, кожи, ногтей, бронхов, легких и других органов.
Таблгща 6
Основные возбудители микозов человека
|
мулов и ослов, a Pityrosporum pachydermatis - дерматомикоз у собак, коров, лошадей, свиней и носорогов. Грибы рода Saprolegnia (Oomycetes) паразитируют на рыбах,
2.5. Фитопатогенные грибы
Грибы, вызывающие заболевания лесных пород и культурных растений, наносят огромный ущерб. Массовые заболевания растений (эпи- фитотии) могут быть причиной голода населения целых стран. Болезни снижают потенциальный урожай на 10-20 % и более. В Центральной Европе насчитывают до 162 серьезных заболеваний сельскохозяйственных культур. Из них 135 (83 %) вызываются грибами, остальные - бактериями и вирусами. Поражая лекарственные растения, грибы, как и другие микроорганизмы, делают их непригодными для использования в качестве сырья в фармацевтической промышленности.
Грибы проникают в ткани растения через устьица или через раны на его поверхности, они способны прорывать поверхностные структуры своими инфекционными гифами. Далее гриб распространяется по растению, что сопровождается появлением симптомов его заболевания. На следующей стадии инфекционного процесса гриб развивает органы спороноше- ния, а реакция растения зависит от количества и качества возбудителя заболевания.
Меры борьбы и профилактики. Некоторые болезни передаются семенами, поэтому важным мероприятием оказывается обеззараживание семян. Одним из источников инфекции являются опавшие на поверхность почвы пораженные растительные остатки. Поэтому эффективна глубокая зяблевая вспашка, способствующая перемещению паразитов вглубь почвы, где они погибают под антагонистическим воздействием бактерий и актиномицетов или поедаются простейшими животными. Важное значение имеет сбор и уничтожение опавших листьев, плодов, ветвей, правильный севооборот, препятствующий накоплению в почве заразного начала.
Широко используются меры химической защиты растений. Большое значение имеет правильная обработка почвы и внесение удобрений, что повышает сопротивляемость культурных растений. Весьма важны выведение и подбор устойчивых к заболеваниям сортов, интересны также сверхчувствительные сорта, быстрая гибель которых ведет к прекращению развития паразитического гриба. Для предупреждения переноса возбудителей из одной страны в другую существуют специальные карантинные службы, осуществляющие специальные мероприятия.
Глава 3. ВИРУСЫ И ЛРИОНЫ
Вирусы существенно отличаются от других форм жизни своими размерами, строением генома и особенностями его воспроизводства.
Размеры вирусных частиц (вирионов) находятся в пределах 28-250 нм, их можно рассмотреть только с помощью электронного микроскопа. Вирион содержит только один тип нуклеиновых кислот - ДНК или РНК. Вирусы не способны строить свои структурные элементы (белки, нуклеиновые кислоты и др.) из компонентов питательной среды, они не способны расти на питательных средах, а для своего воспроизводства используют метаболические системы клетки хозяина (человека, животного, растения, бактерии), т. е. являются облигатными паразитами.
3.1. Структура вирусов
Вирусная частица (вирион) содержит генетический материал (ДНК или РНК), окруженный белковой оболочкой (капсидом) (рис. 6). ДНК может образовывать кольцевые или линейные структуры. РНК представлена одно- или двухнитевыми молекулами, у некоторых вирусов может быть сегментированной. Преимущество сегментированного генома в том, что в дискретных фрагментах содержится информация, которую не способна
Рис. 6. Схематическое изображение структуры вируса гриппа |
обеспечить единая молекула. В зависимости от выполняемых функций однонитевые РНК подразделяют на две группы:
1 - РНК способна непосредственно транслировать генетическую
информацию на рибосомы клетки-хозяина, т. е. выполнять функции иРНК, ее обозначают +РНК (плюс-нити РНК, позитивный геном).
2 - РНК вируса не способна функционировать как иРНК, а служит
матрицей для образования +РНК, ее обозначают -РНК (минус- нити, негативный геном).
Ретровирусы содержат+РНК, на матрице которой фермент реверта- за (РНК-зависимая ДНК-полимераза) синтезирует ДНК-провирус, интегрирующий в клеточный геном.
Капсид защищает геном от внешних воздействий, например, от действия нуклеаз клетки хозяина. На его поверхности располагаются системы распознавания рецепторов клетки хозяина и адсорбции на ее поверхности. Обычно это гликопротеиды, молекулы которых в виде ворсинок окружают вирион. Вирусы бактерий - бактериофаги часто имеют особые структуры, облегчающие их проникновение внутрь клетки. Некоторые вирусы в составе вириона имеют ферменты, участвующие в разрушении оболочки клетки хозяина (фаговый лизоцим) или в репликации его генома (например, вирус иммунодефицита человека содержит обратную транс- криптазу). Капсид построен из идентичных белковых субчастиц - капсо- меров. Субъединичная структура обеспечивает экономию генетического материала, а также самосборку вириона за счет нековапентных межмолекулярных взаимодействий подобно процессу кристаллизации. Кроме того, такая структура способствует освобождению генетического материала внутри клетки хозяина путем диссоциации нековалентно связанных субчастиц. Форма вириона определяется характером самосборки капсоме- ров и может быть кубической, спиральной или соединять несколько структурных компонентов. На поверхности белкового капсида многие вирусы млекопитающих имеют липопротеиновую оболочку, которая обычно образуется из мембраны клетки хозяина.
3.2. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина
ДНК хозяина |
Передача фага дочерним клеткам |
Б актер и а ф ига (фаги)-это вирусы бактерий (прокариот). Их генетический материал содержится в головке, имеющей белковую оболочку. Хвостовые нити и зубцы предназначены для распознавания рецепторов на поверхности бактериальной клетки и адсорбции на ней. Распознавание специфично не только для вида бактерии, но и для штамма, что служит основой для фаготипирования бактерий. У некоторых фагов хвост имеет чехол, покрывающий стержень. После адсорбции фага на клетке чехол сокращается, проталкивая стержень внутрь. Через стержень фаговая НК проникает внутрь клетки. Процесс облегчается благодаря местному повреждению клеточной стенки фаговым лизоцимом. Таким сложным органом инфицирования обладают лишь некоторые фаги грамотрицательных бактерий. На клеточной стенке грамположительных бактерий имеются рецепторные участки, которые способствуют проникновению в клетку крупных молекул и бактериофагов. Чувствительное место для атаки - это пили, к которым фаги могут прикрепляться. Некоторые фаги впрыскивают в клетку свою НК, другие проникают интактными. По типу взаимодействия с бактериальной клеткой фаги подразделяют на вирулентные и умеренные (рис. 7). Вирулентные фаги размножаются внутри клетки. Созревшие частицы фага изнутри разрушают клеточную стенку и выходят наружу, клетка при этом погибает. Умеренные фаги также способны лизировать бактерии, однако, в большинстве клеток популяции они существуют в клетке в виде профа- га— фаговой НК, которая подобно плазмидам может интегрировать с хро-
Вирусная ДНК летка хозяина
Репликация ви | Индукция | ||
русной ДНК | - \ 1 | Профаг | |
/ ~ |
Сборка частиц фага Лизис клетки хозяина и выход фага |
Вирусная ДНК, интегрированная в хромосому хозяина |
; гнг
Рис, 7. Скема развития вирулентного (А) и умеренного (В) бактериофагов
мосомой, что обеспечивает ее передачу дочерним клеткам. Лизогенные (несущие умеренный фаг) бактерии невосприимчивы к заражению теми фагами, которыми они лизогенизированы, а также близкородственными фагами. Эта невосприимчивость связана с образованием особого репрес- сора, препятствующего размножению фага. Этот же репрессор препятствует переходу профага в активное состояние и синтезу фаговых белков. Спонтанно лизогенные бактерии лизируются редко (10"М0"5 в одной генерации). Частота лизиса зависит от внешних условий, например, состава питательной среды. Мутагены (ультрафиолетовые лучи, Н,0 , митоми- цин С и др.) могут индуцировать массовое развитие зрелых фаговых частиц в клетках лизогенной культуры, связанное с нарушением механизма репрессии. Мутации также могут быть причиной перехода умеренного фага в вирулентное состояние. Такие мутанты оказываются устойчивыми к репрессору или утрачивают способность вызывать синтез репрессора в клетке.
Обычно лизогения - это весьма стабильное состояние, однако, некоторые клетки способны утрачивать фаг и вместе с этим резистентность к данному типу фага.
Лизогения - чрезвычайно распространенное явление: большая часть штаммов бактерий несет в себе НК одного или нескольких фагов, которая определяет фенотипические показатели культуры (морфологические, куль- туральные, антигенные, токсигенные и др.). Это явление носит название фаговой конверсии.
Инфекционные фаги, продуцируемые лизогенной культурой, способны лизогенизировать другие штаммы данного вида бактерии (или близкородственных видов). При переходе из интегрированного с бактериальной хромосомой состояния в автономное геном фага может включить в свою структуру соседние гены нуклеоида клетки донора и перенести их в другую клетку (реципиент). Это явление носит название трансдукции. Путем трансдукции могут быть переданы многие важные признаки бактерий: резистентность к антибиотикам, вирулентность, токеигенность и др.
Практическое использование фагов. Фаги широко используются в генетической инженерии в качестве векторов - переносчиков генов в процессе создания рекомбинантных молекул ДНК. В медицине фаги назначают с профилактической и лечебной целью при дизентерии, брюшном тифе и других энтеральных заболеваниях, при гнойно-воспалительных процессах и дисбактериозе. Широко используют фаги в диагностике инфекционных заболеваний и идентификации микроорганизмов. Реакция нарастания титра специфичного фага указывает на присутствие соответствующего вида микроорганизма в объектах внешней среды (вода, пищевые продукты и т.п.)- Метод фаготипирования позволяет установить био- вар бактерии и тем самым выявить источник инфекции. Поскольку многие вещества, вызывающие индукцию профага и переход его в активное состояние, являются онкогенными, лизогенные культуры бактерий могут быть использованы для выявления потенциальных канцерогенов.
Вирусы млекопитающих. По сравнению с бактериофагом, лити- ческий цикл которого завершается в пределах 30 мин, вирусы млекопитающих размножаются медленно, в культуре ткани цикл репликации занимает от 4 до 24 час и включает стадии адсорбции, проникновения внутрь клетки и процесс образования зрелых вирусных частиц.
Адсорбция обусловлена двумя механизмами: неспецифическими (электростатическими и ван-дер-ваальсовыми силами) и специфическими, более прочными, представляющими собой взаимодействие рецепторов вируса с соответствующими рецепторами клетки по принципу биологического узнавания.
Проникновение вирусов млекопитающих внутрь клетки зависит от природы вируса. На поверхности вирионов многих групп вирусов, например, гриппа имеются особые шипы, содержащие нейраминидазу и ге- магглютинин, которые участвуют в проникновении вириона в клетку. Вирусы оспы и герпеса поглощаются клеткой, как при фагоцитозе.
Депротеинизация (высвобождение вирусной НК) происходит с участием ферментов клетки хозяина.
Синтез вирусных НК и белков определяется природой вируса. У ДНК-геномных вирусов процесс начинается с синтеза ранней иРНК с участием РНК-полимеразы клетки хозяина или вириона. На матрице ранней РНК синтезируются ранние белки, необходимые для последующей репликации ДНК. Репликация также происходит под действием клеточных или вирусных ферментов. На матрице реплицирующейся ДНК происходит синтез поздних иРНК, которые направляют синтез белков вируса.
У РНК-геномных вирусов, содержащих +РНК, последняя транслируется на рибосомах клетки хозяина. Вирусная -РНК используется как матрица для построения с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы комплиментарной копии +РНК, которая функционирует как информационная.
Необходимым этапом жизненного цикла ретровирусов является интеграция его генома в форме ДНК-провируса в хромосому хозяина. Синтез ДНК-провируса на матрице вирусной +РНК происходит с участием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Интегрированная в одну из хромосом хозяина вирусная ДНК транскрибируется клеточной РНК-полимеразой. Ретровирусы часто являются онкогенными, поскольку включение их ДНК в геном клетки-хозяина вызывает ее перерождение. По этой же причине онкогенными могут быть и ДНК-геном- ные вирусы.
Самосборка вириона-это физико-химический процесс, в результате которого формируется капсид с встроенной в него НК. У вирусов, имеющих наружную оболочку, формирование вирионов происходит на клеточной мембране, компоненты которой входят в состав оболочки вируса.
Выход вирионов у одних вирусов сопровождается гибелью клетки, у других - только частичным повреждением мембраны.
Многие вирусы патогенны для человека (табл. 7), животных и растений.
Таблица 7
Возбудители вирусных болезней человека
Вирусы | Геном | Заболевания |
Герпесвирусы | 2 н ДНК линейная | Герпес, ветряная оспа, опоясывающий лишай, инфекционный мононуклеоз, энцефалит и др. |
Паповавирусы | 2 н ДНК циклическая | Папилломы и полиомы |
Аденовирусы | 2 н ДНК линейная | Конъюнктивиты, гастроэнтериты |
Поксвирусы | 2 н ДНК | Оспа и др. |
Парвовирусы | 1 н ДНК | Анапластический криз у детей |
Гепаднавирусы | 2 н ДНК неполная кольцевая | Гепатит В |
Ортомиксовирусы | 1 н РНК сегментированная | Грипп |
Парамиксовирусы | 1н РНК ' | Парагрипп, корь, |
несегментированная | эпидемический паротит и др. | |
линейная | ||
Пикорнавирусы | +РНК несегме нти ро ван н ая | Полиомиелит, менингит, OP3 |
Рабдовирусы | 1 н РНК | Бешенство и др. |
Тогавирусы | 1н+PHK | Гепатит С, лихорадка, краснуха, энцефалиты |
Буньявирусы | 1 н -РНК сегментированная | Лихорадки, энцефалиты |
Аденовирусы | 1 н -РНК сегментированная | Геморрагические лихорадки, менингиты, гриппоподобные заболевания |
Филовирусы | 1 н-РНК | Геморрагические лихорадки |
Коронавирусы | 1 н +PHK | Гастроэнтериты, |
несегментированная | респираторные инфекции |
Олончание табл. 7
|
3.3. Культивирование вирусов
Культивирование вирусов в лабораторных условиях является этапом диагностики многих вирусных болезней, кроме того, оно необходимо для получения вакцинных препаратов. Поскольку вирусы являются облигатными паразитами, они способны размножаться только в живых клетках, например, в культуре ткани (клетках тканей человека или животных, растущих на питательном субстрате, обычно в виде монослоя на плоской поверхности сосуда). Присутствие вирусов можно обнаружить по цитопатическому эффекту (ЦПЭ), т. е. разрушению монослоя клеток. Метод позволяет идентифицировать вирус, например, в клиническом материале, с помощью иммунной сыворотки. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус, и ЦПЭ в ее присутствии не будет проявляться.
Вирусы выращивают также путем заражения лабораторных животных или эмбрионов птиц.
3.4. Действие химических и физических факторов на вирусы.
Принципы создания антивирусных препаратов
Нагревание - наиболее эффективный способ уничтожения вирусов. Большинство вирусов, патогенных для человека, погибает при 60 °С в течение 30 минут; однако вирус гепатита В выдерживает эту температуру в течение 4 часов. Вирусы выдерживают глубокое охлаждение и могут храниться при температуре от^Ю °С до -70 °С. Высушивание губительно для некоторых вирусов, на других оно не действует. Ультрафиолетовое облучение инактивирует вирусы, повреждая их НК, что может быть использовано при изготовлении вирусных вакцин.
Вирусы, имеющие липидную оболочку, инактивируются органическими растворителями (хлороформом, эфиром); это явление используют при классификации вирусов. Многие химические дезинфектанты, используемые против бактерий (фенолы, спирты, ЧАС) малоэффективны против вирусов. Наиболее активны хлор, гипохлориты, йод, альдегиды и оксид этилена.
Для профилактики и лечения вирусных инфекций применяют им- мунопрепараты и химиотерапевтические средства. По спектру действия и клинической значимости препараты, применяемые для лечения вирусных заболеваний, подразделяют на следующие группы: этиотропные, иммуномодулирующие, патогенетические (направленные на борьбу с интоксикацией, обезвоживанием, поражениями органов, аллергическими реакциями, а также на профилактику бактериальных осложнений) и симптоматические (купирующие соответствующую симптоматику, например, головную боль, кашель). Симптоматическую и патогенетическую терапию проводят практически в 100 % случаев, тогда как этиотропные химиотерапевтические средства применяют ограниченно. Причиной этого являются трудности создания препаратов, избирательно подавляющих репродукцию возбудителя и не затрагивающих процессы жизнедеятельности организма хозяина. Большинство ингибиторов вирусспецифичес- ких процессов, тесно связанных с клеточным метаболизмом, оказываются токсичными.
Тем не менее, определены этапы жизненного цикла некоторых вирусов, подавление которых мало влияет на клетки хозяина. Прежде всего, это адсорбция и проникновение вируса в клетку, депротеинизация НК и некоторые процессы, связанные с синтезом НК, трансляцией и сборкой вириона.
Антивирусные химиотерапевтические вещества отличаются узким спектром активности (в пределах одного вида или семейства), число их ограниченно (табл. 8).
А мантадин,ремантадин - трициклические симметричные ада- мантамины активны против вирусов гриппа А и коревой краснухи. Эти вещества взаимодействуют с белком М2 вируса, что приводит к блокаде слияния оболочки клетки и вируса и проникновения нуклеокапсида в цитоплазму. Кроме того, они блокируют первичную транскрипцию и активацию гемагглютинина. Препараты проявляют профилактическое действие при приеме до заражения и на ранних стадиях инфекции.
Таблица 8
Спектр активности противовирусных препаратов, зарегистрированных в РФ
|
Видарабин (аденинарабинозид) - наименее токсичный и наиболее эффективный из аналогов пуринов, блокирует сборку ДНК, его ин- термедиат ингибирует вирусную ДНК-полимеразу. Применяют при лечении герпетических инфекций,
Цитозинарабинозид - аналог видарабина более токсичный, с меньшей избирательностью действия. Применяют при химиотерапии опухолей.
Гомогенизированные производные дезоксиуридина - йодоксиу- ри дин, три фтор и дин (трифтортимидин)фосфорилизуются вирусной тимидинкиназой и встраиваются в ДНК вируса, что приводит к образованию дефектных вирусных белков. Применяются местно при герпетических кератитах.
Аналоги нуклеозидов, избирательно активируемые вирусспеци- фической тимидинкиназой -ацикловир, фамцикловир, ганцик- л о в и р обладают избирательным действием на инфицированные вирусами клетки. Для активации необходимо их превращение в макроэргичес- кий трифосфат, который ингибирует вирусную ДНК-полимеразу. Первый этап фосфорилирования индуцирует вирусспецифическая тимидинкина- за. Нативная форма препаратов неактивна, поэтому они не влияют на синтез ДНК в незараженных клетках. Применяют при герпетических инфекциях, назначают внутрь, внутривенно и в виде глазной мази.
Ингибиторы обратной транскриптазы активны против ретрови- русов, включая ВИЧ. Зидовудин (азидотимидин), зальцитабин (ди- дезоксицитидин),диденозин (дидезоксиинозин),ставудин (дидегид- родезокситимидин) действуют как конкурентные ингибиторы фермента, кроме того, прекращают элонгацию при синтезе белка на рибосомах. Обладают значительной токсичностью.
Ингибиторы протеаз - негидролизующиеся синтетические пептиды с акцинавир,ратон авир,инд и навир конкурентно взаимодействуют с протеазами ВИЧ, в результате чего в ВИЧ-инфицированных клетках накапливаются нерасщепленные предшественники gag-полипротеинэ, проявляющие цитотоксическое действие. Используют в сочетании с ингибиторами обратной транскриптазы у ВИЧ-инфицированных больных.
Нуклеозидные аналоги широкого спектра. Рибавирин - аналог гуанозина, действует на РНК- и ДНК-геномные вирусы. Разрешен для лечения тяжелых респираторных инфекций у детей и других заболеваний. Вызывает побочные эффекты, включая подавление иммунитета.
Фоскарнет (тринатриеваясольфосфорномуравьинойкислоты)ингибирует активность обратной транскриптазы и всех ДНК-полимераз гер- песвирусов и возбудителя гепатита В. Применяют для лечения герпетических инфекций.
Nj-метилизатин-р-тиосемикарбазон (метизазон, марбо- ран) угнетает синтез поздних иРНК и поздних полисом у поксвирусов. Применяется для лечения оспы.
Устойчивость вирусов к химиотерапевпшческим препаратам. Вирусам, как и всем живым существам, присуща способность адаптироваться к изменяющимся условиям внешней среды, в том числе и к действию биоцидов. Адаптация происходит как в результате селекции устойчивых штаммов, сформировавшихся в ходе предшествующей эволюции, так и в результате селективного отбора вновь возникающих штаммов. Обычно устойчивость связана с модификацией структуры мишени препарата. Преодоление развития резистентности в условиях клиники возможно при комбинированном применении препаратов с различными механизмами действия и при использовании препаратов, воздействующих на разные этапы репродукции вируса.
Интерфероны и индукторы интерфероное.
Интерфероны (ИФН) обладают универсально широким спектром антивирусной активности, поскольку действуют не на вирионы или их НК, а индуцируют антивирусное состояние клетки, стимулируя образование комплекса белков, блокирующих транскрипцию вирусной иРНК. ИФН не проникают в клетки, а взаимодействуют с мембранными рецепторами, индуцируя образование цАМФ, передающего сигнал на соответствующий оперон ДНК. Кроме того, ИФН активируют гены, кодирующие продукты с прямым антивирусным действием - протеинкиназы, нарушающие сборку белковой молекулы, и аденилатсинтетазы, продукт которых активирует эндонуклеазу, разрушающую вирусные иРНК. Гамма-ИФН активирует ци- тотоксические лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, макрофаги, гранулоциты, способствующие уничтожению инфицированных клеток.
Медицинские препараты ИФН делятся на природные и рекомбинан- тные, их эффективность при различных заболеваниях указана в табл. 9.
Томища 9
Противовирусная активность препаратов ИФН
|
Окончание табл. 9
|
Спектр противовирусной активности индукторов ИФН |
Индукторы ИФН - это весьма разнородная по составу группа природных и синтетических соединений, способных вызывать в организме образование собственного (эндогенного) ИФН. Подобно ИФН они обладают универсально широким спектром противовирусной активности (табл. 10), а также иммуномодулирующим действием, которое определяет их эффективность при многих невирусных заболеваниях.
Таблица 10
|
3.5. ПриОНЫ
3.5.1. Прионы как инфекционные агенты
Прионы - это гликопротеины, которые способны индуцировать в нормальном клеточном белке конформационный переход в конформер с инфекционной активностью. Источником нормального белка является сама клетка, в которой постоянная экспрессия гена PRNP создает пул белка РгРс - нормального компонента клеточных мембран. Контакт с инфекционным прионом PrPsc (sc - скрепи) вызывает переход нормального белка в конформационное состояние PrPsc. Этот переход осуществляется в период посттрансляционного процессинга предобразованного нормального клеточного белка.
Нормальный белок РгРс локализуется в цитоплазматической мембране и участвует в функционировании сигнальных систем клеток, в частности нейронов, и предположительно в биогенезе и развитии нервной системы. Его конформационная модификация вызывает нарушение этих процессов. Кроме того, конформеры индуцируют апоптоз инфицированных клеток и генерируют нейротоксические полипептиды, предположительно образующие поры в нейронах и связывающие нуклеиновые кислоты, а также блокируют репликацию митохондрий, вызывая их дегенерацию. Последнее лежит в основе многих неврологических заболеваний.
Заболевания, вызываемые прионами, характеризуются поражением центральной нервной системы: болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Гертсманна-Штреуссера-Шейннера, семейная смертельная бессонница, куру, скрепи овец и коз, трансмиссивная губчатая энцефалопатия коров и др. Источником инфекции являются ткани больного организма. Заражение человека возможно алиментарным путем, атакже при использовании лекарственных препаратов, полученных из тканей больных животных, или недостаточно обезвреженных медицинских инструментов. У коров и овец инфекционные агенты передаются через корма, содержащие ткани погибших животных.
Для заболеваний, вызванных прионами, характерен очень длительный инкубационный период. Развитие инфекции тесно связано с функциями генома и жизнедеятельностью клеток, обеспечивающих накопление белка PrPsc и постепенное прогрессирующее развитие симптомов, которое может затягиваться на месяцы и годы.
Для прионных заболеваний характерно практически полное отсутствие иммунного ответа в связи с высокой консервативностью первичной структуры белка; эти инфекции не реагируют на иммуномодулирующую терапию, хотя делаются попытки получить иммунопрепараты, воздействующие на отдельные этапы формирования конформированных белков.
3.5.2. Прионы в фармацевтической практике
Прионы представляют собой индивидуальные белки с молекулярной массой от 20 до 30 кДа при длине полипептидной цепи около 254 аминокислотных остатков. Они фильтруются через фильтры с диаметром пор 25-50 нм.
Прионы стабильны при температуре 90 °С в течение 30 мин, инак- тивируются только при автоклавировании при 135 °С в течение 30 мин. Однако описаны случаи инфицирования при применении автоклавиро- ванного медицинского инструмента (стоматологического, отоларингологического, нейрохирургического). Прионы резистентны к воздействию химических агентов (глутаровый альдегид, формальдегид, в-пропиолактон, этанол, толуол, ксилол), нуклеазам, УФ и ионизирующей радиации. Менее резистентны к ацетону, натрия гидроксиду, ионным Детергентам типа натрия додецилсульфата, фенолу, хлороформу, сильным окислителям, эти- леноксиду, протеазам.
Прионы имеют ограниченный спектр хозяев, но способны адаптироваться к новому хозяину, т. е. преодолевать межвидовые барьеры.
Опасность распространения прионных заболеваний представляет серьезную проблему для фармацевтической деятельности, включая контроль поставщиков животного сырья (недопущение получения сырья из регионов, где наблюдались случаи трансмиссивной губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота) и выбор способа стерилизации. Для термостабильного медицинского оборудования, загрязненного материалом, содержащим прионы, ВОЗ рекомендует погружение в раствор натрия гид- роксида (1н) или натрия гипохлорита (20000 ррпт активного хлора) на 1 час с последующим автоклавированием, очисткой и обычной стерилизацией.
Методы контроля полноты инактивации прионов трудоемки, длительны и дорогостоящи, они предусматривают заражение животных инфицированной тканью, подвергнутой воздействию биоцида, и математический расчет концентрации биоцида и времени, необходимых для инактивации приона. Поэтому на практике необходимо строго соблюдать регламентированный режим обработки, гарантирующий качество стерилизации.
Глава 4. ПРОСТЕЙШИЕ
Простейшие (Protozoa) - это одноклеточные эукариотические организмы, которые имеют значительно более сложную функциональную организацию по сравнению с бактериями и грибами. Их размеры составляют от 3 до 200 мкм. Наиболее крупные раковинные корненожки достигают 2-3 см в диаметре.
Снаружи тело простейших покрывает эластичная мембрана - пелликула. У некоторых видов клеточная мембрана может включать опорные фибриллы, и даже минеральный скелет. Органоиды идентичны органоидам клеток других эукариот. Специфическими органоидами движения являются псевдоподии, жгутики и реснички (рис. 8).
Всего насчитывают до 25000 видов простейших. Из них патогенными для растений, животных и человека являются около 7000 видов. Виды, патогенные для человека, входят в состав 3-х типов - Sarcomastigophora, Apicom- plexa и Ciliophora. Пути проникновения патогенных простейших в организм человека аналогичны таковым для других патогенных микроорганизмов.
4.1. Споровики
Споровики принадлежат к типу Apicompiexa, классу Sporozoa, который составляют только паразитические виды. Для них характерны как исключительно половой путь развития, так и чередование полового и бесполого циклов, обычно связанных с переменой хозяев. Своим названием споровики обязаны способности образовывать особые структуры, защищенные плотной оболочкой, условно называемые спорами. Наибольший ущерб здоровью человека наносят малярийные плазмодии и токсоплаз- мы, поражающие до 35% населения Земли.
Род Plasmodium включает более 100 видов, паразитирующих в организмах рептилий, птиц и животных. Четыре вида патогенны для человека и вызывают малярию: Plasmodium vivax - возбудитель трехдневной малярии, P. malariae - возбудитель четырехдневной малярии, P. falciparum - возбудитель тропической малярии, P. ovale - возбудитель малярии овале (типа трехдневной).
Жизненные циклы различных видов плазмодиев практически одинаковы, включают бесполую стадию (шизогония), проходящую в организме человека, и половую стадию (спорогония) в организме переносчика - самок комаров рода Anopheles.
Спорогония происходит в клетках эпителия кишечника комара и продолжается 1-3 нед. Процесс начинается с проникновения мужских и женских гамет (гамонтов) в организм комара с кровью больного. Гамон- ты сливаются попарно в зиготы, проникающие в стенку кишки и образующие там ооцисты. Содержимое ооцист многократно делится с образованием спорозоитов (веретенообразные клетки длиной 11-15 мкм), дис- симинирующие по всему организму насекомого. Часть из них проникает в слюнные железы комара, делая его переносчиком болезни.
Тканевая шизогония плазмодия происходит в гепатоцитах человека и продолжается 1-2 недели. Спорозоиты проникают в клетки печени с кровотоком через час после кровососания. Там они делятся, образуя мерозоиты (каждый спорозоит может образовать от 2000 до 40000 мерозо- итов), разрушающие гепатоциты и проникающие в кровоток.
Эритроцитарная шизогония происходит после проникновения мерозоитов в эритроциты, где они превращаются в трофозоиты (растущие формы) размером 2 мкм; микроскопия пораженных эритроцитов выявляет покоящиеся формы, содержащие ядро с одним хроматиновым зерном, и формы с псевдовакуолью, внешне напоминающие кольцо или перстень. Трофозоиты позднее увеличиваются и образуют многоядерные шизонты (делящиеся формы). Шизонты образуют новое поколение мерозоитов, инфицирующих другие эритроциты. Каждый шизонт может образовать от б до 24 дочерних мерозоитов. Выход мерозоитов из эритроцитов сопровождается их разрушением. Лихорадка наблюдается в момент выхода мерозоитов из разрушенных эритроцитов. Цикл развития для P. malariae составляет 72 часа, для других видов - 48 час. С завершением цикла размножение P. malariae и P. falciparum в печени прекращается, тогда как у P.vivax и P.ovale часть спорозоитов (гипнозоиты) остается в гепатоцитах, образуя дремлющие очаги, дающие отдаленные рецидивы.
В некоторых эритроцитах развиваются женские и мужские гамон- ты, завершающие свое развитие только в организме комара в течение 7^45 сут. (в зависимости от температуры воздуха).
Toxoplasma gondii - внутриклеточный паразит, морфологически напоминающий вытянутую дольку апельсина, длина 4—7 мкм, один конец закруглен. Распространен повсеместно, вызывает токсоплазмоз. Заражение человека происходит алиментарным путем при проникновении ооцист и тканевых цист (при употреблении полусырых мясных продуктов, с немытыми овощами и фруктами), через кожу и трансплацентарно. Инфици- рованность населения разных стран составляет от 4 до 68 %; возбудитель выделен практически от всех млекопитающих и многих птиц.
Жизненный цикл включает стадии полового и бесполого размножения. Первичные и основные хозяева-домашние кошки и другие представители семейства кошачьих, в организме которых происходит половое размножение возбудителя. Первичное заражение кошек происходит при поедании грызунов, содержащих ооцисты, из которых выходят паразиты - споро- зоиты, проникающие в клетки кишечника и превращающиеся в трофозоиты, размножающиеся делением (шизогония). Половое размножение также происходит в клетках слизистой оболочки кишечника. Образовавшиеся в результате шизогонии мерозоиты трансформируются в гаметоциты. Слияние разнополых гаметоцитов приводит к образованию зиготы (ооцисты). Ооцисты - округлые образования с плотной оболочкой размером 9-14 мкм, выделяются с испражнениями, длительно сохраняются в почве.
В организме человека происходит бесполый цикл размножения. Из ооцист выходят спорозоиты, активно поглощаемые макрофагами (незавершенный фагоцитоз). С макрофагами они диссиминируют по лимфатическим сосудам. В макрофагах происходит процесс шизогонии, на поздней стадии которой макрофаги погибают, а освободившиеся паразиты (тахизоиты) инвазируют в клетки организма (подвержены любые ядросо- держащие клетки).
Большинство случаев токсоплазмоза протекает бессимптомно, однако у людей с иммунодефицитами он приобретает тяжелый, преимущественно фатальный характер.
Род Sarcocystis представлен кокцидиями, близкими к токсоплазмам, также имеющими несколько хозяев. Человек заражается, поедая термически недостаточно обработанную говядину или свинину, содержащую саркоцисты, при этом может развиваться кишечный или мышечный сар- коцистоз.
Род Babesia включает виды, патогенные для животных и человека, вызывающие бабезиозы - маляриеподобные заболевания, особенно часто у спленэктомированных пациентов.
Род Cryptosporidium объединяет виды, паразитирующие в эпителиальных клетках кишечника теплокровных. Заражение происходит с загрязненной водой и пищей. У пациентов с иммунодефицитами вызывают хронические поражения желудочно-кишечного тракта.
4.2. Саркодовые
Саркодовые включены в тип Sarcomastigophora, класс Lobosea, отряд Amoebia. Это наиболее примитивные организмы, в большинстве сво- бодноживущие, но некоторые обитают в кишечнике человека и животных. Среди патогенных амеб наиболее распространена Entamoeba hictolytica.
Род Entamoeba включает единственный патогенный для человека вид - Е. hictolytica, вызывающий амебиаз (амебную дизентерию). Возбудитель существует в виде различных форм.
Большая вегетативная форма - крупная (20-60 мкм) клетка. От прочих амеб отличается толчкообразным поступательным движением, при котором образует псевдоподии. Выделяется с испражнениями при остром амебиазе.
Тканевая форма - мелкая (20-25 мкм) патогенная форма инвази- рует стенку толстой кишки с развитием специфических поражений.
Просветная форма - основная форма существования, образует цисты.
Цисты - неподвижные круглые (8-15 мкм) прозрачные образования, иногда содержат хроматоидные тельца (скопления РНК и протеинов). При окрашивании раствором Люголя видны 4 ядра в виде колец.
Жизненный цикл. Основной хозяин - человек. Просветные формы амебы обитают в верхнем отделе толстой кишки, питаясь бактериями и клеточным детритом. Пассивно передвигаясь с кишечным содержимым, проникают в дистальные отделы кишечника и при определенных условиях (обезвоживание, нарушение микробного ценоза, изменение рН) образуют цисты.
Из кишечника цисты попадают в воду, на руки, в пищу (переносятся мухами) и проникают в организм человека. В тонкой кишке оболочка цисты растворяется, каждое ядро делится, образуя 8 дочерних особей.
Амебы проникают в подслизистую оболочку кишечника, нарушая межклеточные взаимодействия, образуют некротоксин, разрушающий эпителиальные клетки и вызывающие некроз прилежащих тканей. Амебы проникают в кровеносные и лимфатические сосуды, а из них и в другие органы.
Менее распространены другие патогенные виды саркодовых: Naegleria fowled вызывает амебный менингоэнцефалит; амебы родов Acanthamoeba и Hartmarella - возбудители спорадических заболеваний, проявляющихся некротическими поражениями кожи, роговицы и внутренних органов, наиболее часто у ослабленных лиц или у пациентов с иммунодефицитами. Они обитают в воде, колонизируют увлажнители кондиционеров, что может приводить к попаданию амеб в воздух.
4.3. Жгутиконосцы
Отличительной чертой представителей этого класса является наличие жгутиков, обеспечивающих их движение. У некоторых видов эту функцию выполняет ундулирующая мембрана - тонкая перепонка, образованная продольным соединением одного из жгутиков с телом простейшего. Жгутиконосцы включают большое количество видов, паразитирующих в организме человека, однако патогенными признаны лишь некоторые из них.
Trichomonas vaginalis имеет грушевидное тело 14-30 мкм длиной, удлиненное ядро, смещенное в передний конец и вакуолизированную цитоплазму. На переднем кону имеется 4 жгутика и ундулирующая мембрана, доходящая до середины тела. Сквозь все тело проходит осевая нить - аксостиль, выступающая на заднем конце в виде шипика.
Вызывает трихомоноз (трихомониаз), передающийся половым путем.
В организме человека обитают и другие трихомонады: Т. tenax - комменсал ротовой полости и Т. hominis - комменсал толстой кишки.
Giardia lamblia (Lamblia intestinalis) имеет грушевидное тело 5-15 х 9-21 мкм, толщина 2-4 мкм, существует в виде вегетативной формы - трофозоита, образует цисты.
Трофозоиты имеют 2 ядра, 4 пары жгутиков, расположенных сверху, снизу, сзади и на боковых поверхностях. В верхнепереднем отделе расположен присасывательный диск, окруженный фибриллами, для прикрепления к клеточному эпителию. Пищу всасывают всей поверхностью тела. Размножаются продольным делением. Обитают в верхних отделах тонкой кишки.
Цисты неподвижные овальные, длина 10-14 мкм, имеют 4 ядра и присасывательный диск, выделяются с испражнениями.
Вызывав гиардиоз (лямблиоз), протекающий в виде латентного паразитоносительства, проявляется преимущественно в виде дисфункций кишечника.
Род Leishmania. Все виды этого рода - облигатные внутриклеточные паразиты млекопитающих, у человека некоторые виды вызывают лей- шманиозы. Выделяют 4 группы возбудителей.
Жизненный цикл. Лейшмании проходят две стадии развития: безжгутиковую и жгутиковую. Жгутиковые формы (промастиготы) подвижные, развиваются в теле насекомого-переносчика (москита). Тело веретенообразное длиной 10-20 мкм. Размножаются продольным делением.
Безжгутиковые формы (амастиготы) паразитируют в клетках млекопитающих. Клетки овальные длиной 2-6 мкм. Размножаются простым делением.
Переносчиком заболевания служат москиты родов Phlebotomus и Lutzomyia, которые заражаются при кровососании на больных людях и животных. В первые же сутки заглоченные амастиготы в кишечнике москита превращаются в промаетиготы, размножаются и через 6-8 сут. скапливаются в глотке москита. При укусе человека или животного возбудитель внедряется в клетки кожи или внутренних органов (в зависимости от вида лейшманий), где промаетиготы превращаются в амастиготы.
Род Trypanosoma
Все виды патогенны для млекопитающих, у человека вызывают три- паносомозы, инфекции, весьма напоминающие лейшманиозы. Жизненный цикл возбудителя проходит в организме человека и животных, у которых трипаносомы вызывают тяжелые, часто смертельные заболевания.
Тело трипаносом продолговатое, узкое, имеет жгутики и ундулиру- ющую мембрану. Размножаются исключительно бесполым путем - продольным либо множественным делением (шизогония).
Цикл развития связан с полиморфизмом и переменой хозяев. В кишечнике насекомых-переносчиков трипаносомы существуют в форме э п и - мастигот - вытянутых клеток, у которых жгутик начинается в передней части тела, ундулирующая мембрана не выражена. В крови человека и животных циркулируют трипомастиготы - удлиненные клетки, жгутик которых начинается в задней части, ундулирующая мембрана выражена четко.
Dientamoeba fragilis длительное время считали непатогенной амебой, позднее была установлена его принадлежность к жгутиконосцам. Вызывает диареи. В кишечнике человека присутствует в амебоидной безжгутиковой форме. Наличие цист не установлено, но доказан факт передачи заболевания от человека человеку.
4.4. Инфузории
Из всех видов инфузорий, обитающих в кишечнике человека, безусловно патогенным видом является Balantidium coli, вызывающим балан- тидиаз (инфузорную дизентерию).
Вегетативная форма представляет собой ресничную инфузорию, тело вытянутое, яйцеобразное, 30-100x30-150 мкм. Питается бактериями, грибами и другими пищевыми частицами, для заглатывания которых служит цитостом (клеточный рот), окруженный ресничками. Ядерный аппарат представлен большим и малым ядром.
Цисты округлые с тонкой оболочкой, в окружающей среде могут сохраняться несколько недель. В. coli обитает в кишечнике свиней, для которых малопатогенна. Цисты выделяются с испражнениями. Источник заражения - загрязненные вода и пища.
Больных и носителей не следует рассматривать как источник заражения, так как в организме человека цисты образуются редко, а заражение вегетативными формами практически невозможно.
4.5. Лечение протозойных инфекций
Метаболизм простейших как эукариотических организмов близок к метаболизму высших животных, что уменьшает количество мишеней для фармакологического воздействия, и делает простейших нечувствительными к большинству антибактериальных препаратов. Способность к формированию резистентности у простейших, особенно у малярийных плазмодиев, выражена более чем у бактерий.
Основные препараты для лечения протозойных инфекций приведены в табл.11.
Таблица 11
Препараты для лечения протозойных инфекций
|
Окончание табл. II
|
Глава 5. ОСНОВЫ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ.
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
5.1. Патогенность и вирулентность
Патогенные (pathos —страдание, болезнь) или болезнетворные микроорганизмы способны вызывать заболевания (человека, животных, растений). Патогенными могут быть бактерии, грибы, простейшие, вирусы.
Условно-патогенными называют микроорганизмы, вызывающие заболевания в неблагоприятных для макроорганизма условиях. Для человека такими условиями могут оказаться переохлаждение, радиация, нарушение питания, интоксикация, другое заболевание и т. п.
Патогенность - это потенциальная способность определенных видов микроорганизмов вызывать инфекционные заболевания, видовой генетически детерминированный признак, результат эволюционного приспособления микроорганизма к паразитическому существованию.
Вирулентность - это степень патогенности данного штамма, его индивидуальный признак, изменяющийся под влиянием внешних условий. Вирулентность можно повысить пассажами (последовательным заражением) через восприимчивых животных, или ослабить путем воздействия неблагоприятных для микроорганизма факторов (иммунных сывороток, биоцидов и т. п.). Последнее используют для получения авирулен- тных вакцинных штаммов. Кроме того, вирулентность можно изменить методом генетических рекомбинаций.
5.2. Факторы защиты и агрессии
Патогенность и вирулентность микроорганизма связана с генетически детерминированными особенностями его структуры и метаболизма. Гены вирулентности образуют кластеры (островки патогенности) в хромосомах и плазмидах, способные к горизонтальному переносу. Сходные гены вирулентности обнаруживаются у таксономически далеких видов. Патогенность и вирулентность определяется способностью микроорганизма уклоняться от защитных механизмов своих хозяев и продуцировать вещества, определяющие их инвазивность (способность к распространению в организме) и агрессивные свойства. Все эти особенности носят название факторов вирулентности или факторов защиты и агрессии.
Существуют разнообразные способы избежать действия защитных механизмов хозяина.
• Включение генома некоторых вирусов в хромосому хозяина с последующей вертикальной передачей (наследованием).
• Локализация паразитов (вирусов, возбудителей туберкулеза, лепры, бруцеллеза, лейшманиоза и др.) в клетках иммунной системы (макрофагах, лимфоцитах).
• Синтез иммунодепрессантов, т. е. веществ, подавляющих синтез и активность антител, комплемента, лизоцима, активность иммуно- компетентных клеток.
• Изменение поверхностных антигенов инфекционного агента в сторону сближения с антигенами хозяина (молекулярная мимикрия).
• Антигенная изменчивость паразита на протяжении инфекционного процесса, связанная с генетической рекомбинацией с участием фагов, плазмид, транспозонов, IS-элементов, позволяет микробам ускользать от иммунной системы хозяина.
• Образование устойчивых к внешним воздействиям стадий покоя (споры, цисты).
• Особенности клеточной поверхности, обусловливающие защиту клетки: капсула у патогенных клебсиелл, клостридий, иерсиний, стрептококков, возбудителя сибирской язвы; внешняя мембрана у грамотрицательных бактерий; корд-фактор микобактерий туберкулеза; Fc-рецепторные белки стафилококков и стрептококков и др. Капсула защищает микробные клетки от фагоцитоза, обеспечивает их прикрепление к тканям организма. Липополисахариды внешней мембраны блокируют антитела, обладают свойствами эндотоксинов. Корд-фактор (липид, димиколат трегользы) обеспечивает склеивание клеток, их кислотоустойчивость. Fc-рецепторные белки, неспецифически связывающие иммуноглобулин, защищают клетку от действия специфических антител, подавляют фагоцитоз и иммунный ответ, инактивируют систему комплемента.
• Ворсинки (пили) обеспечивают адгезию клеток и образование микроколоний. Адгезия происходит за счет особых белков или глико- протеинов, названных адгезинами, которые расположены на клеточной поверхности, часто на пилях, и взаимодействуют с эукариоти- ческой клеткой по типу лектинов, осуществляющих углевод-белковое узнавание. Это взаимодействие является лиганд-рецепторным, где роль лиганда выполняет адгезин, а рецептора - соответствующая структура углеводной природы на клетке хозяина. Механизм биологического узнавания лежит в основе специфичности как процесса поражения ткани микробом, так и функционирования защитных сил организма.
• Подвижность является существенным фактором инвазии, она обеспечивает проникновение микроорганизмов в клетки и ткани. Токсины. По локализации различают экзо- и эндотоксины. Экзотоксины синтезируются возбудителями столбняка, ботулизма, анаэробной инфекции, дифтерии, коклюша, холеры, чумы, а также некоторыми видами шигелл, стафилококков, стрептококков, псевдомонад и др. Это протеины, которые вырабатываются клеткой в виде неактивных предшественников, их активация проходит по типу ограниченного проте- олиза под действием ферментов микробной клетки или хозяина. В результате активации токсины приобретают ферментативную активность АДФ- рибозилтрансферазы, которая запускает каскад реакций, ведущих к нарушению синтеза циклического АМФ, а, следовательно, к нарушению регуляции синтеза белка в клетке хозяина. Многие экзотоксины обладают избирательным действием на органы и ткани: дифтерийный токсин повреждает надпочечники и мышцу сердца, столбнячный - двигательные нервные клетки. Экзотоксины действуют на восприимчивый организм в малых дозах, например, в 1 мл дифтерийного токсина содержится 10000 Dim для морской свинки (Dim токсина - его минимальная доза, которая убивает подопытное животное). Некоторые из них термоустойчивы, не разрушаются под влиянием пищеварительных ферментов (ботулинический, стафилококковый). Воздействие формалина, блокирующего аминогруппы активного центра, приводит к потере токсичности, что используется для приготовления вакциных препаратов - анатоксинов.
Эндотоксины прочно связаны с клеткой и могут выделяться в среду только после ее разрушения. Обычно это гликоконъюгаты (липополиса- хариды, гликопротеины, гликолипопротеины) клеточной стенки, чаще - внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Важную роль в токсичности этих веществ играет липид А. Их токсичность проявляется значительно в более высоких концентрациях, чем экзотоксинов. Эндотоксины обладают пирогенным действием, на чем основан метод их определения, например, в инъекционных растворах. Эндотоксины способны активировать систему комплемента, систему свертывания крови, влияют на ферментные системы организма, нарушая углеводный обмен, функции печени и др. Рецепторы эндотоксинов присутствуют на мембранах тромбоцитов, макрофагов, лимфоцитов, эндотелия капилляров. Действие эндотоксинов зависит от их концентрации: в малых дозах они способны активировать фагоцитоз и другие защитные реакции организма, с чем связано применение некоторых из них в качестве иммуномодуляторов (пи- рогенал).
Ферменты патогенности катализируют реакции, ведущие к образованию токсичных продуктов или разрушение клеток и тканей организма.
Лецитиназа С (фосфолипаза). Clostridium perfringens гидролизу- ет лецитин (фосфолипид) клеточных мембран, повреждая эритроциты, и другие клетки, вызывая некроз тканей.
Нейраминидаза холерного вибриона, возбудителей анаэробной инфекции, стрептококков, вируса гриппа и др. гидролизует соединения, содержащие сиаловые кислоты. Эти вещества обусловливают вязкость органических жидкостей, участвуют в агрегации клеток, процессах биологического узнавания, внутриклеточного транспорта и др., поэтому действие нейраминидазы может привести к нарушению разнообразных функций организма.
Фибринолизин и гиалуронидаза у стрептококков и других микроорганизмов являются факторами распространения, облегчая микробным клеткам проникновение в ткани организма. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту - сложный мукополисахарид, придающий вязкость межклеточному веществу. Поэтому фермент может быть использован для совместного введения с лекарственными препаратами для ускорения их проникновения в ткани, для ликвидации рубцов и т. п.
Гемолизины и лейкоцидины стафилококков и стрептококков разрушают эритроциты и лейкоциты.
Плазмокоагулаза стафилококков и других микроорганизмов - пептидаза, активирующая систему свертывания крови путем каталитического превращения протромбина в тромбин, обеспечивает создание защитного фибринового чехла вокруг микробных клеток.
Уреаза пневмококков, клебсиелл, иерсиний гидролизует амиды с образованием токсичного иона аммония.
Декарбоксилазы возбудителей анаэробной инфекции и других микроорганизмов катализируют реакции с образованием токсичных аминов.
5.3. Инфекционные болезни
Инфекционные болезни - это группа заболеваний, вызываемых патогенными микроорганизмами - вирусами, бактериями, простейшими. Общим признаком для большинства инфекционных болезней является возможность передачи возбудителя от больного здоровому и возможность их массового (эпидемического) распространения. В результате взаимодействия с возбудителем в организме развивается совокупность физиологических (адаптационных) и патологических процессов, сопровождающихся нарушением гомеостаза. Симбиотические взаимоотношения, наносящие хозяину вред, называют антагонистическим симбиозом, крайним проявлением которого является паразитизм. Облигатными внутриклеточными паразитами являются вирусы, риккетсии и хламидии.
Источником инфекции является среда, в которой возбудитель заболевания может обитать и размножаться в естественных условиях. Заболевания, основным источником возбудителя которого является человек, называются антропонозами; заболевания, передающиеся от животных - зоонозами. Сапронозы - заболевания, вызванные микроорганизмами, обитающими в воде, почве и других объектах внешней среды. Возможны случаи заражения из разных источников (от человека или животного и от зараженных объектов внешней среды, благоприятных для размножения возбудителя). Так почва может служить источником возбудителей саль- монеллезов, дизентерии, сибирской язвы, столбняка, анаэробной инфекции; вода - кишечных инфекций, туляремии, гепатита А; пищевые продукты - кишечных инфекций, туберкулеза, бруцеллеза, скарлатины, дифтерии, пищевых токсикоинфекций.
Пути проникновения инфекционного агента в организм определяются его природой. Возбудители кишечных инфекций проникают через рот с водой и пищей; респираторных - через дыхательные пути; через кровь (укусы насекомых, загрязненные инструменты, инъекционные растворы) передаются малярия, риккетсиозы, энцефалит, СПИД, гепатит В и др.; через кожу и слизистые оболочки - дерматомикозы, венерические болезни. Возбудители чумы, сибирской язвы, туберкулеза, дифтерии, скарлатины способны проникать в организм любым из перечисленных путей. Некоторые заболевания способны передаваться от матери плоду, т. е. вертикально. Передача возбудителя (сифилиса, гонореи, брюшного и возвратного тифа, токсоплазмоза, стафилококков и др.) может осуществляться через плаценту или при прохождении через родовые пути.
Эпидемиология инфекционных заболеваний. Инфекционные заболевания могут распространяться вертикально (от одного поколения к другому) и горизонтально (среди неродственных членов популяции). В случае горизонтальной передачи инфекционного агента заражение может происходить из какого-то общего источника (вода, пищевые продукты) или от человека к человеку, когда каждый индивидуум служит источником инфекции для других. При заражении из общего источника наблюдается резкий скачок заболеваемости, сходные инкубационный период и течение инфекционной болезни у всех больных. При передаче инфекционного агента от больного здоровому происходит постепенное нарастание числа заболевших, а инкубационный период и течение болезни зависят от индивидуальной чувствительности индивидуума.
Факторы, определяющие возникновение эпидемии, это:
a) инфекционность возбудителя (способность к быстрому распространению и преодолению защитных сил организма);
b) плотность популяции в данном регионе;
c) число чувствительных индивидуумов в данной популяции.
Изменение хотя бы одного из этих факторов влияет на возможность
возникновения эпидемии. Например, эпидемические вспышки кори, ветряной оспы в начале осени среди детей, возвращающихся в школу после каникул, связаны с концентрацией чувствительных индивидуумов в одном месте. Возможность возникновения эпидемии снижают или предотвращают профилактические прививки (снижение числа людей, чувствительных к данному заболеванию).
Глава 11. ДЕЗИНФЕКТАНТЫ, АНТИСЕПТИКИ И КОНСЕРВАНТЫ
Дезинфектанты, антисептики и консерванты - это химические вещества, которые способны убивать микробные клетки или угнетать их рост.
Дезинфектанты используются для обработки помещений, изделий или материалов.
Антисептики применяют для обработки кожи и слизистых оболочек человека, поэтому они не должны быть токсичными в используемых концентрациях.
Консерванты включают в состав фармацевтических препаратов, чтобы предупредить их микробную деградацию и поддерживать количество содержащихся в них микроорганизмов на низком и безопасном уровне. Эффективная концентрация консерванта в готовом лекарственном средстве должна быть значительно ниже токсичной для человека дозы.
11.1. Факторы, определяющие выбор антимикробного агента
Свойства химического вещества. Эффективность действия биоцида определяется его химической природой, концентрацией, температурой, рН и продолжительностью контакта с зараженным объектом. Если вещество используется как антисептик, следует учитывать его токсичность.
Характер микробиоты определяет эффективность действия химического агента. Имеет значение чувствительность микроорганизма к данному веществу и уровень микробной контаминации. На практике не всегда возможно определить, какие микроорганизмы присутствуют в дезинфицируемом объекте, поэтому эффективность действия антимикробного агента оценивают в отношении наиболее устойчивых видов (табл. 15).
Влияние факторов окружающей среды. Органические вещества (кровь, гной, молоко, остатки пищи и т. п.) резко снижают эффективность биоцидных агентов путем их адсорбции, инактивации, или препятствуя их проникновению в микробные клетки. Поэтому по мере возможности перед дезинфекцией оборудование, посуда, инструменты должны быть тщательно вымыты. Многие материалы (ткани, резина и другие полимерные материалы) могут адсорбировать биоциды, снижая их концентрацию. Активность биоцидов требует присутствия воды, обеспечивающей их проникновение в клетку, и зависит от содержания в ней ионов.
Таблица 15 Антибактериальная активность некоторых химических веществ (35)
|
11.2. Применение биоцидов
Биоцидные агенты широко применяются в качестве дезинфектан- тов. Они обладают в той или иной мере токсическими свойствами, поэтому работа с ними требует строгого соблюдения правил техники безопасности и мер предосторожности (табл. 16).
Химические вещества, используемые как антисептики, оказывают бактериостатическое или бактерицидное действие, которое проявляется достаточно быстро; при правильном применении они не оказывают вредного воздействия на организм человека. В медицинской практике они используются для обработки кожи, инфицированных ран, местно для профилактики и лечения некоторых инфекционных заболеваний. В фармацевтическом производстве антисептики применяются для гигиенической обработки рук.
Таблица 16
Особенности некоторых дезинфектантов и антисептиков
Биоцид | Влияние на активность органических веществ | Оптимум рН | Условия применения* | Другие особенности |
Этанол | слабое | 1900 мг/м3 -8ч | Избегать попадания в глаза; плохая проникающая способность: горючий | |
Изопропа- нол | слабое | — | 1225 мг/м3 - 10 мин 980 мг/м3 -8ч | - |
Глутаро- вый альдегид | слабое | 0,7 мг/м3 - 10 мин | Опасен для глаз, кожи, органов дыхания. Не обладает коррозирующей активностью. Применение в вентилируемом помещении, использовать средства индивидуальной защиты | |
Формальдегид | умеренное | — | 0,7 мг/м3 < 10 мин | Опасен для органов дыхания |
Хлоргек- сидин | сильное | 7^8 | Опасен для глаз, слизистых оболочек. Не совместим с анионными детергентами | |
Гипохло- рит | сильное | <7 | 3 мг/м3 - 10 мин 1,5 мг/м3 -8ч | Опасен для глаз, кожи. Корродирует металлы |
Водорода пероксид | слабое или умеренное | <7 | 3 мг/м3 - 10 мин 1,5 мг/м3 -8ч | Раздражает кожу, слизистые. Может вызвать повышение давления в контейнере |
Препараты иода | сильное | <7,0 | 1 мг/м3 < 10 мин | Вызывает раздражение глаз; коррозию металлов |
Окончание табл. 16
|
Примечание: * — предельно допустимые значения концентрации биоцида в воздухе и времени пребывания человека в рабочей зоне. |
Консерванты вводят в состав как стерильных, так и нестерильных лекарственных средств (табл. 17) для предотвращения роста микроорганизмов, попадающих в них во время технологического процесса, или при неоднократном употреблении. Они не должны использоваться, чтобы замаскировать низкое качество производства. Учитывая возможность побочного действия, консерванты следует применять только при строгой необходимости. Требования к консервантам:
• широкий спектр антимикробной активности;
• быстрота биоцидного действия;
• отсутствие взаимодействия с компонентами лекарственного средства;
в стабильность;
• отсутствие раздражающего или токсического действия биоцида или продуктов его распада.
Однако немногие вещества отвечают этим идеальным требованиям. При использовании консерванта следует учитывать ряд факторов, влияющих на эффективность его действия: микробная нагрузка, температура, рН, состав лекарственного средства.
В мультифазной системе консервант распределяется неравномерно в соответствии с его гидрофильной или гидрофобной природой. Консервант может адсорбироваться на материале первичной упаковки, что снижает его активность. Концентрация летучих веществ (хлороформа) может снижаться при повторном открывании контейнера.
Таблица 17
|
Консерванты лекарственных средств |
Примечание: * - органические соединения ртути могут обладать нейротокси- ческим действием, вызывать кератопатию, поэтому их не рекомендуют для длительного применения. В производстве вакцин в настоящее время мертиолат заменяют феноксиэтанолом или другими альтернативными соединениями.
Применение биоцидов в комбинациях. Поскольку не существует идеального биоцида, сочетающего широкий спектр антимикробной активности, низкую токсичность, отсутствие корродирующего действия, стабильность, совместимость с другими веществами, улучшить их свойства удается путем сочетанного применения. Например, используют комбинации спиртов с хлоргексидином, ЧАС, гипохлоритом и препаратами иода.
ЧАС и фенолы используют в сочетании с альдегидами, что позволяет снизить концентрацию последних и их раздражающее действие. Для некоторых соединений, например, пероксидов, отмечен синергидный эффект при их совместном применении. Введение (инкорпорация) биоцид- ных агентов (соединения серебра, бигуаниды, триклозан) в материалы медицинского назначения и синтетические трансплантанты позволяет предупредить образование на них микробных пленок. Полезно совместное применение физических и химических биоцидов (ультразвуковая обработка в сочетании с альдегидами и бигуанидами, ультрафиолетовое облучение - с водорода пероксидом). Разработана новая технология получения моющих и дезинфицирующих средств, основанная на электрохимической активации разбавленных водных растворов натрия хлорида, приводящей к образованию свободных радикалов, обладающих высокой биоцидной активностью (НСЮ, С1СГ, С102, СЮ", С1-, НО,, но-, Н202, 03,02% О').
11.3. Оценка эффективностидезинфектантов, антисептиков и консервантов
11.3.1. Динамика дезинфекции
Процесс гибели микробных клеток, помещенных в среду с антимикробным агентом, может быть изображен графически (рис. 10).
При этом возможна ситуация, когда процесс гибели будет подчиняться законам кинетики первого порядка (А) и эффективность дезинфекции можно оценить, используя константу:
и- 1 1 N ^ = - log —,
t N о
где: К - константа скорости гибели клеток; N0 - начальное число живых клеток; N - число живых клеток в момент времени t.
Однако чаще наблюдаются случаи, когда график представляет сиг- моидную кривую (В), отражающую гибель наименее устойчивой части популяции в начальный период, гибель основной части популяции, обла-
Рис. 10. Динамика гибели микробных клеток в среде с дезинфектантом |
дающей средним уровнем резистентности, в средний период и сохранение наиболее устойчивых клеток в конечной стадии эксперимента.
При высокой концентрации дезинфектанта происходит быстрая гибель основной части популяции в начальный период времени (С).
Генетическая неоднородность бактериальной популяции не позволяет использовать законы кинетики первого порядка для оценки эффективности дезинфектантов, однако методы, основанные на определении количества живых клеток или времени гибели популяции, дают вполне адекватные результаты. При этом необходимо учитывать влияние факторов внешней среды (температуры, рН, состава среды), а также микробную нагрузку (количество микробных клеток в определенном объеме).
11.3.2. Методы испытания антимикробной активности
Метод оценки биоцида определяется задачей конкретного исследования (табл. 18).
Качественный суспензионный тест. Взвесь микроорганизма вносят в раствор антисептика. После определенной экспозиции (2-60 мин) пробу (0,1 мл) вносят в пробирку с нейтрализатором и делают высев для определения жизнеспособности тест-культуры.
Количественный суспензионный тест. После экспозиции тест- культуры с антисептиком и нейтрализации делают количественный высев с подсчетом выросших колоний. Микробиоцидную активность (МА) определяют по формуле:
МА = log Nc - log Nd ,
Классификация методов оценки биоцидов (36) |
где: Nc - число колоний, выросших при посеве контрольной взвеси; N -то же из взвеси с биоцидом.
Таблица 18
|
Определение влияния бионагрузки. Метод позволяет определить способность дезинфектанта сохранять активность в присутствии увеличивающейся микробной нагрузки. В раствор дезинфектанта добавляют определенное количество микробной взвеси. После заданной экспозиции делают количественный высев и определяют число выросших колоний. Через 10 минут, например, в этот же дезинфектант вносят новую дозу
микроорганизма и после экспозиции определяют число выживших клеток. Затем операцию повторяют еще через 10 минут. Этот метод воспроизводит практическую ситуацию, например, можно определить, как долго раствор сохраняет активность, когда в него последовательно погружают инфицированные инструменты.
Тест с культурой на носителе (фильтровальная бумага, ткань и др.) позволяет оценить эффективность биоцида при дезинфекции поверхностей, материалов и т. п. Стандартные образцы носителя помещают в микробную суспензию, высушивают, затем вносят в раствор биоцида, выдерживают (10 мин), далее помещают в нейтрализатор, затем в питательный бульон и определяют жизнеспособность клеток.
Тест с условиями, приближенными к практическому применению ставят на людях-добровольцах. На кожу кисти рук наносят взвесь Е. coli, подсушивают 3 мин на воздухе и протирают руки испытуемым раствором антисептика. Далее делают смыв с рук жидкой питательной средой и проводят количественное определение жизнеспособных клеток. Ананлогично микробную взвесь наносят на поверхность оборудования, стен и пола помещения и т. п. с последующей обработкой биоцидом.
Определение антимикробной активности антисептиков в мягких и твердых формах проводят на плотной питательной среде, засеянной тест-культурой. Образцы размещают на поверхности среды или в лунках, подобно тому, как это делают при испытании антибиотиков чашечным методом. Об активности препарата судят по диаметру зоны задержки роста вокруг образца в сравнении со стандартным препаратом.
Кроме микробиологических методов существуют многочисленные биохимические и физико-химические методы определения жизнеспособности микроорганизмов: определение активности ферментов, методы микрокалориметрии, проточной флуориметрии, флуориметрии. Однако эти методы не стандартизованы.
11.3.3. Определение эффективности консервантов
лекарственных средств
Метод испытания включает искусственное заражение лекарственного средства суспензиями определенных тест-микроорганизмов, инкубацию контаминированных образцов при определенной температуре, отбор проб через определенные интервалы времени и подсчет жизнеспособных клеток микроорганизмов в 1 г (мл) лекарственного средства (ЛС).
В качестве тест-микроорганизмов используют виды бактерий и грибов, которые являются наиболее частыми контаминантами J1C: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger. Концентрацию микробной взвеси для заражения образцов выбирают в зависимости от категории JIC: для водорастворимых JIC МО8 КОЕ/мл; для ЛС, нерастворимых в воде 1-Ю6 КОЕ/мл,
При заражении ЛС, приготовленных на твердой мазевой основе их нагревают до 45-50 °С, при необходимости добавляют поверхностно-ак- тивное вещество и тщательно перемешивают. Контаминированные образцы выдерживают при температуре 20-25 °С в защищенном от света месте. Через 7,14 и 28 сут после инокуляции определяют количество жизнеспособных клеток чашечным методом путем количественного посева на соответствующую питательную среду.
Консервант признают эффективным, если через 7 сут число КОЕ в водорастворимом ЛС уменьшается в 10 раз, через 14 сут - не менее, чем в 1000 раз, а в период с 14 по 28 сут не происходит увеличения числа бактерий. Для ЛС, нерастворимых в воде, число КОЕ через 14 сут должно уменьшиться не менее чем в 100 раз. Для всех категорий препаратов не должно быть увеличения числа грибов при всех экспозициях.
11.4. Механизмдействия дезиифектантов и антисептиков
Действие антисептиков на микробную клетку неспецифично, т. е. их мишень может находиться и в клетках млекопитающих. Мишени действия антисептиков разнообразны и присутствуют в клеточной стенке, мембранах и цитоплазме.
В низких концентрациях антисептики вызывают лизис микробных клеток, возможно, воздействуя на ферменты, принимающие участие в синтезе клеточной стенки, таким образом, что они изменяют свои функции, дезинтегрируя ее. Лизис клеточных стенок Е. coli, стафилококков и стрептококков наблюдали в присутствии следующих веществ (указаны концентрации в %): формалин 0,12, фенол 0,32, ртути хлорид 0,0008, натрия гипохлорит 0,005, мертиолат 0,0004. Глутаровый альдегид нарушает структуру клеточной стенки грамположительных бактерий, вызывая необратимое образование в ней перекрестных связей.
Воздействие на цитоплазматическую мембрану сопровождается нарушением мембранного потенциала, ферментов мембраны и ее проницаемости. Нарушение мембранного потенциала приводит к разобщению транспорта электронов и фосфорилирования, препятствует переносу протонов через мембрану, т. е. к прекращению энергетических процессов, направленных к синтезу АТФ.
Ингибирование ферментов, ассоциированных с мембраной, приводит к нарушению многих процессов метаболизма. Гексахлорофен угнетает активность ферментов цепи переноса электронов, подавляя метаболическую активность аэробных бактерий. Хлоргексидин ингибирует мембранную АТФазу, воздействуя таким образом на анаэробные процессы. Антисептики, содержащие ртуть, бронопол и др. ингибируют ферменты, содержащие тиоловые группы (-SH). В присутствии избытка соединений, содержащих тиогруппы (цистеин, тиогликолаты), такие антисептики утрачивают активность.
Многие антисептики (ЧАС, фенол, гексилрезорцин и др.) нарушают проницаемость мембраны, что сопровождается утечкой цитоплазматичес- кого содержимого. Клетка теряет калий, пурины, пиримидины сахара и другие метаболиты. Если действие антисептика кратковременно, наблюдается лишь бактериостатический эффект.
Цитоплазма представляет собою сложную многокомпонентную систему молекул и субклеточных частиц, каждая из которых может в той или иной степени подвергаться воздействию антисептиков. Высокие концентрации биоцидов, например, хлоргексидина, фенола, солей ртути вызывают общую коагуляцию цитоплазмы. В присутствии водорода перок- сида и n-хлормеркурбензоата происходит диссоциация рибосом на субчастицы. Акридиновые красители способны встраиваться в структуру ДНК, нарушая тем самым ее функции. Многие антисептики взаимодействуют с тиоловыми группами белков, например, галогены могут их окислять. Формальдегид, глутаровый альдегид и серы диоксид реагируют с аминогруппами. Высокореактивные агенты воздействуют на многие клеточные системы. Например, Р-пропиолактон алкилирует амино-, имино-, гид- роксильные и карбоксильные группы, взаимодействует с тио- и дисуль- фидными группами, нарушая структуру белков и других макромолекул. Подобной активностью обладает и этилена оксид. Высокой реактогенно- стью обладают также серы диоксид, сульфиты и бисульфиты.
В табл. 19 приведены данные о клеточных мишенях, подвергающихся воздействию различных антисептиков.
Антисептики | шифч^з tmoMonir 1яс!ээ | Примечание: + Антисептик действует в низких концентрациях; +4 + Антисептик действует в высоких концентрациях. | |||||||||
Sy шюз | + | + | + | ||||||||
OVh | + | + | |||||||||
HoJ-Muiroiiuodu -Ewg | + | + | + | ||||||||
Н1ГОНЭф | + | + | + | + + + | |||||||
nxXid ВИНЭНИСЭОЭ | -f | + | t 4- | + | + | ||||||
1ГОИ | -f | + | |||||||||
nxudoirxouHj | + | + | + | + | |||||||
zOzU | + | + | + | ||||||||
H3cj)0d0IfXEDM3J | + | + | + | ||||||||
Hnaodcj-Airj | + | + | t | + | + | ||||||
muatrqirmsdoo | + | i | |||||||||
ГГИЭМ0 GH3L'H1£ | + + | + | + | + | |||||||
++n э Hi/03 | + | + + | + | ||||||||
HnUHDHSidoiTx | + | + + + | |||||||||
irouoHodg | + | + | + | ||||||||
гсггшшну | + | + | |||||||||
mdiiiQ | + | ||||||||||
HirSlHOL'd-M 3H30HHlTHdMy | + | ||||||||||
5 2 | s к 2 ? о 5 | Мембранный потенциал | Ферменты мембран: цепь переноса электронов | АТФаза ферменты с , тиотруппами 1 | Проницаемость мембраны | Коагуляция | цитоплазмы | Рибосомы | Нуклеиновые кислоты | Тиогруппы | Аминогруппы |
11.5.Резистентность микроорганизмовк антисептикам
и дезинфектантаим
Микроорганизмы существенно различаются по своей резистентности к действию биоцидов (табл. 20).
Таблица 20
Чувствительность микроорганизмов к хлоргексидину
|
По уровню устойчивости к биоцидам патогены распределяются следующим образом (в убывающем порядке):
• прионы;
• кокцидии;
• споры прокариот;
• микобактерии;
• цисты простейших;
• малые безободочечные вирусы (пикорнавирусы, парвовирусы; некоторые ротавирусы);
• трофозоиты простейших, большие безободочечные вирусы (энтеро- вирусы);
• грамотрищтельные бактерии, грибы (грибы могут быть более устойчивыми);
• грамположительные неспорообразующие бактерии, оболочечные вирусы (ВЙЧ).
Естественная резистентность связана с природными особенностями строения микробной клетки и ее метаболизма: наличием защитных покровов, образованием биопленок, способностью к ферментативной деградации или активному выбросу ксенобиотиков из клетки. Микробной деградации подвергаются все виды ПАВ и другие дезинфектанты в концентрации, ниже действующей, а иногда и в рабочей концентрации, например, бензалкониум хлорид, как и другие ПАВ, P. aeruginosa использует в качестве источника углерода. Этот микроорганизм наиболее часто обнаруживается в растворах дезинфектантов наряду с представителями других родов (табл. 21).
Таблица 21
Микроорганизмы, наиболее часто обнаруживаемые в дезинфектантах
|
Проницаемость клеточной стенки грамотрицательных бактерий во многом определяется наличием внешней мембраны, защищающей клетку от проникновения химических веществ. Активность биоцида повышается в присутствии веществ, увеличивающих ее проницаемость (ЭДТА, натрия гексаметафосфат, лимонная кислота и др.). Поверхностно-активные вещества, особенно ЧАС, разрушают липополисахаридный слой внешней мембраны. Возможной причиной высокой устойчивости P. aeruginosa может быть повышенное содержание фосфатных групп в ли- пиде А, характерное для этого микроорганизма. Кроме того, у P. aeruginosa имеется система активного выброса ксенобиотиков, эффективная в отношении многих антимикробных агентов.
Важной особенностью грамотрицательных бактерий, определяющей их устойчивость к биоцидам, является способность к адгезии на поверхностях с образованием биопленок, представляющих организованное сообщество клеток, объединенных массой экзополисахарида (гликокаликс). Верхние слои гликокаликса защищают внутреннюю часть от проникновения биоцида. Клетки, обитающие внутри биопленки, ограничены в доступе питательных веществ и растут медленно, что способствует повышению их резистентности к неблагоприятным условиям.
Образование биопленки - одно из проявлений чувства кворума у бактерий. В биопленке устойчивость микроорганизмов к биоцидным агентам в сотни раз выше, чем у клеток, растущих в виде планктона. Биопленка может состоять из разных видов микроорганизмов, каждый из которых продуцирует полимер особой структуры, таким образом, гликокаликс имеет гетерогенный состав. На его поверхности располагаются внеклеточные ферменты, которые принимают участие в метаболизме, в том числе могут разрушать биоциды, присутствующие в среде. В биопленке происходит отбор устойчивых вариантов микроорганизмов. Устойчивость к биоцидам была обнаружена у растущих в виде биопленок Pseudomonas spp., Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus faecalis, Legionella pneumophila, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica и др.. Биопленки могут образовываться в системе водоснабжения, а также на имплантированных искусственных органах (суставах, сосудах, клапанах сердца), являясь, таким образом, источником инфекции.
Испытание действия биоцида с использованием микробной взвеси не дает возможности оценить его активность в отношении клеток, растущих в виде биопленки. Требуется специальная методика, предусматривающая стандартизацию объекта (вид микроорганизма, возраст биопленки и т. п.).
Грамположительные бактерии, как правило, более чувствительны к биоцидам, хотя и в этой группе появляются резистентные штаммы. Например, устойчивость Staphylococcus aureus к фенолам и ЧАС зависит от присутствия на поверхности клеток липидов, которые защищают микроорганизм от проникновения биоцидов.
Споры выдерживают концентрации биоцидов, в несколько тысяч раз превышающие концентрации, эффективные в отношении вегетативных клеток. Соединения ртути, ЧАС, хлоргексидин, фенолы и спирты практически не обладают спороцидной активностью, хотя MoiyT задерживать прорастание спор. Этилена оксид, b-пропиолактон, формальдегид, глутаровый альдегид, водорода пероксид и галогены убивают споры, однако их действие достаточно медленное, процесс стерилизации должен продолжаться от 30 мин до нескольких часов. Резистентность спор обеспечивает их уникальная клеточная оболочка, которая препятствует проникновению биоцидов внутрь клетки и, возможно, нейтрализует действие некоторых из них. Споры разных микроорганизмов различаются по своей чувствительности к стерилизующим агентам. Помимо генотипи- ческой вариабельности существует и фенотипическая зависимость резистентности спор от условий выращивания микроорганизма.
Микобактерий высокорезистентны к действию дезинфектантов (наиболее эффективны фенолы); при возможности для их уничтожения следует применять тепловую обработку. Защитными свойствами обладает клеточная стенка микобактерий, содержащая большое количество вос- коподобных липидов, образующих гидрофобные слои. Существенную роль в составе липидов играют миколовые кислоты. Клеточная стенка обеспечивает кислотоустойчивость этих микроорганизмов, которая служит основой их дифференциального окрашивания путем обработки карболовым фуксином при нагревании. При комнатной температуре процесс требует 18-часовой экспозиции. Окрашенные клетки устойчивы к обесцвечиванию спиртом и разбавленными кислотами, с чем и связано происхождение термина «кислотоустойчивость».
Резистентность вирусов к биоцидам зависит от их количества (бионагрузки), структуры капсида, числа и доступности мишеней. Наблюдается широкая вариабельность резистентности даже внутри одного семейства и клона. Не все вирусные частицы являются инфекционными, что влияет на результат испытания путем заражения культуры ткани. Большое значение имеют факторы внешней среды. Например, вирусы способны к адгезии на поверхности частиц и материалов, микротрещины и загрязнения на поверхности оборудования могут служить им укрытием от действия биоцида. Поэтому важна тщательная очистка перед дезинфекцией, особенно для медицинского оборудования. Основные механизмы резистентности:
• способность вирионов к агрегации;
• модификация мишени (протеина), причем может иметь значение изменение конформации молекулы;
• реактивация за счет рекомбинации вирусной нуклеиновой кислоты и элементов капсида с образованием инфекционной частицы, титр вируса при этом возрастает.
Остаточные концентрации биоцида в среде могут быть причиной перестройки популяции вируса с образованием резистентных форм. Поэтому важно полностью обезвредить объект, не оставляя неповрежденных молекул нуклеиновой кислоты, учитывая, что заражающая доза некоторых вирусов очень мала.
Приобретенная резистентность появляется в результате изменений в генетическом аппарате бактерий, в результате отбора устойчивых мутантов в среде, содержащей биоциды. Большое значение в распространении генов резистентности имеет их горизонтальный транспорт между различными видами и родами бактерий с помощью трансмиссивных плаз- мид и конъюгативных транспозонов. Плазмиды могут определять множественную резистентность к биоцидам. У Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa описаны плазмиды, обеспечивающие устойчивость к соединениям ртути. Плазмиды узкого спектра контролируют образование редуктазы, переводящей Hg"14" в металлическую ртуть. Плазмиды широкого спектра помимо редуктазы кодируют одну или несколько гидролаз, которые освобождают Hg++ из ртутьорганических соединений, разрывая связь ртуть - углерод. Образующаяся металлическая ртуть испаряется из среды. Существование таких процессов трансформации ртутьорганических соединений делает проблематичным их использование в качестве консервантов в фармацевтике. Устойчивость к соединениям серебра обеспечивается механизмом выброса ксенобиотика. Ген резистентности обычно находится в плазмиде, однако описана и его хромосомная локализация. Возможны мутации, обусловливающие модификацию мишени или изменение проницаемости клеточной оболочки.
Широкий круг хозяев у генов резистентности способствует их сохранению в природе, причем такие гены могут стабильно существовать даже в отсутствие селективного давления, т.е. в среде, не содержащей биоцидов. Селективные условия создаются в растворах дезинфектантов с концентрацией, ниже рекомендуемой, и при нарушении сроков их хранения. Например, в растворах хлорсодержащих веществ часто обнаруживается снижение содержания активного хлора.
Помимо концентрации биоцида для развития резистентности популяции имеет значение состав среды (наличие защитных агентов, факторов роста), фаза развития и скорость размножения клеток. Например, Pseudomonas aeruginosa, выращенная на среде с недостаточным количеством магния, высокоустойчива к бензалкониума хлориду, тогда как выращенная на среде с недостатком углерода - высокочувствительна. Большое значение имеет температура и время культивирования. Медленнорастущие клетки менее чувствительны к биоцидам, чем быстрорастущие. Поэтому необходимо строго соблюдать стандартные условия испытания активности антимикробных агентов.
Возможность быстрого развития резистентности в популяции следует учитывать на практике при применении биоцидов для дезинфекции.
При продолжительном использовании какого-либо антимикробного агента микробиота, обитающая в данном объекте (госпиталь, аптека, цех, лаборатория, находящиеся там предметы, стены и пол помещений и т. д.), может приобрести высокую устойчивость к этому препарату. Для эффективного проведения всех мероприятий, обеспечивающих асептичные условия работы, осуществляют ротацию биоцидов, т. е. используют несколько химических веществ, применяя их в определенном порядке.
Глава 12. ОСНОВЫ ИММУНИТЕТА
Иммунитет - это состояние повышенной устойчивости организма к живым телам и веществам, несущим признаки генетической чужерод- ности. Эти чужеродные субстанции называются антигенами. Антигенами могут быть микроорганизмы, чужеродные клетки, ткани и продукты их жизнедеятельности. Реагирование против чужеродных субстанций осуществляет иммунная система организма, которая обеспечивает приобретенный (адаптивный) иммунитет. Помимо иммунной системы существуют факторы неспецифической защиты (факторы врожденного иммунитета) действие которых не зависит от антигенных особенностей чужеродного агента. Системы врожденного и приобретенного иммунитета действуют как единый функциональный комплекс, элементы которого находятся в постоянной взаимосвязи.
12.1. Врожденный иммунитет
Врожденный (естественный, наследственный) иммунитет - это форма защиты, которая определяется наличием неспецифических факторов, направленных против микроорганизмов вне зависимости от их антигенного состава. Барьерные функции выполняют кожа, слизистые оболочки, биопленка нормальной микробиоты, которые препятствуют проникновению микробов внутрь организма и его распространению. Химические факторы - кислая среда желудка, желчь кишечника, жирные кислоты пота и отделяемого сальных желез, лизоцим (мурамидаза), содержащийся в слюне, слезах и отделяемом слизистых оболочек, антимикробные вещества, продуцируемые лимфоцитами и клетками печени, интерферон и др. губительно воздействуют на микроорганизмы. Сальные и потовые железы, мерцательный эпителий, слизь, слюна, выделительные системы организма обеспечивают удаление патогенов и их токсинов.
Комплекс воспалительных реакций подавляет развитие патогена и препятствует его распространению из очага воспаления.
Антимикробной активностью обладают катионные пептиды - де- фенсины, кателицидины и др., которые образуются в эпителии барьерных тканей и в лейцоцитах.
Система комплемента принимает участие в реакциях неспецифической защиты и в реакциях иммунного ответа. Это комплекс растворимых белков плазмы крови и белков клеточной поверхности, взаимодействие которых опосредует различные биологические эффекты: лизис клеток, хемотаксис и опсонизацию при фагоцитозе, стимуляцию воспаления и реакций гиперчувствительности. Большая часть этих белков синтезируется гепатоцитами и макрофагами. Они циркулируют в крови в неактивной форме, а при определенных условиях активируются путем каскада ферментативных реакций. Классический путь активации начинается со связывания компонента комплемента С1 комплексом антиген - антитело, далее активируются другие компоненты, в результате чего образуется ли- тический комплекс.
Альтернативный путь начинается с фракции СЗв и включает каскад реакций с участием пропердина. При этом образуется комплекс белков, который связывается с гликоконъюгатами поверхности микробных клеток, в результате чего происходит их лизис в отсутствие антител. Многие микроорганизмы способны защищать себя от действия комплемента: они имеют поверхностные структуры, устойчивые к лизису или способные подавлять систему комплемента, например, сиаловые кислоты стрептококков, нейссерий, трепонем.
Мощным неспецифическим фактором защиты организма является система пропердина. Это белки плазмы крови, содержащие отдельные компоненты комплемента и ионы магния, которые способны обезвреживать многие бактерии и вирусы.
Цитокины - группа различных протеинов, которые высвобождаются клетками млекопитающих и действуют на другие клетки через специфические рецепторы. Ответная реакция клетки-мишени зависит от ее природы и природы цитокина: пролиферация и дифференциация клеток, воспаление, гемопоэз. Цитокины передают сигналы между различными популяциями лимфоцитов и участвуют в регуляции иммунного ответа. К цитокинам относятся также фактор роста, колониестимулирующий фактор, интерфероны, фактор некроза опухоли.
Интерфероны (ИФН) - группа видоспецифических белков и гли- копротеинов, синтезируемых клетками организма в ответ на воздействие интерфероногенов - вирусов, бактерий, их структурных элементов, синтетических полирибонуклеотидов и других веществ, которые вызывают дерепрессию генов, кодирующих ИФН.
ИФН как и другие цитокины в организме выполняют контрольно- регуляторные функции, направленные на сохранение клеточного гомеос- таза, важнейшие из них - антивирусная, противоопухолевая, иммуномо- дулирующая и радиопротекторная. ИФН угнетают размножение вирусов, стимулируя образование в клетке комплекса белков, блокирующих трансляцию вирусной иРНК. Противоопухолевая защита зависит от способности ИФН активировать цитотоксические лимфоциты, макрофаги и естественные киллеры. Кроме того, они активируют интерфероногенез (прай- минг) и образование антител.
Фагоцитоз - наиболее древняя по происхождению форма защиты. Она выражается в явлении захватывания и переваривания фагоцитами посторонних частиц, в том числе бактерий и разрушенных клеток. Это явление открыто русским ученым И.И. Мечниковым. Все фагоцитирующие клетки не окрашены, поэтому их называют лейкоцитами или, в отличие от эритроцитов, белыми клетками крови, они различаются по своим функциям:
нейтрофшы - адгезия к эпителию, выход за пределы кровотока,
синтез микробоцидных факторов; эозинофшы - синтез биоцидных факторов, направленных против
простейших и гельминтов; моноциты - адгезия к эпителию, выход за пределы кровотока,
синтез биоцидных факторов и цитокинов; макрофаги - адгезия к эпителию, выход за пределы кровотока, синтез биоцидных факторов, компонентов комплемента, активаторов протеаз, участие в иммунных реакциях.
Процесс фагоцитоза начинается со стадии узнавания и адгезии посторонней частицы (например, микробной клетки) на мембране фагоцита. Далее микроб оказывается заключенным внутри вакуоли (фагосомы), которая затем сливается с лизосомой фагоцита. В результате микроорганизм погибает под действием биоцидных факторов фагоцита (02~, Н202, NO, НС10 ) и разрушается с помощью его гидролитических ферментов. Фагоцитоз, при котором происходит гибель и разрушение поглощенных клеток, носит название завершенного. Наряду с этим при некоторых инфекциях (гонорея, туберкулез, лепра, лейшманиоз, коклюш, брюшной тиф, туляремия, бруцеллез, микозы) наблюдается незавершенный фагоцитоз, при котором микроорганизмы поглощаются фагоцитами, но не погибают, а иногда размножаются. Выживанию микробов способствует ряд факторов (подавление процесса слияния фагосомы и лизосомы, устойчивость к действию микробоцидных агентов лизосомы и др.).
Опсонины - белки обволакивающие микробные клетки и другие частицы и усиливающие их фагацитоз. Роль опсонинов выполняют иммуноглобулины, компоненты комплемента и некоторые другие белки.
Рецепторы, распознающие определенные химические структуры микробов. Особой формой эволюционно древней системы врожденного иммунитета является способность распознавать патоген-ассоцииро- ванные молекуклярные структуры (ПАМС), которые имеются лишь у микроорганизмов: компоненты клеточной стенки бактерий (типид А, пепти- догликан, липоарабиноманнан), флагеллин, ДНК и РНК бактерий и вирусов и др. Распознающие ПАМС рецепторы экспрессированы на макрофагах, дендритных клетках и В-лимфоцитах. Их подразделяют на группы: рецепторы передачи сигналов (Toll-англ, звонить), эндоцитозные мембранные и секретируемые растворимые. Они выполняют многочисленные функции, связанные с активацией защитных реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета.
Естественные клетки-киллеры (Natural killers - NK) - это лимфоциты, обладающие цитотоксичностью по отношению к клеткам-мише- ням (опухолевым, содержащим вирусы и другие паразиты). Они не обладают фагоцитирующей активностью, но убивают свою жертву с помощью цитотоксических веществ. Среди лейкоцитов крови человека NK составляют от 2 до 12 %.
12.2. Приобретенный иммунитет
Приобретенный (адаптивный) иммунитет отличается высокой специфичностью своих реакций, основанной на тонких структурно-химических различиях антигенов и соответствующих им антител (иммуноглобулинов), образующихся в ответ на попадание антигена в организм.
Приобретенный иммунитет по наследству не передается. Он формируется по отношению к конкретному виду возбудителя и является строго специфическим. Его подразделяют на активный и пассивный. Активный иммунитет вырабатывается в результате перенесенных заболеваний, инфицирования без клинических признаков заболевания, после активной иммунизации, т. е. введения вакцин и анатоксинов.Пассивный иммунитет возникает после введения препаратов, содержащих антитела (иммуноглобулины). Пассивным иммунитетом обладают новорождённые, которые получают его от матери в период внутриутробного развития. Его продолжительность невелика - около 6 месяцев.
12.2.1. Антигены
Антигенами называют все вещества, которые несут признаки генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций. Антигенность присуща белкам, многим полисахаридам, гликоконъюгатам (гликопротеинам, липополи- сахаридам), некоторым искусственным высокополимерным соединениям.
Основные понятия, характеризующие антиген: антигенность (способность вызывать иммунный ответ), илшуногенность (способность вызывать иммунитет, т. е. невосприимчивость к инфекции) и специфичность.
Специфичность определяется особенностями химической структуры антигена, благодаря которым один антиген отличается от другого. Химическая группировка молекулы антигена, определяющая его специфичность, называется антигенной детерминантой {эпитопом). Например, антигенная специфичность белка определяется его первичной и надмолекулярными структурами, а также поверхностно расположенными группами, которые могут служить антигенными детерминантами. В молекулах гликоконъюгатов эпитопом часто является полисахарид. Структура эпитопа комплементарна активному центру антител или Т-клеточному рецептору. Существуют индивидуальные эпитопы, распознаваемые Т- и В-клетками.
Гаптены - это вещества, обладающие специфичностью, но не вызывающие иммунного ответа при введении в организм. Однако с готовыми антителами они взаимодействуют. Гаптены приобретают свойства полноценных антигенов после соединения с крупномолекулярными веществами (белками, полисахаридами или искусственными полиэлектролитами). Соединение происходит за счет ко валентных связей или электростатических сил. Свойствами гаптенов могут обладать многие лекарственные препараты (амидопирин, хинидин, продукты распада пенициллина и др.), которые, взаимодействуя с белками организма, могут вызывать иммунный ответ - лекарственную аллергию.
Видовая специфичность - это специфичность, благодаря которой представители одного вида отличаются от особей другого вида. Например, различается состав сывороточных белков у человека и животных, что может быть использовано на практике, например, в судебной медицине.
Групповая специфичность обусловливает разницу среди особей одного вида. Антигены, благодаря которым особи одного вида различаются между собой, называются - изоантигенами. К изоантигенам относятся антигены, которые содержатся в эритроцитах и определяют группы крови человека (см. «Диагностические сыворотки»).
Состав молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС - от англ. Major Histocompatibility Complex) уникален для каждого организма и определяет его биологическую индивидуальность, что позволяет отличать «свое» (гистосовместимое) от «чужого» (несовместимого). Молекулы I и II классов - это гликопротеины, которые контролируют иммунный ответ и участвуют в реакциях цитотоксичности, осуществляемой Т-лимфоцитами. Молекулы I класса МНС представлены на поверхности всех ядросодержащих клеток, молекулы II класса - преимущественно на мембране иммунокомпетентных клеток (макрофагов, В-лим- фоцитов, активированных Т-лимфоцитов). Гены III класса МНС кодируют отдельные компоненты системы комплемента.
Типоспецифичность определяет антигенные различия внутри одного вида микроорганизмов (серовары). Например, известно более 80 се- роваров пневмококков, различающихся своими полисахаридными антигенами.
Гетероспецифичностъ обусловлена наличием гетероантигенов - антигенных детерминант, общих для представителей разных видов. Общие антигены встречаются у весьма отдаленных видов: у человека и возбудителя чумы, вируса гриппа и других микроорганизмов. Это так называемые мимикрирующие антигены. При сходстве антигенных структур микро- и макроорганизма формирование иммунного ответа нарушено, например, в миокарде человека имеются химические структуры, сходные с антигенами стрептококков, поэтому антитела против стрептококков способны атаковать ткани сердца, что служит причиной осложнений после перенесенной скарлатины.
Антигенная структура микробной клетки представляет большой научный и практический интерес, поскольку антигены бактерий используют с целью создания вакцинных препаратов для воспроизведения искусственного иммунитета и для серологической диагностики инфекционных болезней. В состав бактериальной клетки и вирусной частицы входят сложные комплексы веществ, обладающих антигенной активностью. К ним относятся высокомолекулярные соединения белковой природы, полисахариды, липополисахариды и т. п. Антигенными свойствами обладают органоиды клеток: жгутики, мембраны, цитоплазма, рибосомы, клеточная стенка. Токсины бактерий также являются сильными антигенами.
Суперантигены - это антигены микробов, которые блокируют специфический иммунный ответ и стимулируют ложную реакцию распознавания антигена. Они вызывают антигеннеспецифическую пролиферацию лимфоцитов, гиперпродукцию цитокинов, способствующих развитию воспаления, деструкции тканей и гибели Т-лимфоцитов с явлениями иммунодефицита. Суперантигены обнаружены у стафилококков, стрептококков и у некоторых вирусов.
Антигены вирусов - белки, ппикоконъюгаты, иуклеопротеиды, специфичны для вируса, или содержат компоненты клетки хозяина (липиды, углеводы).
Генетически модифицированные микроорганизмы (ГМО) могут иметь не существовавшие ранее в природе иммунодоминантные эпито- пы, что может привести к нарушению баланса между микроорганизмом и иммунной системой. В результате условно-патогенная микробиота перейдет в разряд патогенной. Если в числе эпитопов ГМО появятся последовательности, комплементарные участкам определенных молекул организма человека, такая антигенная мимикрия способна привести к развитию тяжелых аутоиммунных заболеваний.
12.2.2. Антитела
Антитела - это особые белки (гликопротеины), которые образуются в организме позвоночных животных и человека при введении антигенов и обладают способностью вступать с ними в специфическую связь. Антигены, связанные с антителами, обезвреживаются и удаляются из организма.
Особое значение имеет способность антител соединяться со специфической молекулой антигена, «узнавать» даже самые тонкие различия в ее структуре. Специфичность антител связана с различием в их химическом строении, т. е. в последовательности аминокислот полипептидных цепей, составляющих их структуру. Наряду с тонкими различиями в структуре антител, определяющими их иммунологическую специфичность, антитела имеют общие характерные особенности строения.
Молекулы антител имеют глобулярную структуру и называются иммуноглобулинами. Основу структуры любого антитела (рис. 11) составляет комплекс из четырех полипептидных цепей - двух одинаковых тяжелых и двух одинаковых легких. Тяжелые цепи обозначают буквой Н (heavy - тяжелый), а легкие - буквой L (light - легкий). Тяжелые и легкие цепи удерживаются вместе дисульфидными мостиками. Они уложены таким образом, что на поверхности образующейся структуры возникают два одинаковых участка, которые обозначаются Fab. Эти участки содержат центры связывания антигена. Третий участок Fc содержит структуры, обеспечивающие связывание антител с определенными клетками, несущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента, например, лейкоцитами, тучными клетками.
Utn*. (И) |
COOK соон
Рис. 11. Структура мономера молекулы иммуноглобулина
Как тяжелые, так и легкие цепи в своей структуре имеют две категории областей: вариабельные (V) и постоянные (С) по содержанию составляющих их аминокислот. Вариабельная область, располагающаяся на участке Fab, сформирована полипептидными цепями, первичная структура которых индивидуальна и сильно варьирует от молекулы к молекуле, что обеспечивает специфическое узнавание и связывание молекул антигенов. Вторичная структура иммуноглобулинов - а-спирапь, перемежающаяся сложными (3-структурами - «клубками», возникающими при сшивании аминокислотных остатков каждой цепи. Эти клубки называют доменами, они находятся на тяжелых и легких цепях вариабельных и константных участков. Активные центры антител формируются доменами вариабельных участков, которые располагаются в гипервариабельных областях тяжелых и легких цепей и обозначаются как фрагмент Fv.
Взаимодействие антигена с антителом осуществляется за счет электростатических, гидрофобных взаимодействий и сил Ван-дер-Ваальса. Молекулы полных антител имеют как минимум два центра связывания с антигеном. Антитела, имеющие только один центр связывания, называют неполными.
Иммуноглобулины представляют собой гетерогенную группу белков, их гетерогенность связана с существованием разных типов тяжелых и легких цепей. У человека имеется два типа легких цепей: к и А, (каппа и лямбда) и 5 классов тяжелых цепей а, у, ц, 5, s. В соответствии с классами тяжелых цепей иммуноглобулины подразделяют на 5 классов (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), различающихся по своим физико-химическим свойствам и биологической активности.
IgM - пентамер из 5 субъединиц, имеет 10 центров связывания с антигеном. Филогенетически наиболее древний, наиболее ранний, обнаруживаемый при первичном попадании антигена в организм, основной класс, синтезируемый у новорожденных и младенцев. .
IgG составляют до 75 % всех иммуноглобулинов, это основной класс, защищающий организм от бактерий, вирусов, токсинов и обеспечивающий формирование пассивного иммунитета у плода, поскольку только эти иммуноглобулины способны преодолевать плацентарный барьер.
IgA присутствуют в слюне, слезах, молоке, секретируются на поверхности эпителия и слизистых оболочек, усиливая их защитные функции.
IgE специфически взаимодействуют с тучными клетками и базофиль- ными лейкоцитами и принимают участие в развитии аллергических реакций. Их защитные функции направлены в основном против гельминтов.
IgD функционируют как мембранные рецепторы антигена на В-лим- фоцитах.
Кроме различных классов (изотипов) иммуноглобулинов, между ними существуют аллотипические и идиотипические различия. Аллоти- пы (маркеры константной области) генетически детерминированы и наследуются. Идиотины определяют индивидуальную характеристику каждого антитела. Идиотипические маркеры (антигенные детерминанты) локализуются в гипервариабельных областях и соответствуют антигенсвязы- вающим участкам антител. Все молекулы иммуноглобулинов, продуцируемые одним клоном лимфоцитов, несут один и тот же идиотип и называются моноклоналъными антителами. Источником разнообразия идиотипов служат рекомбинации ДНК и гипермутации V-генов иммуноглобулинов.
Иммунитет, опосредованный антителами, находящимися в плазме крови и других жидкостях организма, называется гуморальным. Его механизм связан со способностью антител нейтрализовать возбудитель и его токсины посредством опсонизации, антитоксического действия, активации комплемента и других воздействий на инфекционный агент. Опсони- зация происходит путем связывания антител с поверхностью микробной клетки. Такой комплекс активно поглощается фагоцитом при взаимодействии Fc-фрагмента антитела с соответствующим Fc-рецептором фагоцита. Антитела способны взаимодействовать с рецепторами клеток, связывающими бактерии или вирусы, препятствуя их адгезии и проникновению в клетки организма-хозяина. Кроме того, антитела обладают каталитической активностью, действуя как гидролазы и оксидоредуктазы, принимают участие в нейтрализации инфекционного агента.
12.2.3. Иммунная система
Иммунная система представляет собою совокупность лимфоидных органов и лимфоидных клеток, которые распространяются по всему телу организма и связаны системой кровообращения, лимфотока и единой системой иммунорегуляции. Иммунная система обладает уникальной способностью вырабатывать молекулы антител, специфичные для каждого антигена. Органы иммунной системы подразделяются на первичные - центральные (красный костный мозг и тимус) и вторичные - периферические (селезенка, лимфатические узлы, скопления лимфоидной ткани).
Первичные - центральные органы иммунной системы (красный костный мозг и тимус) обеспечивают ее самообновление. Здесь происходят процессы пролиферации клеток - предшественников, их дифферен- цировка и созревание, в результате чего они превращаются в иммуноком- петентные клетки, выходят в циркуляцию и заселяют периферические органы иммунной системы.
Красный костный мозг - место образования полипотентной стволовой клетки, которая дает начало разным росткам кроветворения, в том числе миело-моноцитарному и лимфоцитарному. В костном мозге образуются цитокины; у млекопитающих это место созревания В-лимфо- цитов (см. ниже).
Тимус (вилочковая железа) - место созревания и дифференциации Т-лимфоцитов. Тимус активно вырабатывает лимфоциты в период эмбриогенеза, достигает максимального размера у большинства позвоночных вскоре после рождения, затем постепенно инволюционирует. У человека самая высокая продукция Т-лимфоцитов сохраняется до двух лет жизни, затем быстро падает. Однако количество Т-лимфоцитов сохраняется на достаточном уровне, так как это долгоживущие клетки, кроме того, они способны пролиферировать в ответ на встречу со специфичным антигеном. В процессе созревания и дифференциации предшественники Т-лимфоцитов из костного мозга поступают в корковый слой тимуса, постепенно мигрируют внутрь и приобретают свои маркеры, контактируя с клетками тимуса и продуцируемыми ими медиаторами (специфическими пептидами) и цитокинами.
В тимусе происходит элиминация потенциально аутореактивных клеток. Основная функция зрелых Т-лимфоцитов - распознавание чужеродных антигенов, но не антигенов собственного организма (аутоантиге- нов). Элиминация состоит в том, что Т-лимфоциты, имеющие рецепторы для аутоантигенов (их в популяции 95-98 %), получают сигнал для апоп- тоза, а Т-клетки, обладающие рецепторами для чужеродных антигенов - сигнал для пролиферации. Апоптоз (программированная гибель) - это процесс распада клетки на отдельные фрагменты, которые могут быть использованы для построения других клеток.
Вторичные - периферические органы иммунной системы - это место встречи иммунокомпетентных клеток с антигеном, его распознавания и развития специфического иммунного ответа (взаимодействия иммунокомпетентных клеток и синтеза иммуноглобулинов).
Лимфатические узлы распространены по всему телу организма. Один лимфоузел имеет массу около 1 г и содержит приблизительно 2х 109 лимфоцитов. Каждый час из него выходит в лимфу количество лимфоцитов, равное его утроенному весу. Он отфильтровывает микробные клетки и другие частицы, в нем развивается иммунный ответ на антигены, попадающие в лимфу.
В селезенке развивается иммунный ответ на антигены, попадающие в кровь. Она удаляет из крови чужеродные частицы, а также состарившиеся и поврежденные эритроциты. При удалении селезенки ее функцию берут на себя лимфоидные органы, у таких пациентов иммунитет ослаблен.
Лимфоидная ткань ассоциирована со слизистой оболочкой кишечника, глотки, дыхательных путей, мочеполового тракта. Располагающиеся под эпителием макрофаги и дендритные клетки поглощают, перерабатывают антиген и передают его Т-лимфоцитам.
Илшунокомпетентные клетки — это клетки, принимающие участие в иммунном ответе. Они постоянно циркулируют между кровью, лимфой и лимфоидными органами, чтобы обеспечить встречу со «своим» антигеном, так как каждый антиген распознается лишь небольшой частью популяции лимфоцитов. Лимфоциты - это клетки, способные распознавать антиген и отвечать на контакт с ним. Индивидуальные лимфоциты специализированы: они способны (коммитированы) отвечать лишь на определенную группу структурно сходных антигенов. Эта коммитиро- ванность существует еще до первого контакта с антигеном и выражается в наличии у лимфоцита мембранных рецепторов, специфичных для детерминант определенного антигена. Лимфоциты являются исключительно неоднородной популяцией клеток: считают, что число рецепторов лимфоцитов с различными антигенсвязывающими центрами составляет не менее 106. Кроме того, лимфоциты различаются по их функциям в процессе иммунного ответа и другим физиологическим особенностям.
В-лимфоциты получили свое название потому, что исследования, проведенные на птицах, показали, что местом их дифференциации является особый лимфоидный орган - бурса (сумка) Фабрициуса. У млекопитающих местом созревания В-лимфоцитов является красный костный мозг.
В-лимфоциты в ходе иммунного ответа дифференцируются в клетки, продуцирующие иммуноглобулины. Они распознают антигенные детерминанты с помощью рецепторов, представляющих иммуноглобулины классов D или М. Кроме того они обладают другими рецепторами, для распознавания сигналов в процессе иммунного ответа.
Т-лимфоциты -основные клетки иммунологической памяти, они различаются по своим функциям, дифференцируются по поверхностным маркерам, определяемым серологическими методами.
Т-хелперы (Th от англ. helper-помощник) участвуют в распознавании комплекса антиген + МНС 2 класса. Т-хелперы под действием различных факторов дифференцируются на группы.
Thl-лимфоциты стимулируют клеточный иммунитет, участвуют в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, активируя макрофаги. Thl ответ стимулируется внутриклеточными возбудителями (вирусами, микобактериями, некоторыми грибами и простейшими) и напрвлен к уничтожению инфицированной клетки.
ТЬ2-лимфоциты активируют В-лимфоциты, стимулируют антитело- образование, т. е. отвечают за развитие гуморального иммунитета. Th2 ответ стимулируется внеклеточными возбудителями.
ТЬЗ-лимфоциты и Treg (регуляторные) лимфоциты выделяют цитокины, блокирующие иммунокомпетентные клетки, оказывающие имму- носупрессирующее и противовспалительное действие. Они могут предотвращать отторжение трансплантата и развитие аутоиммунных реакций.
Цитотоксические лимфоциты (CTL, Т-киплеры) распознают антиген в комплексе с МНС 1 класса и уничтожают чужеродные клетки с помощью цитотоксинов, которые индуцируют апоптоз клетки-мишени; особые белки перфорины образуют поры, нарушающие проницаемость мембраны клетки-мишени и прокладывают путь цитотоксинам. Контакт CTL и клетки-мишени непродолжителен, после чего CTL движется к новой жертве.
Макрофаги обеспечивают неспецифическую защиту за счет фагоцитоза и играют важную роль в развитии иммунного ответа как анти- генпроцессирующие и антигенпредставляющие клетки. Они происходят из стволовой клетки костного мозга, проходят стадии циркулирующих в крови промоноцита и моноцита и мигрируют в ткани (стадия гистиоцита или тканевого макрофага). Они несут на своей поверхности рецепторы, необходимые для захвата микробных клеток, а также рецепторы Fe-области иммуноглобулинов и комплемента, необходимые для осуществления реакций с участием антител.
Макрофаги и цитотоксические лимфоциты осуществляют клеточный иммунный ответ (реакции гиперчувствительности замедленного типа, уничтожение собственных инфицированных и опухолевых клеток).
Дендритные клетки участвуют в иммунном ответе как антиген- представляющие клетки. Они происходят из костного мозга, локализуются в лимфоидных органах, эпидермисе кожи и в слизистых оболочкак дыхательных путей. Обладают рецепторами, распознающими патоген-ассо- циированные молекулярные структуры микробов. Фагоцитирующей активностью обладают только их незрелые формы, которые захватывают антиген, после чего начинают созревать. Зрелые дендритные клетки про- цессируют антиген и представляют его Т-лимфоцитам.
12.2.4. Формирование специфического иммунного ответа
Процессинг антигена - это его модификация (ферментативная обработка, например, микробной клетки), в результате которой:
" антигенная детерминанта делается доступной для лимфоцитов;
■ крупные белковые молекулы превращаются в пептиды, при этом сглаживаются конформационные различия, что требует меньшего разнообразия Т-рецепторов;
■ глубокий протеолиз делает возможным распознавание внутренних антигенных структур микробной клетки, которые меньше, чем внешние подвержены мимикрии под «свое».
Функцию процессинга и представления антигена Т-лимфоциту выполняют макрофаги, В-лимфоциты, дендритные клетки, купферовские клетки печени и др. Процессированный антиген в комплексе с молекулой МНС II класса экспрессируется на поверхности антигенпредставляющей клетки и распознается Т-хелпером.
Взаимодействие иммунокомпетентных клеток (рис. 12). Узнавание Т-хелпером антигенного комплекса приводит к его активации, в результате которой лимфоцит синтезирует интерлейкины, стимулирующие пролиферацию (деление).
В-лимфоцит распознает «свой» антиген, перерабатывает его и представляет на своей поверхности его фрагмент в комплексе с молекулой МНС II класса. Этот комплекс распознается активированным Т-хелпером, который в ответ секретирует ряд интерлейкинов, под действием которых В-клетка дифференцируется, образуя клон плазматических клеток. Плаз
матические клетки синтезируют иммуноглобулины, их секрецию стимулирует ИЛ-6, выделяемый активированными Т-хелперами.
Тимуснезависмые антигены могут вызывать выработку антител без участия Т-лимфоцитов. Как правило, это крупные молекулы с молекулярной массой более 106, имеющие форму длинной, иногда разветвленной цепочки, на которых располагаются повторяющиеся идентичные эпито- пы. К ним относятся высокополимерные белки (флагеллин, ферритин), полисахариды (декстран, леван), бактериальные липополисахариды, некоторые синтетические полимеры (поливинилпирролидон). Многие из этих антигенов способны к длительному персистированию в организме. Они легко индуцируют антителообразование, но антитела к ним обладают низким аффинитетом.
12.2.5. Развитие иммунной системы
Рис. 12. Взаимодействие иммунокомпетентных клеток. Антиген: а - В-клеточный эпитоп, б - Т-клеточ- ныйэпитоп; 1 - антигенпредставляющая клетка (макрофаг); 2 - неактивированный Т-хелпер; TCR - Т-клеточный рецептор: 3 - активированный Т-хелпер: ЦР - цитокиновый рецептор; 4 - В-лимфоцит. |
првл>!ф»рац/<я. продукция UHtSKHHUS |
пролиферация, лифференцироока. |
Филогенез. На ранних этапах эволюционного развития защитные реакции носят неспецифический характер. У простейших они ограничиваются поглощением и ферментативным расщеплением чужеродных агентов, у примитивных многоклеточных имеются защитные барьеры и специализированные фагоциты. Лимфоидные клетки, способные к распоз
наванию антигена и обладающие иммунологической памятью, появляются только у низших хордовых. Рыбы имеют один класс иммуноглобулинов, сходный с IgM. У лягушек и рептилий уже есть IgM и IgG. Классы и подклассы иммуноглобулинов человека имеют наибольшее сходство с иммуноглобулинами человекообразных обезьян. В эволюции иммуноглобулинов отмечают три основных этапа: 1) появление V и С областей тяжелых и легких цепей, 2) появление основных классов тяжелых цепей и типов легких цепей, 3) появление подклассов иммуноглобулинов.
Онтогенез. У человека лимфоциты на ранних этапах кроветворения образуются в желточном мешке. На 4-й неделе внутриутробного развития их основным источником становится печень, а позже - костный мозг, где В-лимфоциты проходят антигеннезависимую дифференцировку и приобретают IgM на своей поверхности. Затем они покидают костный мозг и заселяют периферические органы иммунной системы. Контакт с антигеном стимулирует их антигензависимую дифференцировку в плазматические клетки. Последние начинают синтезировать иммуноглобулины: IgM-на 10-й, IgG - на 12-й, IgA- на 30-й неделе внутриутробного развития. У новорожденных уровень собственных иммуноглобулинов незначителен, а присутствуют в основном материнские IgG, которые исчезают к 9 месяцам, когда иммунная защита обеспечивается выработкой собственных антител. Предшественники Т-лимфоцитов на 6-8-й неделе внутриутробного развития заселяют тимус, где происходит их антигеннезави- симая дифференцировка. Начало синтеза компонентов комплемента во времени почти совпадает с началом синтеза иммуноглобулинов.
12.3. Аллергия
Обычно, говоря об иммунитете, имеют в виду полезные для организма защитные реакции. Однако следствием иммунных реакций могут быть и патологические изменения в организме. Эта измененная реактивность, возникающая под влиянием антигенов, носит название аллергии, а вызывающие ее вещества - аллергенов. Аллергены подразделяют на бытовые (пыль пуховых подушек, эпидермис и шерсть домашних животных), растительные (пыльца), производственные (пыль хлопка, шерсти, красители, лаки и т. д.); пищевые (яйца, земляника, цитрусовые, шоколад и др.), лекарственные (ацетилсалициловая кислота, сульфаниламиды, антибиотики и др.). Аллергические реакции подразделяют на 5 основных типов.
Реакции I типа (анафилактические) могут быть вызваны пыльцой растений, органическими компонентами пыли. Аллергены активируют специфическую популяцию Т-хелперов, которые в свою очередь активируют
В-лимфоциты, вырабатывающие IgE. Эти антитела способны прочно связываться с Fc-рецепторами клеток-мишеней (тучные клетки, базофилы).
Повторно попадающий в организм аллерген взаимодействует с IgE, фиксированными на клетках, что сопровождается цепной реакцией клет- ки-мишени, которая начинает выделять медиаторы (гистамин, кинины, гепарин, факторы хемотаксиса), воздействующие на клетки гладкой мускулатуры, кровеносных сосудов, желез внутренней секреции. В результате развивается клиническая картина анафилактических заболеваний, симптомы которых зависят от локализации сенсибилизированных клеток: ринит, конъюнктивит, бронхиальная астма, анафилактический шок.
Аллергические реакции II типа называют цитотоксическими, они связаны с выработкой IgG против антигенных компонентов мембран клеток организма. Такими компонентами могут быть аутоантигены клеток организма или антигены, вторично фиксированные на клеточных мембранах, например, лекарственные аллергены. Комплекс IgG с этими антигенами способен связывать комплемент и активировать его по классическому пути. В результате клетка погибает (комплементзависимый цитолиз). Таков механизм аллергических реакций к пенициллину, сульфаниламидам, при переливании крови, отторжении трансплантата, аутоиммунных заболеваниях. В то же время реакции этого типа играют защитную роль, обеспечивая элиминацию поврежденных, опухолевых и инфицированных паразитами клеток.
Реакции III типа - это реакции, обусловленные образованием иммунных комплексов (ИК). Образование ИК является перманентно протекающей физиологической реакцией, а патологические реакции на ИК могут быть связаны с нарушением механизмов их уничтожения клетками фагоцитарной системы. ИК способны активировать компоненты плазмы (системы комплемента, свертывания крови, хемотаксис) и определенные клетки (гранулоциты, тромбоциты и др.). Активированные клетки выделяют биогенные амины, ферменты, кинины и другие медиаторы, обусловливающие патологический процесс. В зависимости от вида антигена и его локализации, наблюдаются различные клинические проявления заболевания.
Эндогенные антигены вызывают аутоиммунные заболевания: системную красную волчанку, ревматоидный артрит, пузырчатку и др. Ответ на экзогенные антигены проявляется как сывороточная болезнь, феномен Артюса, ряд инфекционных заболеваний. Сывороточная болезнь развивается при введении сывороток и других лекарственных препаратов, ее клинические проявления - артрит, эндокардит, гломерулонефрит и др.
Феномен Артюса - это местная реакция, которая развивается в локусе попадания антигена (укус насекомых, введение лекарственных препаратов) на коже и прилегающих тканях. С образованием ИК связан патогенез инфекционных заболеваний различной этиологии: вирусных (гепатит В, корь), бактериальных (стрептококковых, менингококковых, вызванных микоплазмами и др.), протозойных (малярия, трипаносомоз), гельминто- зов. Кроме того, ИК участвуют в патогенезе опухолевых заболеваний и при отторжении трансплантата.
Рассмотренные три типа аллергических реакций обусловлены антителами и развиваются через несколько минут после введения антигена, поэтому их называют реакциями немедленного типа. Они существенно отличаются от реакций IVтипа, опосредованных клетками, или реакций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), которые проявляются не ранее 6-8 ч, обычно через 24-48 ч после введения антигена. Основой этих реакций является не гуморальный, а клеточный иммунитет. В реакции принимают участие Thl-лимфоциты, несущие специфические для данного антигена рецепторы. В результате распознавания комплекса антигена с молекулами МНС И класса начинается пролиферация лимфоцитов, высвобождение лимфокинов и реализация цитотоксического эффекта. Лимфокины (фосфолипиды, пептиды) - медиаторы клеточного иммунитета активируют макрофаги или непосредственно воздействуют на клетки-мишени. Активированные макрофаги обладают повышенной фагоцитарной и микробоцидной активностью. Активированные лимфоциты (Т-киллеры) вступают в тесный контакт с клеткой-мишенью, обусловленный одновременным связыванием антигена и молекул МНС соответствующими рецепторами. Активируются ферменты Т-лимфоцита, нарушающие проницаемость мембраны клетки-мишени, которая в результате лизируется. Контакт Т-лимфоцита и клетки-мишени продолжается около 1 часа, лимфокины появляются в течение 1-12 ч, а первые некрозы - через 24-48 ч.
Т-клеточная цитотоксичность проявляется при противоопухолевом, противовирусном и трансплантационном иммунитете. Гиперчувствительность замедленного типа развивается при туберкулезе, лепре, бруцеллезе, пневмококковых и стрептококковых инфекциях, дифтерии, микозах, гель- минтозах. Возможно развитие ГЗТ при контакте с гаптенами — химическими веществами, в том числе лекарственными, которые образуют комплексные антигены с белками кожи.
Аллергические реакции IV типа выполняют не только патогенетические, но и защитные функции, повышая активность клеточного иммунитета. На этом принципе построена активная иммунизация против туберкулеза, когда детям в первые часы их жизни вводят ослабленную культуру туберкулезной палочки (вакцину BCG), которая повышает реактивность организма и предотвращает развитие заболевания.
Сенсибилизированные Т-лимфоциты годами сохраняются в организме и при повторном попадании антигена вступают с ним в реакцию. На этом основаны кожные диагностические реакции на инфекционные заболевания (туберкулез, микозы).
В естественных условиях часто наблюдаются комбинированные формы клеточных и гуморальных аллергических реакций.
Реакции V типа обусловлены образованием антител к рецепторам или медиаторам определенных физиологических реакций, например, к рецепторам гормонов, в результате чего нарушается гормональная регуляция организма.
Лечение и профилактика аллергии предусматривает выявление аллергенов и прекращение контактов с ними, применение препаратов, угнетающих иммунный ответ (иммунодепрессантов), при анафилаксии - неспецифических средств (новокаин, димедрол, кальция хлорид), или используют метод десенсибилизации. Одним из способов десенсибилизации является дробное введение антигена. Небольшие порции антигена, вводимого дробно, связывают циркулирующие в крови антитела и предотвращают развитие аллергической реакции. Иммунные комплексы возможно удалить с помощью плазмафереза. На производстве необходимо соблюдать меры безопасности для предотвращения контакта с аллергенами (микробными клетками, их продуктами, химическими веществами). Эти меры предусматривают герметизацию оборудования, автоматизацию процессов производства, индивидуальные меры защиты.
Испытание на наличие Escherichia coli и Salmonella
spp.
10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл питательной среды № 11 (лакгозный бульон). В случае если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 2-5 ч 10 мл среды № 11 переносят в 100 мл среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32,5± 2,5) °С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде № 3 (среда прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испытания продолжают.
Глава 17. БОРЬБА СМИКРОБАМИ-КОНТАМИНАНТАМИ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
17.1. Действие физических и химических факторов
на микроорганизмы
Микроорганизмы обладают значительно большей толерантностью к физическим и химическим факторам окружающей среды, чем растения и животные. Некоторые из бактерий способны размножаться при температуре от-12 °С до +104 °С, в диапазоне значений рН от 1 до 13, гидростатическом давлении от 0 до 1400 атм, не погибают при интенсивном облучении, живут в бидистиллированной воде и в насыщенных растворах солей. Вместе с этим каждый вид микроорганизмов имеет свои наследственно закрепленные зоны влияния конкретных воздействий: оптимальные, подавления роста, гибели.
Мероприятия по созданию помещений нормируемых классов чистоты
Типы зон по GMP ЕС для различных операций стерильного производства |
1. Строительно-планировочные мероприятия предусматривают правильное размещение помещений того или иного класса чистоты в производственном здании. Помещения классов чистоты А, В и С нельзя
размещать в цокольном этаже, подвале. Необходимо исключить любую возможность скапливания пыли как источника механических и микробных частиц, поэтому не должно быть труднодоступных мест, не поддающихся очистке, следует избегать установки полок, планок, шкафов, стеллажей и др. В помещениях должны быть гладкие поверхности стен, пола, потолка, без шероховатостей и трещин. Запрещено применение деревянных поверхностей. Покрытия выбирают с учетом их устойчивости к действию моющих и дезинфицирующих средств, а для пола - и к механическим воздействиям. Используют закругленные сопряжения между полом, потолком и стенами. Должна быть предусмотрена тщательная герметизация подвесных потолков с целью предотвращения загрязнения из пространства над ними. В зонах А и В запрещается устанавливать раковины, сточные трубы, открытые коммуникации.
2.Подготовка вентиляционного воздуха При подготовке и подаче воздуха в производственные помещения необходимо правильно расположить воздухозаборные устройства по высоте и направлению ветра: не менее 2-х метров над крышей с подветренной стороны. Очистка приточного воздуха должна быть ступенчатой. Количество ступеней обуславливается требуемой чистотой воздуха в помещениях (табл. 35).
Таблица 35
Принцип ступенчатой системы подготовки воздуха
|
В помещениях класса А создают горизонтальные или вертикальные ламинарные потоки стерильного воздуха, который поступает со скоростью 0,3-0,6 мсч. На каждой ступени очистки следует предусмотреть штуцеры для отбора проб воздуха и определения концентраций механических частиц до и после фильтра. Производительность системы вытяжной вентиляции должна составлять 80-90 % от производительности системы приточной вентиляции для обеспечения подпора воздуха в «чистых помещениях».
Необходимо соблюдать кратность воздухообмена, которая пропорциональна удельному тепловыделению и обратно пропорциональна высоте помещения.
3. Санитарная подготовка оборудования и помещения к работе
До и после технологического процесса проводится мойка и стерилизация съемных частей или обработка внутренних и наружных поверхностей моющими и дезинфицирующими средствами.
В качестве моющих средств применяют вещества из группы ПАВ: «Сульфонол», «Катамин-АБ», «Прогресс», а в качестве дезинфицирующих - пероксид водорода, «Гибитан», трикрезол, спирт этиловый. Съемные части (узлы) оборудования, непосредственно соприкасающиеся с лекарственными веществами, тщательно моют в растворе моющего средства, затем споласкивают водой очищенной, и водой для инъекций, профильтрованной через мембранный фильтр с порами диаметром не менее 5 мкм. Вымытые узлы заворачивают в 2 слоя пергаментной бумаги и передают на стерилизацию. Стерилизуют при избыточном давлении 0,11 МПа (120 ± 1) °С в течение 45 мин с последующей подсушкой при остаточном давлении 0,07 МПа не менее 10 мин. Стерилизацию неразборных участков технологического оборудования рекомендуется осуществлять острым паром 60 мин при температуре (120 ± 1) °С. Наружные поверхности обрабатываются дезинфицирующими растворами.
Под подготовкой чистых помещений к работе подразумевают комплекс мероприятий в соответствии с письменной инструкцией, состоящий из влажной уборки и дезинфекции стен, полов и различных поверхностей, направленный на достижение соответствующего класса чистоты. Следует использовать разные дезинфицирующие вещества и проводить регулярный контроль окружающей среды с целью обнаружения устойчивых штаммов бактерий. Обязательно необходимо проверять микробное загрязнение дезинфицирующих растворов. Все моющие и дезинфицирующие средства, применяемые в производстве стерильных препаратов, должны быть стерильными.
4. Подбор и гигиеническая подготовка персонала
Персонал фармацевтических предприятий является одним из основных источников контаминации ГЛС и полупродуктов механическими частицами и микроорганизмами.
Весь персонал, работающий на предприятии, должен иметь знания и опыт, необходимые для выполнения соответствующих обязанностей, а также должен быть ознакомлен с правилами GMP.
Состояние здоровья персонала является важным фактором в системе обеспечения качества ГЛС, поскольку человек может быть источником инфекции или способствовать ее переносу. Весь персонал, занятый на производстве, должен проходить регулярные медицинские осмотры. К работе в помещениях классов чистоты А - С не должны допускаться люди страдающие аллергическими и кожными заболеваниями, повышенным отделением перхоти, а также курящие. Временно (до нормализации состояния здоровья) к работе не допускаются больные инфекционными заболеваниями и сотрудники, имеющие загар или различные повреждения кожи. Персонал должен ставить в известность руководителей о любых недомоганиях (острых респираторных, кожных) способных оказать нежелательное воздействие на качество ЛС.
Личная гигиена персонала. Персонал, работающий в производстве стерильных лекарственных средств, должен строго соблюдать правила личной гигиены: регулярно принимать душ, мыть голову не реже 2-х раз в неделю. Подготовка персонала к работе должна осуществляться в определенном порядке. Во время работы необходимо носить технологическую одежду, соответствующую выполняемым производственным операциям (ГОСТ Р 52538-2006).
Во время работы запрещается использование косметики, а также запрещается носить часы и ювелирные изделия, вносить в производственные помещения личные вещи, запрещается принимать пищу и хранить еду, личные лекарства.
Правила поведения персонала. В производстве стерильных лекарственных средств необходимо строго ограничивать число работающих до минимально необходимого уровня. Вход персонала в производственные помещения классов чистоты А и В должен осуществляться через воздушный шлюз. Перемещения персонала внутри помещений должны осуществляться в определенном порядке в зависимости от выполняемых операций. Запрещается бесцельное хождение во время работы. Все движения должны быть медленными и плавными. Запрещаются разговоры на посторонние темы; устное общение с людьми, находящимися вне производственных помещений, осуществляется через телефон или селектор. Запрещается смех, крики, так как при этом увеличивается число выделяемых изо рта микроорганизмов. Нельзя поднимать и использовать упавшие на пол во время работы предметы. Запрещается использование карандашей, перьевых ручек, разрешается применение шариковых ручек или фломастеров, которые один раз в смену протирают салфеткой из специальной ткани, смоченной этиловым спиртом.
Обо всех нарушениях и неблагоприятных изменениях санитарного режима персонал должен сообщать руководителю.
Неправильная подготовка и поведение персонала приводит к резкому снижению показателей микробиологической чистоты и может превратить помещения класса чистоты А в класс С.
Изолирующая технология
Одним из способов создания асептичных условий производства является изолирующая технология. Эта технология предусматривает физическую изоляцию рабочей зоны от окружающего пространства за счет применения герметичного изолятора. Изолятор - это локальное контролируемое пространство, ограниченное оболочкой с целью изоляции внутренней среды от наружной таким образом, чтобы перенос потенциальных загрязнений из одной среды в другую был сведен до минимума или исключен. Правилами GMP установлено, что для асептического производства пространство, окружающее изолятор, должно, по крайней мере, соответствовать зоне D. Это существенно более простое условие, чем требование к чистоте в обычной технологии чистых помещений. Оно позволяет значительно снизить затраты на строительство и эксплуатацию чистых помещений.
Изолятор обеспечивает:
■ разделение процесса и оператора;
■ разделение циркуляции воздуха внутри изолятора и вне его;
■ возможность эффективной биологической деконтаминации внутреннего пространства изолятора;
■ стерильную передачу материалов в изолятор и из него.
18.3.2. Микробиологический контроль эффективности
подготовительных мероприятий до и в процессе работы
В помещениях высоких классов чистоты показатели микробиологической загрязненности обычно очень низкие, поэтому путем взятия единичной пробы трудно получить статистически значимые результаты. Для получения достоверной информации используют программу текущего мониторинга производственной среды по всем контролируемым параметрам (влажность, температура, скорость воздушных потоков, уровень перепада давления между помещениями, уровень контаминации бактериальными и механическими частицами), предусматривающую мероприятия, проводимые при нарушении нормируемых показателей.
Программа микробиологического мониторинга включает:
• определение микробной контаминации воздуха (КОЕ/м3);
• контроль критических поверхностей (непосредственно контактирующих со стерильным материалом), рук и одежды персонала, работающего в асептических производственных зонах;
• оценку эффективности дезинфекции;
• проверку активности дезинфектантов;
• контроль эффективности работы стерилизующих воздушных фильтров;
• валидацию методов микробиологического контроля (состав питательных сред, способ их стерилизации, контроль стерильности, температура и время инкубации и т. п.).
Расположение точек отбора проб воздуха и смывов с поверхностей устанавливают в процессе аттестации чистого помещения.
Ключевыми точками при текущем мониторинге являются:
• зоны наиболее высокой вероятности контаминации продукта;
• зоны наибольшего скопления микроорганизмов;
• труднодоступные зоны для уборки и дезинфекции;
• точки смежных зон (помещений классов А и В);
• зоны возмущения воздушных потоков рельефом поверхности. Микробиологическому мониторингу подлежат: воздух помещений,
технологическое оборудование, рабочие поверхности, руки оператора в перчатках, одежда персонала, контейнеры, в которых хранится продукт, вода, сжатый воздух (табл. 36). Реже контролируют стены, потолок и пол помещения, двери, транспортные тележки, контейнеры для сбора отходов, приборы для тестирования.
Частота отбора проб зависит от класса чистоты помещения и характера технологического процесса. Зоны класса А проверяют каждую рабочую смену, зоны класса В - каждую смену или ежедневно, класса С - два раза в неделю, класса D - еженедельно.
Отбор проб проводят в одно и то же фиксированное время. Обязательными являются:
• контроль воздуха во время работы;
• контроль поверхности перед работой;
• руки оператора перед выполнением асептических манипуляций. Периодичность проведения микробиологического мониторинга может значительно варьировать в зависимости от конкретных показателей:
• типа производимого продукта;
• степени вмешательства человека в процесс;
• использования финишной стерилизации;
• данных предшествующего контроля.
Таблица 36
Примеры точек отбора проб
|
Объем пробы воздуха должны быть достаточным как для обнаружения микроорганизмов в заданном объеме воздуха, так и для роста дискретных и пригодных к подсчету колоний на фильтрующей мембране или агаровой пластине.
Для снятия смывов с плоских поверхностей рекомендуемой является площадь 24-30 см2; при контроле рук оператора делают отпечатки пальцев на агаре, смыв тампоном с одежды.
При контроле поверхностей, предварительно обработанных дезинфицирующими растворами, для их инактивации необходимо добавлять в питательные среды нейтрализаторы, например, твин-80, лецитин и др.
Все выявленные в процессе мониторинга окружающей среды микроорганизмы подлежат обязательной макроскопической и микроскопической идентификации. При обнаружении споровых бактерий или грибов необходимо проводить дополнительную дезинфекцию помещений.
Идентификация дает возможность предположить источник контаминации, основываясь на преимущественном распространении микроорганизмов во внешней среде.
Данные табл. 37 конкретизируют требования к классам чистоты, данные по КОЕ относятся к неспорообразующим микроорганизмам. Присутствие спорообразующих бактерий и грибов недопустимо.
Таблица 37
Рекомендуемые пределы допустимого загрязнения чистых зон в эксплуатируемом состоянии (ГОСТ Р 52249-2004)
|
Приведенные уровни микробной контаминации одежды и рук персонала устанавливаются на конец рабочей смены, в начале смены перчатки и одежда должны быть стерильными.
18.3.3. Валидация
Валидация заключается в документированном подтверждении соответствия оборудования, условий производства, технологического процесса, методов контроля, качества полупродукта и готовой продукции действующим регламентам и требованиям нормативной документации. Валидация является неотъемлемой частью обеспечения качества J1C, в том числе и по микробиологическим показателям.
Рекомендуемая литература
1. Асептическое производство медицинских иммунобиологических препаратов: Методические рекомендации. МУ 44-116. -М., 1997.
2. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности. Санитарные правила СП 1.2.011-94. - Госкомсанэпиднадзор России. - М.. 1994. - 252 с.
3. Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности и гельминтами. Санитарные правила СП 1.2.731-99. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. 1999. - 107 с.
4. Брок Т. Мембранная фильтрация. -М.: Мир, 1987. - 462 с.
5. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Миндукшев И.В., Юрлова Н.А. Промышленная микология. СПб.: 2003. -217 с.
6. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Кочеровец В.И., Курбанова И.З. Питательные среды. Справочник. - СПб.: Проспект Науки, 2006. - 336 с.
7. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Каграманова К.А., Карцев В.В., Потехина Т.С. Са- нитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности. - СПб., 2004. - 248 с.
8. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Кочеровец В.И., Потехина Т.С. Фармацевтическая микробиология. - М.: Арнебия, 2003. - 352 с.
9. Глик Б., Пастренак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. - 589 с.
10. Государственная Фармакопея. Выпуск 2. МЗ СССР, 11-е изд., -М.: Медицина, 1989. -400 с.
11. Изменения к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекарственных средств (ГФ-XI, вып.2, с. 187), введенные с 1.06.1996. - 17 с.
12. Изменение № 1 к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекарственных средств от 26.12.1995 г.
13. Изменение № 2 к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекарственных средств от 14.08.2001 г.
14. Изменение № 3 к статье ГФ-XI Методы микробиологического контроля лекарственных средств от 19.03.2003 г.
15. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 356 с.
16. ЗаикинаН.А., Галынкин В.А., Гарабаджиу А.В. Иммунобиотехнология. -СПб., 2005.-354 с.
17. Кочеровец В.И., Галынкин В.А., Заикина Н.А. Фармацевтическая микробиология. Словарь терминов. - М.: Арнебия, 2004. - 182 с.
18. Красильников А.П. Справочник по антисептике. Мн.: Высшая школа, 1995. - 367 с.
19. Машковский М.Д. Лекарственные средства, ч. II. М.: Медицина, 1994. - 686 с.
20. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев O.K. - М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - 1200 с.
21. Микробиологический мониторинг производственной среды. МУК 4.2.734-99. М„ 1999.-31 с.
22. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. М.: Мир, 1995. - 343 с.
23. Определитель бактерий Берджи / Под. ред. Дж. Хоулта и др. М.: Мир, 1997. - 800 с.
24. Организация и контроль производства лекарственных средств. Стерильные ЛС. МУ 42-51-1-93, МУ 42-51-26-93. М„ 1993.-73 с.
25. ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств.
26. Панарин Е.Ф. Полимерные лекарства и биологически активные вещества. Итоги полувековых исследований и перспективы // Полимеры и медицина. - 2005. - №1. - С. 20-24.
27. Сборник руководящих нормативных документов по предупреждению микробной обсемененности нестерильных лекарственных средств (РДИ 64-28-84, 4-31-84).
28. Страчунский Л.С., Козлов С.П. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. - М.: Боргес, 2002. - 436 с.
29. Фундаментальные направления молекулярной медицины. - СПб.: Росток, 2005. - 399 с.
30. «Чистые помещения» / под. ред. Федотова А.Е. М.: Асинком. 2003. - 576 с.
31. Щелкунов С.П. Генетическая инженерия. Новосибирск: Изд. Новосибирского университета. 1994. - 303 с.
32. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина. 1999. - 607 с.
33. Biology of the Procaryotes. Edited by J.W. Lengeler, G. Drews, H.G. Schlegel. Thieme, Stuttgart, New-York, 1999. - 955 p.
34. Biotechnology of Antibiotics. 2-d ed. New-York-Basel-Hong Kong, 1997. - 842 p.
35. Pharmaceutical Microbiology. 7Л Ed. by W.B. Hugo, H.D. Russel. Blackwell Science, 2004.-481 p.
36. Russel, Hugo, Ayliff's. Principles and Practice of Desinfection, Preservation and Sterilization. 4>h Ed. Blackwell Publishing, 2004. - 678 p.
Предметный указатель
«с» - после номера страницы - термин упоминается на последующих страницах Автоклав 25
Автотрофные бактерии 23 Адаптация 72 Адгезины 62 Адгезия 69 Аддитивность 108 Адсорбция 46 Адъюванты 176с Азот 29с
Азотфиксирующие бактерии 29 Аксостиль 64 Активный выброс 143 Актиномицеты 11,31 Аллергены 162с, 177с Аллергия 162с Амебоидное движение 63 Амебы 63 Аминокислоты И Аммонификация 30 Амфиболизм 21 Анаболизм 21 Аналоги нуклеозидов 53 Анаморфы 34 Анатоксины 172 Анафилаксия 162 Анаэробные бактерии 27 Аноксигенные бактерии 28 Антагонизм 196 Антеридии 36 Антибиотики 74с
- влияние на нормальную микробиоту 199
- промышленное производство 74с
- спектр действия 74с
- устойчивость к ним 117с Антивирусные препараты 53 Антигены 151с, 161 Антиметаболиты 121 Антимикробное действие ЛС 237с, 244
Антисептика 254с Антисептики 130
- методы оценки 135с
- механизм действия 139с
- резистентность к ним 142с Антитела 152с, 197
- моноклональные 183с
- неполные 155
- структура 153 Апоптоз 158с Архебактерии 9 Асептика 254с Аск (сумка) 37
Аскомицеты (сумчатые грибы) 41 Ауксотрофные организмы 24, 91 Аутоиммунные заболевания 165с Аутоиндукция 20 Аэробы 26
Базальное тельце 15 Базидии 36 Базидиомицеты 39 Бактериальная клетка 11 с Бактериофаги (фаги) 46с, 206 Банк клеток 175 Безопасность 102, 181с Белки 29, 45, 152
- биосинтез 49, 118 Биодеградация 226 Биоиндикаторы 91, 263 Биолюминесценция 20 Бионагрузка 255 Биопленка 124, 144 Бифидобактерии 199 Брожение 26
Вакцины 170с Валидация 264, 282 Векторы 96 Вирионы 45 Вирулентность 68с, 174 Вирусы 45с, 142с, 154 Витамины 92
Внешняя мембрана 13, 143 Вода 206с, 219с, 228
Воздух 221с, 274с Воздушная микробиота 209 Волоски, ворсинки (см. Пили) 69 Воска 145 Воспаление 148 Время генерации 25 Выборочная проба 237
Гаптены 152 Генная инженерия 94с Генные кассеты (кластеры) 126 Гены 20с
- регуляторные 22 -резистентности 125с
Гибридомы 183с
Гигиена на производстве 269с
Гифы 36
Главный комплекс гистосовместимости 152с Гликозидные связи 11, 36 Гликоконъюгаты 36, 152 Госпитальные инфекции 128 Грамотрицательные бактерии 13, 142, 230 Грамположительные бактерии 13, 142 Грибы 33с, 219, 229
Дезинфектанты 130с Дезинфекция 130с
- промышленная 264с Декстран (а-1,6-глюкан) 92, 194 Дендритные клетки 160 Денитрификация 30 Депротеинизация 49 Дерепрессированные мутанты 22 Дефенсины 148
.ието-Диаминопимелиновая кислота 11 Дигидроптеровая кислота 121 Дипиколиновая кислота 16 Дисбактериоз (дисбиоз) 199 ДНК 94с
- вирусов 45
- гибридизация 94с ДНК-лигаза 95 ДНК-полимераза 96 ДНК-содержащие вирусы 45 Домены 155
Доноры водорода (электронов) 23
- углерода 23 Дрожжи 37, 235 Дыхание 26с
Дыхательные пути, микробиота 195 Естественные клетки-киллеры 151 Жгутики 15, 59
Жгутиковые (жгутиконосцы) 64
Зигомицеты 34
Идиотипы 156 Идиотрофы 24 Изоантигены 152 Изолирующая технология 280 Иммунитет 148с Иммунная система 157с Иммунные комплексы 163
-сыворотки 179с Иммуногенность 151с, 173 Иммуноглобулины 153с, 179с Иммунокомпетентные клетки 159с Иммуномодуляторы 165, 178с Иммунопрепараты 170с Индикаторные бактерии 263 Интерлейкины 160 Интерфероны 53, 149
- индукторы 54 Инфекционные заболевания 71с Инфузории 65с Ионизирующая радиация 258с
Капсид 46 Капсомеры 46 Капсулы 14, 37, 69 Карантин 222 Каротиноиды 92 Катионные пептиды 79, 148 Кворума чувство 20 Кинетика роста 25с Кислотоустойчивые бактерии 15 Кишечная микробиота 192 Классы чистоты 275с
Клеточная стенка 11, 36, 117 Клеточное деление 19,25 -ядро 18, 37
- цикл 19 Клонирование 98 Клостридии 204
КОЕ (колониеобразуюшая единица) 202 Кожная микробиота 193 Колиформные бактерии 195с, 203, 231 Комплемент 148с Конидии 34 Консерванты 133с Константа скорости деления 25 Контаминация микробная 212с, 268 Контроль качества вакцин 185
- иммуноглобулинов 184
- лекарственных средств 272с Конъюгация 19, 97 Ксенобиотики 143
Культивирование микроорганизмов 175с
Культура ткани 176
(З-Лактамаза 75с, 91
Лейкоциты 150
Лекарственные вещества 211
- препараты 211
- средства (ЛС) 211
- сырье 211с
- формы 211
- их качество 227с, 272с
- контроль 235с
- микробиота 211 с, 225с Лектины 69
Лизогенные бактерии 48 Лимфатические узлы 158 Лимфоидная ткань 158 Лимфоциты 159с ЛипидА 13 Липиды 37
Липополисахариды 69 Липосомы 177 Литический цикл 48 Литотрофные организмы 23 Лишайники 39 Лучистая энергия 251с, 258с Люминесценция 39
Макрофаги 150, 159с Мезосомы 15
Мезофильные бактерии 249
Мейоз (редукционное деление) 33
Мембранная фильтрация 239, 247, 260
Мембраны 15, 121
Метаболизм (обмен веществ) 21 с
Мигрирующие генетические элементы 19
Миелома 183
Микобактерии 118, 142
Миколовые кислоты 118, 145
Микоплазмы 9, 113
Микориза 39
Микотоксин 40
Микробиологические производства 213 Микробиота воды 206с
- воздуха 209
- почвы 208
- тела человека 192с Микробная трансформация 91 Микробоносительство 222 Микротрубочки 38 Микрофибриллы 38 Микрофиламенты 36 Мимикрирующие антигены 69, 153 Митохондрии 37
Мицелий 33 Мишень 125с, 140 Мониторинг 264с, 281 Муреин 9с, 117 Мутации (мутанты) 22, 98
Наружная (внешняя) мембрана 13, 143 Нейраминидаза 45 Нейтрофилы 150 Нестерильные ЛС 211с Нормальная микробиота 167, 191с Нуклеоид 18 Нуклеокапсид 45 Нуклеоплазма 37
Облигатно-паразитические бактерии 72 Обрастание 213
Обратная транскриптаза 46с, 127 Окрашивание по Граму 13
Опсонины 150
Органотрофные организмы 23
Передача информации 20 Перенос генов 19, 91 Персонал 222с, 279 Пили 16, 69
Пирогенны См. также Эндотоксины 13
Питание микроорганизмов 24
Питательные среды 24с, 174, 239
Плазматические клетки 160
Плазмиды 18, 125
Плазмокоагулаза 71
Плодовые тела 34с
Подвижность бактерий 15
Полипептиды 14с
Полисахариды 15с, 36
Половое размножение 33с
Посевной материал 91, 174, 224
Почва 209
Почкование 34
Правила GMP 86, 227, 269с
Прионы 57с
Производственные помещения 278 Прокариоты 9с Пролиферация 161
Промежуточный обмен (амфиболизм) 21 Простейшие 59с Протопласты 14, 99 Прототрофные организмы 24 Профаги 47 Процессинг 160 Псевдомонады 30, 97, 112 Психрофильные бактерии 249
Растения
- болезни 215с Регуляция метаболизма 22 Резистентность 105с, 123с. 142 Репродукционное размножение 33 Реснички 59
Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) 94с Рецепторы 46, 151, 159 Рибосомы 11, 37 Ризоиды 34
Риккетсии 72, 113 Риск 272с
РНК-содержащие вирусы 45 Рост микроорганизмов 25с
Санитарная микробиология 200с
Санитарно-показательные микроорганизмы 199с
Сапронозы 72
Селезенка 157
Селективные условия 236
Сенсорные системы 20
Серия (партия) 237
Симбиоз 39, 72
Синергизм 108
Скрининг 128
S-слой 13
Совершенные грибы 36 Специфичность антигенов 151с Споровики 59 Спорообразование 16 Спорообразующие бактерии 15 Споры 16с, 142с
- грибов 33с
- прокариот 16, 131 Стафилококки 109, 205 Стволовые клетки 157 Стерилизация 254с
- контроль 245, 262с Стерильные ЛС 218, 225 Суперантигены 153 Суспензионный тест 136 Сферопласты 14
Таксис 20
Таллом (вегетативное тело) 36 Тейхоевые кислоты 13 Телеоморфы 34 Термофильные бактерии 250 Тимус 157 Токсины 70 Толерантность 165с Транспозоны (Тп) 19, 125 Трансфекция 97 Трансформация 19, 97 Тучные клетки 163 Тяжелые металлы 168
Ультраструктура 33с Ультрафиолетовое облучение 251с Ундулирующая мембрана 64 Упаковочный материал 221с
Фаговая конверсия 48 Фагорезистентность 48 Фаготипирование 49 Фагоцитоз 150 Фактор(ы) роста 24
- виртулентности 126 Фармацевтическая промышленность 211с Фенотип 17
Ферментация 213 Ферменты
- ингибирование 22, 140
- индуцибельные 22
- патогенности 71
- регуляция 22 Фибринолизин 71 Фиксация азота 23 Фильтрация 200 Фимбрии 16
Фитопатогенные микроорганизмы 44 Фотореактивация 252 Фотосинтез 23 Фототрофные бактерии 23
Хемолитотрофные бактерии 23 Хемоорганотрофные бактерии 23 Химиотерапевтические препараты 104с, 117с
- механизм действия 117с -устойчивость к ним 105с, 117с
Химиотерапия 104с Хитин 37 Хламидоспоры 34 Хромосомы 37, 120
Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) 23
Цикл клеточный 18
Цисты 60с, 142
Цитокины 157с
Цитоплазма 15, 140
Цитоскелет 38
Цитотоксические реакции 159
Чистые помещения 275с, 282 Чувство кворума 20
Шизогония 61 Шизонты 61
Эволюция 161 Экзотоксины 70 Экология 38, 191с Экспоненциальный рост 26 Эндоплазматический ретикулум 37 Эндоспоры 16с
Эндотоксины См. также Пирогены 70
Энтеробактерии 195с, 219, 242
Энтерококки 203
Эозинофилы 150
Эпидемиология 72
Эпитоп 152
Эпифитная микробиота 215 Эубиотики (пробиотики) 199 Эукариоты 9
Ядерная мембрана 37 Ядро см. Клеточное ядро
- бактериальной клетки см. Нуклеоид
УКАЗАТЕЛЬ ЛАТИНСКИХ НАЗВАНИЙ
Acanthaamoeba 63 Acetobacter 92 Acremonium chrysogenum 75 Actinomyces 3J Agrobacterium 215 Ajellomyces 42 Altemaria 41 Amoebia 62 Apicomplexa 59 Arthrobacter 92 Ascomycetes 41, 216 Aschbya gossypii 92 Aspergillus 35, 41, 143, 216
Babesia 62 Bacillus 97, 143
- anihracis 30 -brevis 97
- cereus 30, 207
- licheniformis 199 -pumilits 263
- stearothermophilus 97, 263 -subtilis 97, 142, 199, 263
Bacteroides 194 Balantidium coli 65 Basidiomycetes 41 Bifidobacterium 199 Blakeslea 92
Blastomyces dermatitidis 42 Bordetell apertussis 30 Borrelia 30, 194 Botritis cinerea 216 Brevibacterium 92 Brucella 30
Burkholderia 30, 142, 225
Campylobacter 30 Candida 41, 142c, 193 Chlamydia 30 Choanephora 92 Chromatium 23
Chromobacterium 207 Chytridiomycetes 216 Ciliophora 59 Citrobacter 191, 231 Cladosporium 41, 216 Claviceps purpurea 216 Clostridium 30, 207, 225, 250 Corynebacterium 30, 92, 215 Cryptococcus 41 Cryptosporidium 62
Deuteromycetes 41, 216 Dientamoeba fragilis 67
Entamoeba 60c, 194 Enterobacter 143, 191, 225, 231 Enterococcus 199, 204, 234 Entomophthora 42 Epidermophyton 193 Erwinia 92, 215, 225 Erysiphe graminis 216 Escherichia 31, 148
-coli 92, 97, 142, 191, 199
Flavobacterium 207 Francisella 30 Fungi 33 Fusarium 41
Fusidium coccineum 80, 216 Fusobacterium 194
Giardia lamblia (Lamblia intestinalis) 64 Gluconobacter 92 Gymnosporangium 216
Haemophilus 31, 81
- influenzae 31, 124 Helicobacter 30, 195 Histoplasma capsulatum 42
Klebsiella 31, 124, 142c, 191, 225
Lactobacillus 92, 199 Lactococcus 79 Lamblia intestinalis 60c
Legionella 30 Leishmania 30, 60с Leptospira 194, 207 Leuconostoc 92 Lobosea 61
Malassezia 42 Micrococcus 209 Microsporum 42, 193 Mucor 34, 20
Mycobacterium 31, 111, 131, 143 Mycoplasma 9, 31, 194 Mycota 33
Neisseria 30, 81 Nitrobacter 23 Nitrococcus 23 Nitrosococcus 23 Nitrosomonas 23 Nitrosospira 23 Nitrospina 23 Nocardia 76, 79
Olpidium brassicae 216 Oomycetes 216
Paracoccidioides 39c Penicillium 216 -chrysogenum 75 - griseofidvum 80 -notatum 75, 142 Peptococcus 195 Phialophora 41 Phytium debarianum 216 Phytophtora infestans 216 Pityrosporum 193 Plasmodiophora brassicae 216 Plasmodium 59c Plasmopara viticola 216 Pneumocystis carinii 42 Propionibacterium 92 Proteus 31, 112, 124, 142, 191, 207 Protozoa 59 Providencia 233
Pseudomonas 30, 97, 112, 124, 142c, 191, 207, 215, 225
Ramilaria 216 Rhinosporidium 42 Rhizopus 34, 92 Rhodobacter 23 Rhodococcus 23 Rhodomicrobium 23 Rhodotorula 41 Rickettsia 31
Saccharomyces 34, 41, 199
Salmonella 31, 124, 142c, 191, 225
Sarcina 207
Sarcocystis 62
Sarcomastigophora 59
Sclerotinia 216
Serratia 124, 142c, 225, 233
Shigella 31, 233
Siderocapsaceae 23
Spirillum 30
Sporomusa 17
Sporosarcina 17
Sporothrix schenckii 41
Sporozoa 59
Staphylococcus 142, 234
-aureus 125, 142
- epidermidis 193 Streptococcus 125, 142, 193
-faecium 199
- pyogenes 195 Streptomyces 75c, 92, 97, 207
Thermoactinomyces 17 Thiobacterium 23 Thiocapsa 23 Thiothrix 23 Toxoplasma gondii 61 Treponema 30, 194 Trichomonas 64, 194 Trichosporon 60 Trichophyton 42, 142, 193 Trypanosoma 60c
Urocystis occulta 216 Ustilago 216
Veillonella 194 Verticillium 216 Vibrio 31,92
Xanthomonas 215
Yersinia 233
- enterocolitica 31, 249 -pestis 31
- pseudotuberculosis 31 Zygomycetes 42
fJ~f£? '' www.prospekMauki.ru, E-mail: info@prospektnauki.ru
Иммуно- и налобиотехнология: Учебное пособие. I В. А. Галынкин, О. И. Киселев, Н. А. Заикина и др. — СПб.: «Проспект Науки», 2008. — 224 с. ISBN 978-5-903090-16-7.
В книге представлены основные положения учения об иммунитете и вопросы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных, аллергических и других заболеваний. Описаны основные этапы получения классических вакцин и вакцин нового поколения, иммуномодуляторов, сывороток, иммуноглобулинов и моноклональных антител. Особое внимание уделяется вопросам качества иммунопрепаратов и безопасности их производства в соответствии с требованиями GMP. Книга предназначена для биотехнологов, микробиологов, инфекционистов и других специалистов, работающих в области производства и применения иммунопрепаратов, она
служит пособием при изучении курса иммунологии и биотехнологии.__________________________________
Вопросы обшей вирусологии: Учебное пособие. / Под ред. О. И. Киселёва и И. Н. Жилинской — СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова, 2007. — 374 с. ISBN 978-5-94542-209-4. Эксклюзивный продавец — «Проспект Науки».
Представлены данные о природе вирусов, их новейшая классификация. Проанализировано современное состояние проблемы вакцинации и перспективы ее развития. Рассмотрены вопросы общей иммунологии, основы антивирусного иммунитета, роль цитокинов в регуляции иммунологических процессов, особенности применения цитокинов в противовирусной терапии. Основу пособия составляют материалы лекций государственных сертификационных курсов по специальности «Вирусология», проводимых на базе ГУ НИИ гриппа РАМН совместно с СПбГМА им. И. И. Мечникова._______
Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов: Справочник. / В. А. Галынкин, Н. А. Заикина, В. И. Кочеровец, И. 3. Курбанова. — СПб.: «Проспект Науки», 2006. — 336 с. ISBN 5-903090-01-Х.
Книга содержит современные сведения о принципах изготовления питательных сред и их применения для выделения, идентификации и культивирования микроорганизмов разных таксономических групп с учетом их физиологических особенностей. Основное внимание уделяется видам, регламентированным для определения качества продукции пищевой и фармацевтической промышленности, с приложением справочника питательных сред, рекомендованных для этой цели. Книга предназначена микробиологам, эпидемиологам, биотехнологам и другим специалистам, занятым в сфере производства и микробиологического контроля качества продукции широкого
потреблении, а также студентам вузов и научным работникам._____________________________________
Санитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности / В. А. Галынкин и др. — СПб.: СПХФА, 2004. — 248 с. Эксклюзивный продавец — «Проспект Науки».
В книге рассматриваются микробиологические методы, регламентированные нормативной документацией для анализа гигиенических параметров производства и контроля качества продукции пищевой и фармацевтической промышленности. Показано значение микробиологического мониторинга производственной среды в соответствии с принципами системы анализа риска в критических контрольных точках и валидации как части системы обеспечения качества продукции. Книга предназначена для технологов пищевой и фармацевтической промышленности, микробиологов и специалистов, работающих в сфере государственного контроля и надзора за качеством продуктов
питания и лекарственных средств.______________________________________________________________
Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии с основами асептики и биотехнологии: Учебное пособие I В. А. Галынкин, Н. А. Заикина, Т. С. Потехина. — Курск: КГМУ, 2002. — 236 с. ISBN 5-7487-0563-Х. Эксклюзивный продавец — «Проспект Науки».
В книге изложены этапы практикума, которые студенты выполняют при прохождении курсов общей и санитарной микробиологии, основ промышленной асептики и биотехнологии, генетической и клеточной инженерии. Даны представления о современных методах обнаружения патогенных микроорганизмов и реакциях иммунитета. Рассматриваются методы промышленного культивирования микроорганизмов, основные параметры их роста и цитология развития некоторых продуцентов. Приведены основные сведения о генетической и клеточной инженерии и методах
генетического конструирования.________________________________________________________________
ИЗДАТЕЛЬСТВО «Проспект Науки» peklnauki.ru, E-mail: info@prospek Аннотированный указатель книг |
Основы биотехнологии высших грибов: Учебное пособие. / Н. А. Заикина, А. Е. Коваленко, В. А. Галынкин и др. — СПб.: «Проспект Науки», 2007. — 336 с. ISBN 978-5-903090-10-5.
Валерий Абрамович Галынкин, Надежда Александровна Заикина, Владимир Иванович Кочеровец, Татьяна Сергеевна Потехина, Наталья Дмитриевна Бунатян
ОСНОВЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Учебное пособие
Верстка И. А. Яблоковой Дизайн обложки Л. Л. Прядко
ООО «Проспект Науки» www.prospektnauki.ru e-mail: infofflprospektnauki.ru
Подписано в печать 04.02.2008. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 19,0. Тираж 1000 экз. (1-й завод 1...400). Заказ 37.
Отпечатано с готовых диапозитивов в ОАО «Петроцентр». Обособленное подразделение «Пушкинская типография». 196601, Санкт-Петербург, г. Пушкин, Средняя ул., 3/8.