Реферат Курсовая Конспект
ЧАСТ Ь II. АНТИМИКРОБНЫЕАГЕНТЫ - раздел Биология, Основы ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Глава 6. Антибиотики И Синтетические X И Vi Йо Ге Pa I Iе Вп1Ч Ески ...
|
Глава 6. АНТИБИОТИКИ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ
X И VI ЙО ГЕ PA I IЕ ВП1Ч ЕСКИ Е ПРЕПАРАТЫ
6.1. Антибиотики
Термин «антибиотический» впервые употребил в 1889 г. Поль Вюп- емен, говоря об антагонистических взаимоотношениях растений и животных. В 1942 г. Ваксман определил антибиотик как «химическое вещество, произведенное микроорганизмами, которое способно угнетать рост или даже разрушать другие микроорганизмы в разбавленных растворах». Это вторичные метаболиты, которые необходимы их продуцентам для выживания в условиях конкуренции с другими микроорганизмами.
Помимо антимикробной активности они могут обладать другими фармакологическими свойствами: действовать как иммунодепрессанты, ингибиторы ферментов, противоопухолевые и цитотоксические средства, инсектициды и гербициды. К настоящему времени описано около 20000 антибиотических веществ, однако, в клинике используется не более 160 антибиотиков, из них 30 % составляют природные продукты, 30 % - полусинтетические и остальные - синтетические. Химический синтез часто бывает экономически более выгодным для получения аналогов природных соединений, чем биосинтез. Однако биосинтез незаменим для получения природных продуктов, предшественников полусинтетических антибиотиков и ферментов, необходимых для энзиматической трансформации природных или синтетических соединений. Постоянное появление микроорганизмов, устойчивых к антимикробным агентам, требует изыскания новых продуцентов и новых антимикробных препаратов. Современные антимикробные препараты весьма разнообразны по структуре, механизму действия и спектру антимикробной активности.
По спектру действия антибиотики подразделяют на противовирусные, антибактериальные, антифу н гал ьные, антипротозойные. Некоторые из них обладают широким спектром действия, другие активны против определенных групп микроорганизмов, например, только против грампо- ложительных бактерий. Антибиотики весьма разнообразны по структуре и механизму действия.
6.1.1. Р-лактамные антибиотики
Пенициллины. Природные (бензилпенициллин G, феноксиметил- иенициллин или пенициллин V) синтезируются при ферментации Penicillium notatum и P. chrysogenum. Полусинтетические являются производными основы молекулы пенициллина - 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК), в которых боковая цепь представлена различными радикалами, введенными путем ацилирования 6-АПК. В отличие от природного бензилпенициллина многие полусинтетические пенициллины не разрушаются в кислой среде желудка и могут быть использованы перорально (оксациллин, клоксациллин, ампициллин, амоксициллин и др.). Безатин, бенетамин, прокаин медленно освобождают пенициллин, длительное время поддерживая его высокую концентрацию в крови, поэтому не требуют многократного введения в организм больного. Эфиры карбенициллина и ампициллина подвергаются ферментному гидролизу после абсорбции из слизистой оболочки кишечника и создают высокий уровень активного антибиотика в крови.
Метициллин, оксациллин, клоксациллин, флуклоксациллин и др. устойчивы к действию микробной р-лактамазы (пенициллиназы). Имеются препараты, активные как против грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов, включая Pseudomonas aeruginosa - бактерии, высокорезистентной к многим антибактериальным агентам.
Мециллинам, б-(3-амидинопенициллановые кислоты и их эфир пив- мециллинам имеют необычный спектр антибактериальной активности: не действуют на грамположительные микроорганизмы, как классические пенициллины, а лишь на грамотрицательные.
Цефалоспорины (цефемы), подобно пенициллинам, относят к группе [3-лактамных антибиотиков. Они имеют более широкий спектр действия по сравнению с пенициллинами и более устойчивы к (3-лактамазам. Люди, страдающие аллергией к пенициллину, обычно не чувствительны к цефемам. Продуцентом природного антибиотика цефалоспорина С является гриб Acremonium chiysogenum, первоначально названный Cephalosporium acremonium. На основе природного антибиотика получены многочисленные полусинтетические препараты.
Клавамы. Клавулановая кислота, продуцентом которой является Streptomyces clavuligerus, обладает низкой антибактериальной активностью, но является сильным ингибитором р-лактамазы. В клинической практике используют комбинированные препараты клавулановой кислоты с амоксициллином или тикарциллином, обладающие широким спектром действия и не чувствительным к р-лактамазе.
В 1-оксацефемах химическая модификация молекулы делает соединение более стабильным. К этой группе принадлежит латамоксеф - антибиотик широкого спектра, устойчивый к Р-лактамазам.
Карбапенемы являются аналогами пенициллинов или клавамов, у которых атом серы (пенициллинов) или кислорода (клавамов) замещен углеродом. К ним принадлежат оливановые кислоты, продуцируемые Streptomyces olivaceus - антибиотики широкого спектра, сильные ингибиторы (3-лактамаз, а также тиенамицин, обладающий такими же свойствами, но нестабильный. Его производные N-формимидоилтиенамицин лишен этого недостатка.
Нокардицины продуцируются Nocardia sp., наиболее активен антибиотик широкого спектра нокардицин А
Монобаюпамы - это моноциклические (3-лактамы, не содержащие тиазолидинового кольца, синтезируются различными штаммами бактерий. Из антибиотиков этой группы наиболее эффективным оказался азт- реонам, действующий на многие грамотрицательные бактерии и устойчивый к (i-лактамазам, однако, не обладающий активностью по отношению к бактероидам и грамотрицательным анаэробам.
Другие {3-лактамы. Производные пенициллановой кислоты, например, сульфон- и бромопенициллановые кислоты являются ингибиторами некоторых типов (3-лактамаз.
6.1.2. Тетрациклины
Тетрациклины продуцируются некоторыми видами стрептомицетов, а также получаются как полусинтетические препараты. Хлортетрациклин образуется при ферментации S. aureofaciens, из него путем каталитического гидрогенизирования получают тетрациклин и кломоциклин. Химическая модификация тетрациклина дает миноциюшн. Окситетрациклин продуцируется S. rimosus, из него получают метациклин, гидрогенизация которого дает доксициклин. Мутант Str. aureofaciens продуцирует метил- хлортетрациклин. Тиатетрациклины, например, тиациклин, содержат атом серы в 6-м положении молекулы, активны против бактерий, устойчивых к тетрациклину. В настоящее время природные тетрациклины практически не применяются, их вытеснили полусинтетические препараты (доксициклин и миноциклин).
Тетрациклины - антибиотики широкого спектра. Резистентность к ним развивается относительно медленно. Однако, существует перекрестная резистентность, т. е. микроорганизм, устойчивый к одному из тет- рациклинов, устойчив также ко всем членам этой группы.
Следствием употребления тетрациклинов может быть дисбактериоз.
Глициклины - новая группа аналогов тетрациклина. Активны против бактерий, устойчивых к другим тетрациклинам, резистентность которых связана с активным выбросом антибиотика.
6.1.3. Рифамицины
Рифамицины в виде комплекса антибиотиков продуцирует Streptomyces mediterranei, из них наиболее перспективен рифамицин В, на основе которого создан полусинтетический аналог рифампицин - антибиотик широкого спектра действия. Резистентность развивается довольно быстро, поэтому его рекомендуют использовать ограниченно, в основном при микобаюгериозах. Препарат плохо всасывается при приеме внутрь, поэтому применяется парентерально или местно.
6.1.4. Аминогликозидиые антибиотики
Это большой класс соединений, образуемых некоторыми актино- мицетами и бациллами. Аминогликозиды содержат в своей структуре аминосахара: дезоксистрептамин - в молекулах неомицина, фрамицети- на, гентамицина, канамицина, тобрамицина, амикацина, нетилмицина, си- зомицина и стрептидин в молекулах стрептомицина и дигидрострепто- мицина. Аминоциклитолстрептомицин не имеет углеводного компонента. Это антибиотики широкого спектра действия. Стрептомицин и кана- мицин эффективны при туберкулезе. Аминогликозиды слабо действуют на стрептококки, не действуют на энтерококки, провиденции, бактероиды и другие анаэробы.
Гентамицин широко используется при лечении тяжелых бактериальных инфекций. Паромомицин активен против Entamoeba histolytica и используется при лечении кишечного амебиаза и острой бактериальной дизентерии.
Модификация аминогликозидных антибиотиков позволяет получить препараты, устойчивые к инактивирующему действию ферментов резистентных штаммов микроорганизмов (нетилмицин).
6.1.5. Макролиды
Молекулы макролидов содержат большие лактонвые кольца, соединенные с аминосахарами гликозидными связями. Оказывают преимущественно бактериостатическое действие против грмположительных кокков, микоплазм, хламидий, легионелл. Способны создавать высокие концентрации в тканях, обладают низкой токсичностью, не дают переркест- ных аллергических реакций с Р-лактамами. Наиболее важные представители этой группы - эритромицин, олеандомицин, триацетилолеандоми- цин, спирамицин, мидекамицин, фиозамицин; различаются по активности против отдельных возбудителей инфекционных заболеваний, стабильности и переносимости, что определяет показания к их применению.
6.1.6. Линкозамиды
Линкомицин и клиндомицин активны против грамположительных кокков, кроме Enterococcus faecalis. Не действуют на энтеробактерии.
6.1.7. Стрептограмины
Пристинамицин представляет собой смесь двух синергидно действующих компонентов - макролида (I) и депсипептида (II). Новые антибиотики - кинупристин и далфопристин представляют собой производные пристинамицина (I) и (II), соответственно. Антибиотики вводят внутривенно совместно в соотношении 30:70 при тяжелой бактериемии Enterococcus faecalis, резистентного к ванкомицину.
6.1.8. Полипептидные антибиотики
Полипептидные антибиотики представляют довольно разнообразную группу соединений, синтезируемых бациллами и актиномицетами. Они включают бацитрацин, активный против грамположительных и грам- отрицательных кокков, но не бактерий; полимиксины, активные против многих грамотрицательных бактерий, исключая Serratia marcescens и Proteus spp.; капреомицин и виомицин, действующие на Mycobacterium tulerculosis.
Бацитрацин из-за высокой токсичности разрешен к применению только местно или в случаях крайней необходимости.
Полимиксины обладают нефротоксичностью, в меньшей степени токсичны полимиксины В и Е (колистин). Для парентерального введения используют сульфометат натрия кол истина. Натрия сульфомиксин - смесь сульфометилированного полимиксина В и натрия бисульфита менее токсичен, чем полимиксина В сульфат при сохранении его активности.
6.1.9. Гликопептиды
В данную группу входят ванкомицин (продуцент-Nocardia oriental is) и тейкопланнн, ранее применявшийся препарат ристомицин не используется в связи с высокой токсичностью. Главное клиническое значение гли- копептидов заключается в их активности против полирезистентных стафилококков и энтерококков.
' 6.1.10. Катионные пептиды
Это новый класс антибиотиков, получаемых как из природных источников, так и химическим синтезом. В природе они присутствуют повсюду - у бактерий, грибов, растений, животных и человека. У человека катионные пептиды (дефенсины) представлены группой пептидов, содержащих от 23 до 35 аминокислот; присутствуют в лейкоцитах и других тканях, активны против бактерий, простейших, грибов и вирусов, обладают хемотаксической активностью. У растений это тионины, которые образуются в ответ на инфекцию, активны против некоторых бактерий и грибов. У бактерий они выполняют функции бактериоцинов: колицин Е. coli, низин Lactococcus lactis, субтиллин В. subtilis и др. Они менее активны по сравнению с другими антибиотиками, однако, действуют на устойчивые к другим антибиотикам штаммы, вызывают быструю гибель микроорганизмов, индуцируют развитие резистентности.
Катионные пептиды нейтрализуют отрицательный заряд липополи- сахаридов бактерий, связываются с ними, препятствуя их взаимодействию с клетками организма, предотвращая, таким образом, развитие эндоток- сического шока у пациентов.
Катионные пептиды слабоиммуногенны, так как имеют общие антигены с макроорганизмом. Разрушаются пептидазами кишечника, поэтому не попадают в окружающую среду.
Мупироцин (псевдомоновая кислота А) - основной продукт ферментации Pseudomonas fluorescens. Активен против стафилококков и некоторых стрептококков, не действует на Enterococcus faecalis и грамотрицательные бактерии. В основном используется для ликвидации носитель- ства на коже и в полости носа штаммов Staphylococcus aureus, устойчивых к метициллину.
Низин получают при ферментации L. lactis или рекомбинантного штамма В. subtilis, используют для консервации пищевых продуктов, для лечения мастита у коров.
6.1.11. Другие антибактериальные антибиотики
Описанные ниже антибиотики не могут быть отнесены ни к одной рассмотренной ранее группе.
Хлорамфеникол (левомицетин), синтезируемый S. venezuelae, антибиотик широкого спектра, оказывает только бактериостатическое действие, активен против спирохет, риккетсий, хламидий. У части пациентов вызывает апластическую анемию, поэтому рекомендован к применению только при отсутствии альтернативных средств. Его фторированные производные активны против резистентных микроорганизмов.
Фузидиевая кислота, выделяется из культуры гриба Fusidium cocci- neum, используемая в форме натриевой соли, активна против грамположительных бактерий, особенно стафилококков, хотя стрептококки относительно устойчивы. Действует на полирезистентные штаммы стафилококков, однако, и к этому препарату могут появляться устойчивые формы бактерий.
Линкомицин (продуцент S. lincolniensis) и его синтетический аналог клиндамицин по спектру активности сходны с макролидами, однако, не эффективны в отношении Е. coli. Применение клиндамицина сопряжено в риском чрезмерного размножения в кишечнике Clostridium difficile - возбудителя диарейной инфекции. Возможна перекрестная резистентность между линкомицинами и эритромицином,
6.1.12.Антифунгальные антибиотики
В отличие от большого разнообразия антибактериальных антибиотиков, имеется лишь небольшое количество антифунгальных антибиотиков для системного применения.
Гризеофульвин продуцируется Penicillium griseofulvum, активен против дерматофитов, не действует на Candida spp. и бактерии. Применяется орально в форме таблеток. Проникает в глубокие слои кожи и кератин волос, поэтому эффективен при терапии дерматомикозов.
Полиены. Полиеновые антибиотики продуцируются стрептомице- тами, характеризуются наличием в своей структуре большого лактонного кольца и гидрофобной области, состоящей из последовательности от 4 до 7 конъюгированных двойных связей. Наиболее важные из них - амфоте- рицин В и нистатин.
Нистатин активен против Candida spp. и применяется при кандидо- зе ротовой полости и желудочно-кишечного тракта, поскольку плохо
всасывается из кишечника и неэффективен при других формах кандидоза.
Амфотерицин В эффективен при системных микозах. Плохо всасывается из кишечника, поэтому его вводят внутривенно под строгим медицинским контролем, учитывая его нефротоксичность. Метиловый эфир амфотерицина менее токсичен с сохранением антифу нгальной активности.
Эхинокандины - новый класс антибиотиков, представленный многочисленными продуктами ферментации Aspergillus nidulans и A. rugulosus и их полусинтетическими аналогами. Активны против грибов рода Candida, Aspergillus, Pneumocystis. Это семейство циклических липопеп- тидов, различающихся боковыми радикалами (остатками жирных кислот) у гексапептидного кольца. Считают, что в ближайшем будущем они найдут клиническое применение.
6.2. Синтетические химиотерапевтические препараты
Сульфонамиды - большая группа химиотерапевтических веществ, действуют на стрептококки, Е. coli, Proteus mirabilis, обычно неактивны в отношении Pseudomonas aeruginosa, индолположительных штаммов протея и Klebsiella spp. Резистентные штаммы появляются у Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Neisseria honorrhoea, N. meningitidis, E. coli, Proteus mirabilis и др. Сульфонамиды различаются по способности всасываться из желудочно-кишечного тракта, например, сульфадимидин и сульфадиазин всасываются быстро, тогда как сукцинилсульфатиазон и фталилсульфатиазол - очень плохо. Их используют при лечении различных инфекционных заболеваний, вызванных грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами.
Производные дисшинопиримидина составляют группу веществ с противоопухолевой (метотрексат), антипротозойной (пириметамин) и антибактериальной (триметоприм, тетроксоприм) активностью. Последние обладают широким спектром действия, однако, к ним появляются резистентные формы бактерий.
Дапсон (диаминодифенилсульфон) применяется для лечения лепры. Для предупреждения развития резистентности возбудителя его используют в комбинации с рифампицином и клофазимином.
Производные изоникотиновой кислоты (изониазид, этионамид, протионамид) как и парааминосалициловая кислота эффективны против микобактерий, применяются при туберкулезе. Этионамид менее активен, чем изониазид, однако действует на устойчивые к изониазиду штаммы бактерий. Протионамид по активности не отличается от этионамида, но лучше переносится больными.
Пиразинкарбоновой кислоты амид - пиразшитид действует на туберкулезные бактерии, устойчивые к другим противотуберкулезным препаратам.
Соединения нитрофураиа. Синтезировано несколько сотен соединений нитрофурана, однако, терапевтическими свойствами обладают лишь немногие из них
Нитрофураны действуют на широкий спектр микроорганизмов. Фуразолидон высокоэффективен против энтеробактерий и применяется при лечении диареи и желудочно-кишечных расстройств бактериальной этиологии. Нитрофурантион используют при инфекции мочевыводящих путей, поскольку препарат концентрируется в моче. Он наиболее активен при кислом значении рН. Нитрофуразон в основном используют местно при обработке ран и ожогов, а также некоторых типов заболеваний уха.
Хинолоны. Налидшсовая кислота применялась некоторое время для лечения инфекций мочевого тракта. Она действует только на грамотрицательные бактерии. Хинолоны II поколения (ципрофлоксацин, норфлокса- цин и др.) применяются при лечении системных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Хинолоны III поколения (спарфлокса- цин, левофлоксацин) активны против пневмококков, хламидий, микоп- лазм. Моксифлоксацин (препарат IV поколения) действует на неспорооб- разующие анаэробы (Bacteroides fragilis).
Производные имидазола. Метронидазол угнетает рост патогенных простейших, например, Trichomonas vaginalis и Entamoeba hystolyticum. При оральном применении высокоэффективен при урогенитальных инфекциях, вызванных Т. vaginalis. Эффективен против анаэробных бактерий и факультативных анаэробов в анаэробных условиях. Вводится орально или в форме суппозиториев.
Клотримазол, миконазол, эконазол, кетоконазол активны против патогенных грибов и некоторых бактерий, применяются местно. Не отмечено развития резистентности in vitro или in vivo.
5-фторцитозин с наибольшей активностью действует на дрожжевые грибы - Candida и Cryptococcus.
Синтетические аллилалшны. Тербииафии действует как ингибитор скваленэпоксидазы, участвующей в биосинтезе эргостерола у грибов. Активен при пероральном применении в отношении многих видов дер- матофитов и дрожжей. Может применяться местно в виде кремов.
Синтетические кароиматы. Толнафрат используется местно при лечении или профилактике дерамтофитии.
6.3. Полимерные производные антимикробных препаратов
Полимеризация антимикробных препаратов позволяет получить соединения с улучшенными свойствами (феноксиметилпенициллин, устойчивый к р-лактамазе, спирамицин пролонгированного действия, ген- тамицин с пониженной токсичностью и др.). Полимерные антисептики на основе поверхностноактивных соединений отличаются значительно меньшей токсичностью по сравнению с исходными веществами (катапол).
Глава 7. ПРОИЗВОДСТВО ХИМИОТЕРЛПЕВТИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
7.1. Общие представления о промышленном производстве
лекарственных препаратов
Промышленное производство лекарственных препаратов включает широкое использование машин, аппаратов, поточных механизированных и автоматизированных линий. Оно предусматривает массовый, серийный выпуск препаратов по стандартным прописям, рассчитанным на среднего потребителя.
Укрупненное фармацевтическое производство состоит из комплекса специализированных цехов. Цех - основное производственное подразделение, специализированное для выполнения однородных процессов (дробильный, экстракционный, фасовочный и т. д.) или для выпуска однотипной продукции (таблеточный, ампульный, аэрозольный и др.). Каждый цех имеет несколько участков, где осуществляются однотипные операции, составляющие технологический процесс. Например, таблеточный цех имеет участки смешивания ингредиентов, гранулирования, сушки гранулята, прессования и др.
Работа промышленных предприятий характеризуется строгой регламентацией и планированием производства. Производственный процесс проводится в определенных стандартных условиях, предусмотренных точными инструкциями, объединенными в одни сводный документ - регламент. Регламент представляет собой совокупность правил, определяющих порядок деятельности фармацевтического предприятия по выпуску готовой продукции. В нем дается характеристика исходных продуктов, полуфабрикатов и готового продукта, указаны последовательность стадий технологического процесса, режим обработки материалов по стадиям, аппаратурная схема, методы анализа, правила по технике безопасности, производственной гигиене и другие условия производства. Регламент является законом производства, отступление от него недопустимо. За соблюдением регламента следит отдел технического контроля.
В фармацевтическом производстве технологические процессы подразделяются на химические, связанные с химическим синтезом лекарственных веществ, и физические. К последним относятся механические, связанные с обработкой твердых материалов (измельчение, просеивание, смешивание, дозирование, прессование), гидромеханические (перемешивание жидкостей, эмульгирование, фильтрование), тепловые (испарение, конденсация, плавление), массообменные (растворение, кристаллизация, сушка, экстракция, ректификация). Все эти процессы требуют соответствующего аппаратурного оформления, т. е. выполняются с использованием специальных машин и аппаратов.
Основным исходным материалом для изготовления лекарственных препаратов являются лекарственные вещества, которые могут быть получены путем химического или биологического синтеза, а также путем переработки лекарственного растительного сырья или тканей и органов животных.
Лекарственные препараты имеют определенную лекарственную форму, т. е. удобное для применения состояние. Существуют твердые (порошки, таблетки, гранулы), жидкие (растворы, суспензии, эмульсии) и мягкие (мази, суппозитории) лекарственные формы.
Этапы химического синтеза определенного лекарственного вещества могут включать процессы смешивания ингредиентов реакции, их термической обработки, экстракционного или хроматографического разделения продуктов реакции, упаривания, кристаллизации, сушки и т. п.
Основные этапы микробиологического синтеза антибиотиков, ферментов, органических кислот и т. п. показаны на схеме (рис. 9).
Из лекарственного растительного сырья готовят сборы, порошки, настойки, экстракты, а также получают максимально очищенные экстракционные препараты или препараты индивидуальных веществ.
Из животного сырья получают гормоны, ферменты и препараты неспецифического действия. Они могут представлять собой высушенные, обезжиренные и измельченные ткани или экстракты (максимально очищенные или препараты индивидуальных веществ).
В основу гомеопатической фармации положен принцип потенцирования (динамизации) - особая технология приготовления гомеопатических лекарств. Сущность этого принципа состоит в том, что процесс включает в себя поэтапное снижение концентрации исходного гомеопатического вещества в носителе (растворе или порошке) в 10 или 100 раз на каждом этапе путем интенсивного встряхивания, растирания и перемешивания. В результате получают препараты, в которых содержание исходной субстанции снижено до ничтожных значений.
Для современной фармацевтической промышленности характерно непрерывное совершенствование и комплексное применение новых технологических подходов, основанных на понимании механизма действия
Рис. 9. Этапы получения продуктов микробиологического синтеза |
и фармакологического эффекта лекарственного вещества и направленных к общей цели - созданию более эффективных и безопасных медицинских препаратов.
Современное фармацевтическое производство требует от персонала понимания смысла и значения каждой ступени технологического процесса и строгого контроля выполнения требований регламента. В связи с этим центральное место в общем направлении развития фармацевтической технологии наряду с химией и биотехнологией принадлежит микробиологии, научный поиск и развитие этих направлений определяют успех развития всей отрасли.
Существенная часть требований к качеству фармацевтической продукции и к условиям производства контролируется микробиологом: стерильность, микробная контаминация сырья и нестерильных лекарственных средств, соблюдение правил производственной гигиены, предусмотренных GMP. Эти требования должны быть хорошо известны всем участникам производственного процесса и неукоснительно соблюдаться с осознанием важности тщательного выполнения каждого из них.
С появлением фармацевтических препаратов, получаемых с использованием методов генетической инженерии, более 80 % стерильных лекарственных форм готовят асептично, поскольку эти вещества лабильны и не могут быть простерилизованы в готовом виде. Лекарственные препараты, приготовленные с использованием асептичной технологии, превосходят по своему качеству препараты, производимые ранее.
Техникой работы в асептичных условиях должны владеть не только микробиологи, но и химики, а также весь персонал, от которого зависит выпуск микробиологически безопасной продукции.
7.2. Производство антибиотиков
Получение препаратов антибиотиков - сложный и многоступенчатый процесс. Он слагается из комплекса последовательных исследований, которые можно свести в основном к следующим этапам:
1.) изыскание микроорганизмов-антагонистов в природе и выделение их в чистую культуру;
2) изучение спектра действия и определение антибиотической активности выделенных культур антагонистов;
3) подбор условий культивирования продуцентов антибиотиков;
4) первичная идентификация антибиотика на ранних этапах изучения;
5) выделение и химическая очистка активно действующего начала из культуральной жидкости и клеток, а также сравнение полученного антибиотика по оиологическим и химическим показателям с уже известными препаратами для выявления новых свойств полученных веществ;
6) изучение механизма действия и испытание токсических и лечебных качеств антибиотиков на животных;
7) разработка технологии получения антибиотика в лаборатории и внедрение ее в промышленное производство;
8) получение из исходных штаммов новых генотипов микроорганизмов, обладающих повышенной активностью, путем мутаций и рекомбинаций методами генетической и клеточной инженерии. Для получения новых антибиотиков помимо изыскания новых или
генетически измененных продуцентов используют следующие методические подходы:
1. Получение из исходного антибиотика препарата с новыми свойствами путем химической или биохимической модификации его молекулы;
2. Направленный биосинтез путем биохимической модификации структуры, полученной химическим методом;
3. Химический синтез с использованием природных структур в качестве шаблонов;
4. Мутасинтез. Этот метод включает следующие этапы:
a) получение мутантов - идиотрофов, требующих для образования антибиотика определенный фрагмент его молекулы (предшественник);
b) получение химическими методами аналога этого предшественника (мутасинтона);
c) культивирование идиотрофа на среде, содержащей мутасинтон. При этом идиотроф включает мутасинтон в молекулу продуцируемого им антибиотика. В результате получаются новые (мутасинтетичес- кие) структуры.
5. Получение гибридных антибиотиков, т.е. веществ, продуцируемых генетическими гибридами; гибридный антибиотик может содержать структуры двух различных метаболитов. От антибиотиков, получаемых перечисленными выше методами, они отличаются тем, что представляют собой продукт комбинации генов.
Основные этапы получения гибридных антибиотиков:
a) выбор продуцента, образующего известный антибиотик;
b) изыскание нового микроорганизма для гибридизации;
c) исследование биохимических путей синтеза антибиотика, интерме- диатов и ферментов;
d) определение генов, контролирующих образование ферментов биосинтеза и его регуляторов;
e) получение рекомбинантной ДНК, содержащей комбинацию генов, благоприятную для процесса биосинтеза;
f) клонирование новой генетической структуры в культуре реципиента;
g) химическое, микробиологическое и фармакологическое исследование нового антибиотика.
Природные антибиотики получают путем культивирования микроорганизма - продуцента с использованием методов биотехнологии. По объему выпускаемых антибиотиков антибиотическая промышленность является самым крупным биотехнологическим производством.
Цель любой биотехнологии - на базе понимания физиологических и генетических свойств продуцента получить максимальный выход конечного продукта. Необходимые для этого биотехнологические манипуляции реализуются в соответствующей аппаратуре. Управление процессами метаболизма продуцента может осуществляться следующими способами:
1) изменением состава питательной среды;
2) изменением условий внешней среды (температура, рН, аэрация);
3) конструкцией биореактора (ферментера);
4) регламентированием введения дополнительного субстрата;
5) фиксацией физиологического состояния культуры применением метода непрерывного культивирования;
6) использованием генетически модифицированных штаммов продуцента.
Реализация этих способов требует специальных инженерно-технологических подходов, обеспечивающих биохимическую регуляцию биосинтеза при сохранении свойств популяции продуцента (отсутствие повреждений клеток, автолиза, инфекции и др.).
Ферментация антибиотиков, как правило, аэробный процесс, требующий подачи воздуха в ферментационную среду и перемешивания. В антибиотической промышленности преимущественно применяют биореакторы объемом от 30 до 200 м3 с механической мешалкой, снабженные системой автоматического контроля и управления процессом ферментации. Температуру ферментации (обычно 24-26 °С) обеспечивает система охлаждения. После ферментации биомассу отделяют, антибиотик выделяют из фильтрата (для некоторых антибиотиков - из клеток продуцента) путем экстракции, ионообмена, ультрафильтрации, осаждения и кристаллизации. Процесс подготовки посевного материала, ферментации и многие из дальнейших операций проводят в асептических условиях.
Культура продуцента. Исходный штамм микроорганизма, продуцирующего антибиотик или другие БАВ, выделяют из природных источников (почва, растительные субстраты и др.) специальными методами скрининга; природный (дикий) штамм обладает низкой активностью, поэтому требуется длительная генетико-селекционная работа, обычно с применением мутагенов для повышения его активности. Полученный производственный штамм хранится в состоянии анабиоза (например, при низкой температуре в лиофилизированном состоянии). Такая культура может быть возвращена в активное состояние путем посева на соответствующую питательную среду и использована для приготовления посевного материала.
Приготовление посевного материала. Культуру с поверхности косого агара асептично переносят в колбу с посевной средой. При работе с грибами и актиномицетами используют споровый посевной материал (500-5000 спор на 1 л среды). Колбы инкубируют в термостате на качалке. Материал из колб переносят в инокулятор объемом 0,5-1 м3 (0,1% посевного материала от объема среды) и выращивают от 2 до 4 сут. Далее посевной материал асептично переносят в посевной ферментатор объемом 5-20 м3 (10-12 % инокулята от объема питательной среды, время культивирования от 1 сут.). Постоянно отбирают пробы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5-20 % от объема питательной среды. Ступенчатая подготовка посевного материала позволяет получить его в количестве, необходимом для обеспечения быстрого и продуктивного роста в биореакторе, и поддерживает культуру в фазе логарифмического роста.
Питательная среда конструируется таким образом, чтобы обеспечить быстрый рост микроорганизма в начальной стадии и максимальный выход продукта в конце ферментации. Среду стерилизуют паром под давлением при 120-140 °С непосредственно в ферментаторе или в специальной установке непрерывной стерилизации.
Ферментация. Ферментер и систему трубопроводов перед заполнением средой моют, проверяют на герметичность и стерилизуют острым паром. Для обеспечения стерильности часто применяют предварительную обработку ферментера химическими дезинфицирующими веществами.
Количество стерильной охлажденной питательной среды в ферментере не должно превышать 70 % от его объема. Через линию посевного материала с помощью стерильного воздуха в ферментатор вводят посевной материал. Температура и рН питательной среды до подачи посевного материала должны быть доведены до оптимальных значений для данной культуры.
Ферментацию проводят при аэрации путем подачи стерильного воздуха и перемешивании, которое способствует растворению кислорода в жидкой среде и полному контакту клеток с питательными веществами. Для предотвращения попадания нестерильного атмосферного воздуха в аппарат давление воздуха над поверхностью жидкости повышают до 20-30 кПа (0,2-0,3 кгс/см3). При необходимости вводят химические пе- ногасители.
Во время ферментации автоматически регулируются температура и рН среды, по специальной программе вводятся добавочные компоненты питательной среды. Систематически берут контрольные пробы жидкости из ферментера, в которых определяют необходимые физико-химические показатели, активность и отсутствие посторонних микроорганизмов.
Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное количество полезного продукта. По окончании ферментации культу- ральную жидкость охлаждают до 10-25 °С и перекачивают в резервуары, из которых она подается на дальнейшую обработку.
Способы выделения и очистки антибиотиков индивидуальны и определяются его физико-химическими характеристиками. Например, пенициллин выделяют из культуральной жидкости экстракционным методом, стрептомицин - методом ионообменной хроматографии.
7.3. Микроорганизмы как продуценты биологически активных
веществ и биоиндикаторы
Микроорганизмы и синтезируемые ими вещества широко используются в фармацевтическом производстве и в аналитических целях. Помимо антибиотиков и иммунобиопрепаратов они служат для получения декстранов, витаминов, аминокислот, органических кислот, ферментов, железохелирующих агентов и других препаратов, применяющихся в медицинской практике (табл. 12). Микробная трансформация является необходимым этапом при получении ряда лекарственных веществ (стероидов, антибиотиков и др.). Ауксотрофные штаммы применяют для определения некоторых витаминов и аминокислот. Особые мутантные штаммы предложены для быстрого определения канцерогенной и мутагенной активности химиотерапевтических препаратов. Микроорганизмы могут служить модельными системами на начальном этапе исследования метаболизма лекарственных веществ. При испытании стерильности пенициллинов и цефалоспоринов фармакопея рекомендует применение Р-лактамазы для инактивации антибиотиков.
Получение рекомбинантных штаммов методами генетической инженерии расширяет возможности использования микроорганизмов в фармацевтической практике.
Таблица 12
|
Некоторые БАВ, продуцируемые микроорганизмами |
Окончание табл. 12
|
Глава 8. ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Генетическая инженерия или технология рекомбинантной ДНК основана на конструировании фрагментов ДНК in vitro с последующим введением новых (рекомбинантных) генетических структур в живую клетку и их экспрессией. Техника генетической инженерии используется при исследовании строения генов высших организмов, разработке методов генной терапии, методов молекулярной диагностики. Технологию рекомбинантной ДНК используют для создания новых продуцентов антибиотиков, производящих антимикробные препараты с измененными свойствами. Генетическая инженерия дает возможность получать препараты крови от трансгенных животных, производить белки человека путем культивирования рекомбинантных штаммов микроорганизмов.
8.1. Методы генетического конструирования микроорганизмов in vitro
Типовой эксперимент в генетической инженерии состоит из следующих этапов: 1) получение фрагментов ДНК; 2) конструирование in vitro рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, полученных на первом этапе, и векторов - небольших автономно реплицирующихся в клетке-реципиенте структур (плазмид, фагов, вирусов); 3) введение рекомбинантных ДНК в клетку-реципиент; 4) отбор клонов, несущих нужную рекомбинантную ДНК.
Источники ДНК для клонирования. Существуют три источника молекул ДНК, используемых в генетической инженерии: фрагменты генетического материала различных организмов; ДНК, полученная путем химико-ферментативного синтеза; ДНК, комплементарная мРНК (кДНК). Получение кДНК необходимо для экспрессии в бактериях генов белков человека: гены эукариот содержат интроны, а в клетках бактерий отсутствует механизм, обеспечивающий сплайсинг, поэтому используя в качестве матрицы зрелую мРНК (не содержащую интронов), получают кДНК, состоящую из последовательностей нуклеотидов, соответствующих экзонам.
Рестриктазы. Ферменты рестриктазы являются необходимым инструментом при манипулировании с генами. Это специфические эндонук- леазы, которые являются составной частью системы рестрикции - модификации прокариотических клеток, обеспечивающей их защиту от проникновения чужеродной ДНК. Рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности нуклеотидов и расщепляет ее на фрагменты (рестрикты).
Особую ценность представляют рестриктазы, под действием кото- рык образуются фрагменты с самокомплементарными липкими концами: они эффективно используются при конструировании рекомбинантных молекул.
Методы воссоединения фрагментов ДНК. Для соединения фрагментов ДНК, полученных после обработки рестриктазой, используют отжиг, в результате которого образуются водородные связи между комплементарными основаниями липких концов, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами. Наличие липких концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Имеются ферменты, способные соединять полностью двунитевые фрагменты, однако эта реакция протекает лишь при высоких концентрациях ДНК и лигазы.
При объединении ДНК донора и вектора при отжиге и лигировании образуются не только гибридные молекулы, но и исходные векторы, что затрудняет дальнейшую работу по клонированию ДНК донора. Поэтому разработаны специальные методы, позволяющие направить процесс преимущественно на получение гибридных молекул. Один из них основан на ращеплении ДНК вектора несколькими рестриктазами, чтобы уменьшить вероятность самосборки вектора. Другой эффективный метод заключается в отщеплении концевых фосфатных групп от линейной ДНК вектора при действии щелочной фосфатазы. Образование лигазой кольцевых молекул ДНК в этом случае возможно только в присутствии фрагментов до- норной ДНК, имеющих неповрежденные 5'-фосфатные группы.
Идентичные взаимокомплементарные концы двух молекул ДНК, подлежащих объединению, могут быть получены при гидролизе этих молекул одной и той же рестриктазой. Однако часто возникает необходимость клонировать фрагменты ДНК, полученные расщеплением одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рест- риюгазы. Для этого существует метод, позволяющий рекомбинировать практически любые фрагменты ДНК. Он предусматривает использование линкеров - коротких синтетических двухцепочечных олигонуклео- тидов, имеющих сайты узнавания для определенной рестриктазы. Линкеры пришивают с помощью лигазы по концам молекулы ДНК, подлежащей клонированию, и обрабатывают рестриктазой, в результате чего образуются липкие концы. Этой же рестриктазой гидролизуют молекулу вектора. В результате отжига и обработки лигазой получают рекомбинант- ные молекулы ДНК.
Линкерная молекула может иметь больше, чем один сайт узнавания рестриктазой. Тогда ее называют полилинкером или адаптером. Применение таких молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации ДНК универсальным, поскольку исходные фрагменты можно получить самыми различными способами.
Коннекторный метод воссоединения фрагментов основан на свойстве фермента - терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы - достраивать нуклеотидные последовательности к З'-ОН-концам фрагментов ДНК. К концам одного из соединяемых фрагментов ДНК присоединяют однонитевой полинуклеотид, например, поли-А (dA), а к концам другого - комплементарный ему, например, поли-Т (dT). Достроенные таким образом фрагменты смешивают и отжигают. Возможные бреши ликвидируют обработкой ДНК-полимеразой и лигазой, в результате чего получают ковалентно замкнутые кольцевые молекулы.
Векторы. Векторами называют молекулы ДНК, способные переносить в клетку-реципиент чужеродную ДНК и обеспечить ее экспрессию. В векторные молекулы с помощью ферментов встраивают определенные гены. Такие молекулярные гибриды называются химерами или рекомби- нантными молекулами ДНК. Их вводят в реципиентные клетки, в результате чего происходит разделение молекул. Каждый из выделенных клонов содержит индивидуальную рекомбинантную ДНК. Эта процедура называется клонированием рекомбинантных молекул ДНК (клонированием генов).
Чтобы стабильно существовать в клетке, вектор должен быть реп- ликоном (автономно реплицироваться в клетке). Вектор должен иметь один или несколько маркеров, позволяющих фенотипически определять его присутствие в клетке-реципиенте. Для обеспечения воссоединения с ДНК донора в векторной молекуле необходимо присутствие сайтов расщепления рестриктазами, которые должны локализоваться в области, не существенной для репликации вектора. Кроме того важно, чтобы вектор допускал вставку донорной ДНК различной молекулярной массы и давал большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку ре- комбинантной ДНК. Лучше всего разработана система векторов для E.coli в качестве реципиента. Она включает следующие типы векторов: плаз- миды, бактериофаг 1, космиды, фазмиды и бактериофаг М13. Созданы векторы и для других микроорганизмов, в том числе важных для промышленности (Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces и др.). Особенно удобны двурепликонные (челночные) гибридные векторы, системы репликации которых принадлежат плазмидам, имеющим разных хозяев. Они способны реплицироваться в различных клетках, например, в E.coli, дрожжей или животных. Это позволяет все предварительные операции по клонированию проводить в E.coli с последующим перенесением рекомби- нантной ДНК в нужный объект.
Клетка-реципиент. Клетка-хозяин - это та среда, в которой может функционировать рекомбинантная молекула ДНК. В качестве реципиента рекомбинантной ДНК часто используют Escherichia coli - микроорганизм, хорошо изученный и применяющийся в разнообразных исследованиях в области генетики и молекулярной биологии. Но для целей биотехнологии Е. coli не представляется идеальным продуцентом по следующим причинам. Е. coli входит в состав нормальной микробиоты человека, поэтому опасно заражение обслуживающего персонала рекомбинантным штаммом с нежелательными для человека свойствами. Помимо этого E.coli чувствительна к фагам, образует пирогены и не выделяет продукты биосинтеза в культуральную среду, что затрудняет их очистку. Поэтому перспективны другие микроорганизмы - бациллы (Вас. subtilis, Вас. stearo- thermophilus, Вас. brevis), стрептомицеты, дрожжи (Saccharomyces сеге- visiae). Используют также культуры клеток млекопитающих, которые дают продукты, аналогичные природным, что полезно при получении препаратов человеческого белка. Однако широкому применению подобных реципиентов препятствуют трудности их культивирования (медленный рост, высокая стоимость питательных сред, опасность бактериальной и вирусной контаминации).
Введение молекул ДНК в клетки. Система клонирования состоит из двух компонентов - вектора и реципиентных клеток. Реципиентные клетки служат для выделения из смеси нужного типа рекомбинантных молекул, для последующей идентификации клонируемых генов и получения генов или их продуктов. В качестве реципиентных используют пер- миссивные клетки, т. е. клетки, обеспечивающие репликацию рекомбинантной ДНК.
Способ введения ДНК в клетки определяется природой вектора. Плазмидные векторы вводят путем трансформации, фаговые - путем трансфекции или трансдукции. Возможна также передача ДНК путем конъюгации.
Методы идентификации клонов, содержащихрекомбинантные молекулы. В большинстве экспериментов по молекулярному клонированию в результате действия рестриктаз получается сложная смесь фрагментов ДНК, Существуют специальные приемы, позволяющие отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Например, при использовании фазмид, дают урожай исключительно фаговые частицы, в головки которых пакуются рекомбинантные молекулы. При применении плазмид отбирают клоны с рекомбинантными ДНК по инактивации одного из маркеров вектора и т. д. Следующая, более трудная задача состоит в том, чтобы найти среди рекомбинантов клон, несущий нужный исследователю ген.
Методы скрининга рекомбинантных клонов могут быть основаны на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного продукта рекомбинантного гена, либо на свойствах самого продукта. Одним из таких приемов является тест на комплементацию, который применяется в том случае, когда клонируемый ген обеспечивает комплементацию мутаций генома клетки, например, ее переход из ауксотрофного в прототрофное состояние. При этом гибрид может быть обнаружен простым отбором на селективной среде.
Если продукт гена, т. е. белок, вырабатывается в достаточных количествах, возможен отбор нужного клона иммунологическим методом.
При отсутствии экспрессии гена в клетках реципиента клоны могут быть идентифицированы по первичной структуре ДНК или по характеру белка, синтезированного в подходящей системе (ооциты лягушки, бесклеточные экстракты). Тестирование первичной структуры ДНК осуществляется гибридизацией с меченой мРНК.
Если известна первичная структура гена или кодируемого им белка, для скрининга клонов можно использовать синтетические олигонуклеотиды - зонды, комплементарные искомому гену. Зонды имеют радиоактивную метку, которая позволяет обнаружить их присутствие при связывании с искомым фрагментом ДНК.
8.2. Направленный мутагенез
Свойства любого белка зависят от аминокислотной последовательности в полипептидной цепи, закодированной в ДНК. Замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, что сопровождается изменением свойств белка, например, изменением специфичности и т. д. Технология рекомбинан- тных ДНК дает возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного лу- тагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага М13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют одноцепочечными ДНК Ml 3 клетки E.coli. Часть образующихся в клетках фаговых частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его свойства. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР.
Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают методом генетических исследований или рентгеноструктурного анализа белка.
8.3. Клеточная инженерия
Клеточная инженерия - это важный раздел новой биотехнологии, объектами манипулирования которой являются культуры клеток растений, животных, человека, а также клетки микроорганизмов. Культуры клеток высших организмов могут быть использованы для производства вакцин, моноклональных антител и других иммунологических препаратов, регуляторов роста при выведении новых сортов растений. Получение протопластов дает возможность конструировать генетически новые объекты путем клеточной гибридизации или вводить в них чужеродный генетический материал.
Протопласты - это структуры, которые образуются после полного удаления клеточной стенки. Неполное удаление клеточной стенки приводит к образованию сферопластов. В клеточной инженерии используют как протопласты, так и сферопласты. Однако в ряде случаев эксперименты со сферопластами оказываются менее эффективными, чем с протопластами.
Трансформация протопластов является универсальным способом введения молекул ДНК в клетки бактерий, актиномицетов, дрожжей и грибов.
С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов микроорганизмов, которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой. Таким образом, возможно получение гибридных форм у микроорганизмов, имеющих важное значение для микробиологической промышленности, что создает предпосылки для их генетического изучения и расширяет возможность для селекционной работы. Метод слияния протопластов позволяет объединить в одном геноме мутации, положительно влияющие на продуктивность и полученные в разных селекционных линиях, в том числе и такие, которые трудно или даже невозможно индуцировать в одной и той же клетке, а также избавляться от вредных мутаций.
Метод слияния протопластов как способ генетического обмена отличается от конъюгации, трансдукции и трансформации, при которых в реципиентную клетку попадает лишь часть ДНК донора, тем, что при слиянии протопластов объединяются целые геномы и все компоненты цитоплазмы родительских клеток. Кроме того, в акте слияния могут участвовать более двух протопластов разных штаммов и в результате сразу получаются рекомбинанты, несущих признаки всех родителей.
Для получения протопластов у микроорганизмов (протопластиро- вания) используют методы, основанные на подавлении синтеза клеточной стенки или на ферментативном лизисе клеточной стенки.
Можно подвергать ферментной обработке клетки, выращенные на среде с ингибитором синтеза клеточной стенки.
Эффективным индуктором слияния протопластов является полиэти- ленгликоль (ПЭГ). Поверхность клеток и протопластов заряжена отрицательно и окружена водным слоем. Действие ПЭГ заключается в снижении поверхностного заряда и удалении воды, что создает условия для тесного контакта и слипания мембран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двух соседних протопластов объединяется.
8.4. Генная терапия
Целью медико-биологических исследований является создание методов лечения наследственных заболеваний. Нормальная работа организма обеспечивается функциями множества взаимосвязанных генов, мутация даже в одном из них может иметь самые разные последствия. Так, мутация, в результате которой изменяется активность того или иного фермента, может приводить к накоплению токсичного субстрата или дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки; мутация в гене, кодирующем структурный белок, - к нарушениям на уровне клеток, тканей и органов; мутация в гене, экспрессирующемся в одной ткани, может сказаться на другой ткани и привести к появлению множества симптомов. Наследственные заболевания имеют сложные клинические проявления, их лечение носит во многом симптоматический характер. Некоторые нарушения корректируют назначением специальной диеты или заместительной терапии, проводят трансплантацию костного мозга. Лечение обычно длительное, дорогое, часто малоэффективное. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных генов предпринимаются попытки использовать их для коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на молекулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ех vivo и in vivo.
Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:
■ получение клеток от больного;
■ исправление генетического дефекта путем переноса нужного гена в изолированные клетки с помощью вектора (ретро-, аденовирусного или др.);
■ отбор и накопление генетически «исправленных» клеток;
■ трансплантация
Использование собственных клеток пациента гарантирует, что у него не разовьется на них иммунный ответ.
Генная терапия in vivo предполагает доставку нужного гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Разработаны разнообразные вирусные и невирусные векторные системы доставки генов, учитывающие характер потенциальных тканей-мишеней (кожа, мышцы, легкие, мозг, селезенка, печень, клетки крови и др.).
Перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. Так, в опухолевые клетки последовательно вводят ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и ганцикловир. В результате образуется ганцикловирт- рифофсфат, токсичный для быстроделящихся клеток.
В качестве лекарственных средств можно использовать олигонук- леотиды. С помощью так называемых антисмысловых олигонуклеотидов можно подавить экспрессию гена того или иного наследственного заболевания. Введенный в клетку-мишень антисмысловой олигонуклеотид гибридизуется со специфической мРНК и блокирует ее трансляцию. Изучается терапевтическое действие различных олигонуклеотидов: модифицированных с помощью генетической инженерии рибозимов, расщепляющих специфические мРНК, особых нуклеотидов-аптамеров, которые связываются со специфическими белками и блокируют их функции и др.
8.5. Контроль безопасности в области молекулярной
биотехнологии
Молекулярная биотехнология оказывает все большее влияние на разные стороны жизни современного общества (сельское хозяйство, медицину и др.), поэтому необходимо учитывать все возникающие при этом проблемы - этические, правовые, экономические и социальные. Сомнения в безопасности работ с рекомбинантными ДНК привели к разработке строгих правил, регулирующих исследования в этой области, и утверждению требований, которым должны удовлетворять продукты, полученные методами биотехнологии. Производство и поступление на рынок фармацевтических продуктов, полученных с помощью генно-инженерных технологий, как правило, не требует специального контроля помимо подтверждения их аутентичности и контролируемых показателей свойств.
В отношении пищевых добавок, полученных с помощью методов генетической инженерии, используется прецедентный подход для решения вопроса об их биобезопасности. Каждый продукт должен пройти тестирование на соответствие ряду специфических критериев в зависимости от своей природы, прежде чем он будет разрешен к употреблению человеком.
Генная инженерия человека включает генную терапию соматических клеток и клеток зародышевой линии. Первая становится важным методом лечения различных заболеваний. Существуют специальные правила, регулирующие исследования в этой области, и биомедицинские этические критерии, которым должны соответствовать все эксперименты, связанные с медициной. Генная терапия клеток зародышевой линии (сперматозоидов, яйцеклеток, зигот) может оказать нежелательное воздействие на последующие поколения, поэтому в настоящее время она запрещена. Запрещены в большинстве стран все эксперименты по клонированию человека, однако, не исключена возможность, что в будущем этот вопрос будет пересмотрен.
В РФ существует система государственного регулирования в области генно-инженерной деятельности. Федеральный закон РФ, принятый в 1996 г., предусматривает необходимость общей координации и разработки системы безопасности, устанавливает уровни риска потенциально вредного воздействия генно-инженерной деятельности на здоровье человека и определяет виды генно-инженерной деятельности, подлежащей лицензированию. К ним относятся все виды работ по созданию генетически модифицированных организмов (ГМО), их испытанию, выпуску в окружающую среду, использованию для производства препаратов, утилизации отходов и т. п. Координацию действий исполнительной власти и заинтересованных субъектов РФ по реализации этого закона осуществляет Межведомственная комиссия по проблемам генно-инженерной деятельности, создания и поддержания централизованного банка данных в области биобезопасности.
Экспертный совет Минпромнауки России по вопросам биобезопасности в целях обеспечения объективности и надлежащего уровня качества проверки представленных заявителем сведений о безопасности ГМО проводит экспертизу этих сведений и устанавливает наличие или отсутствие нежелательного воздействия ГМО на окружающую среду. Государственная стратегия обеспечения биобезопасности в России отвечает положениям Международных Конвенций «О биологическом разнообразии», «О защите прав и достоинства человека в связи с применением достижений биологии и медицины» и открывает возможности для гармонизации национального механизма биобезопасности с международными аналогами. РФ является членом Международного центра генной инженерии и биотехнологии и принимает его устав.
Глава 9. ПРИМЕНЕНИЕ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
9.1. Химиотерапия инфекционных заболеваний
Термин «химиотерапия» относится к лечению инфекционных болезней путем системного применения антибиотиков или других лекарственных препаратов. В ее основе лежит избирательное действие химио- терапевтического препарата, подавляющего размножение патогенного микроорганизма без нарушения функций организма хозяина, что помогает его защитным силам справиться с инфекцией.
Химиотерапевтический препарат будет эффективным при следующих условиях:
1) при его использовании для лечения или профилактики заболевания, вызванного чувствительным к данному препарату микроорганизмом;
2) при достижении в тканях его концентрации, достаточной для подавления роста инфицирующего агента;
3) при достаточно продолжительном периоде лечения;
4) при отсутствии тяжелых побочных реакций. Терапевтическое действие препарата обеспечивают следующие факторы: сохранение стабильности структуры при введении в организм, скорость абсорбции и элиминации, способность к проникновению в ткани и биологические жидкости. Основными критериями оценки эффективности антимикробных препаратов являются терапевтический индекс и достижимая концентрация в сыворотке.
Терапевтический индекс-частное отделения величины минимальной токсической дозы препарата на величину минимальной дозы, проявляющей антимикробную активность; более высокое значение соответствует большей эффективности препарата.
Достижимая концентрация в сыворотке - величина, зависящая от массы тела пациента, дозы препарата, способа и схемы введения и скорости его элиминации из организма. Этот показатель не отражает концентрацию препаратов в тканях организма, которая может значительно превышать концентрацию в сыворотке.
Принципы химиотерапии. Факторы, которые необходимо учитывать при выборе химиотерапевтического средства, представлены в табл. 13.
Таблица 13
Факторы, которые необходимо учитывать при назначении химиотерапевтического препарата
|
Микробиологический фактор. Природа инфицирующего агента и его чувствительность к химиотерапевтическим препаратам является основой для выбора последних. Следует также учитывать возможность раз
– Конец работы –
Эта тема принадлежит разделу:
основы... ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ... В А Галынкин Я А Заикииа В И Кочеровец Т С Потехина Н Д Бунатян...
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: ЧАСТ Ь II. АНТИМИКРОБНЫЕАГЕНТЫ
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов