ЧАСТ Ь II. АНТИМИКРОБНЫЕАГЕНТЫ

Глава 6. АНТИБИОТИКИ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ

X И VI ЙО ГЕ PA I IЕ ВП1Ч ЕСКИ Е ПРЕПАРАТЫ

6.1. Антибиотики

Термин «антибиотический» впервые употребил в 1889 г. Поль Вюп- емен, говоря об антагонистических взаимоотношениях растений и жи­вотных. В 1942 г. Ваксман определил антибиотик как «химическое веще­ство, произведенное микроорганизмами, которое способно угнетать рост или даже разрушать другие микроорганизмы в разбавленных растворах». Это вторичные метаболиты, которые необходимы их продуцентам для выживания в условиях конкуренции с другими микроорганизмами.

Помимо антимикробной активности они могут обладать другими фар­макологическими свойствами: действовать как иммунодепрессанты, инги­биторы ферментов, противоопухолевые и цитотоксические средства, инсек­тициды и гербициды. К настоящему времени описано около 20000 антибио­тических веществ, однако, в клинике используется не более 160 антибио­тиков, из них 30 % составляют природные продукты, 30 % - полусинтети­ческие и остальные - синтетические. Химический синтез часто бывает экономически более выгодным для получения аналогов природных со­единений, чем биосинтез. Однако биосинтез незаменим для получения природных продуктов, предшественников полусинтетических антибио­тиков и ферментов, необходимых для энзиматической трансформации природных или синтетических соединений. Постоянное появление мик­роорганизмов, устойчивых к антимикробным агентам, требует изыска­ния новых продуцентов и новых антимикробных препаратов. Современ­ные антимикробные препараты весьма разнообразны по структуре, меха­низму действия и спектру антимикробной активности.

По спектру действия антибиотики подразделяют на противовирус­ные, антибактериальные, антифу н гал ьные, антипротозойные. Некоторые из них обладают широким спектром действия, другие активны против определенных групп микроорганизмов, например, только против грампо- ложительных бактерий. Антибиотики весьма разнообразны по структуре и механизму действия.

6.1.1. Р-лактамные антибиотики

Пенициллины. Природные (бензилпенициллин G, феноксиметил- иенициллин или пенициллин V) синтезируются при ферментации Penicillium notatum и P. chrysogenum. Полусинтетические являются про­изводными основы молекулы пенициллина - 6-аминопенициллановой кис­лоты (6-АПК), в которых боковая цепь представлена различными радика­лами, введенными путем ацилирования 6-АПК. В отличие от природного бензилпенициллина многие полусинтетические пенициллины не разру­шаются в кислой среде желудка и могут быть использованы перорально (оксациллин, клоксациллин, ампициллин, амоксициллин и др.). Безатин, бенетамин, прокаин медленно освобождают пенициллин, длительное вре­мя поддерживая его высокую концентрацию в крови, поэтому не требуют многократного введения в организм больного. Эфиры карбенициллина и ампициллина подвергаются ферментному гидролизу после абсорбции из слизистой оболочки кишечника и создают высокий уровень активного антибиотика в крови.

Метициллин, оксациллин, клоксациллин, флуклоксациллин и др. устойчивы к действию микробной р-лактамазы (пенициллиназы). Име­ются препараты, активные как против грамположительных, так и грамот­рицательных микроорганизмов, включая Pseudomonas aeruginosa - бак­терии, высокорезистентной к многим антибактериальным агентам.

Мециллинам, б-(3-амидинопенициллановые кислоты и их эфир пив- мециллинам имеют необычный спектр антибактериальной активности: не действуют на грамположительные микроорганизмы, как классические пенициллины, а лишь на грамотрицательные.

Цефалоспорины (цефемы), подобно пенициллинам, относят к груп­пе [3-лактамных антибиотиков. Они имеют более широкий спектр дей­ствия по сравнению с пенициллинами и более устойчивы к (3-лактамазам. Люди, страдающие аллергией к пенициллину, обычно не чувствительны к цефемам. Продуцентом природного антибиотика цефалоспорина С являет­ся гриб Acremonium chiysogenum, первоначально названный Cephalosporium acremonium. На основе природного антибиотика получены многочислен­ные полусинтетические препараты.

Клавамы. Клавулановая кислота, продуцентом которой является Streptomyces clavuligerus, обладает низкой антибактериальной активнос­тью, но является сильным ингибитором р-лактамазы. В клинической прак­тике используют комбинированные препараты клавулановой кислоты с амоксициллином или тикарциллином, обладающие широким спектром действия и не чувствительным к р-лактамазе.

В 1-оксацефемах химическая модификация молекулы делает соеди­нение более стабильным. К этой группе принадлежит латамоксеф - анти­биотик широкого спектра, устойчивый к Р-лактамазам.

Карбапенемы являются аналогами пенициллинов или клавамов, у которых атом серы (пенициллинов) или кислорода (клавамов) замещен углеродом. К ним принадлежат оливановые кислоты, продуцируемые Streptomyces olivaceus - антибиотики широкого спектра, сильные инги­биторы (3-лактамаз, а также тиенамицин, обладающий такими же свой­ствами, но нестабильный. Его производные N-формимидоилтиенамицин лишен этого недостатка.

Нокардицины продуцируются Nocardia sp., наиболее активен анти­биотик широкого спектра нокардицин А

Монобаюпамы - это моноциклические (3-лактамы, не содержащие тиазолидинового кольца, синтезируются различными штаммами бакте­рий. Из антибиотиков этой группы наиболее эффективным оказался азт- реонам, действующий на многие грамотрицательные бактерии и устой­чивый к (i-лактамазам, однако, не обладающий активностью по отноше­нию к бактероидам и грамотрицательным анаэробам.

Другие {3-лактамы. Производные пенициллановой кислоты, напри­мер, сульфон- и бромопенициллановые кислоты являются ингибиторами некоторых типов (3-лактамаз.

6.1.2. Тетрациклины

Тетрациклины продуцируются некоторыми видами стрептомицетов, а также получаются как полусинтетические препараты. Хлортетрациклин образуется при ферментации S. aureofaciens, из него путем каталитичес­кого гидрогенизирования получают тетрациклин и кломоциклин. Хими­ческая модификация тетрациклина дает миноциюшн. Окситетрациклин продуцируется S. rimosus, из него получают метациклин, гидрогенизация которого дает доксициклин. Мутант Str. aureofaciens продуцирует метил- хлортетрациклин. Тиатетрациклины, например, тиациклин, содержат атом серы в 6-м положении молекулы, активны против бактерий, устойчивых к тетрациклину. В настоящее время природные тетрациклины практичес­ки не применяются, их вытеснили полусинтетические препараты (докси­циклин и миноциклин).

Тетрациклины - антибиотики широкого спектра. Резистентность к ним развивается относительно медленно. Однако, существует перекре­стная резистентность, т. е. микроорганизм, устойчивый к одному из тет- рациклинов, устойчив также ко всем членам этой группы.

Следствием употребления тетрациклинов может быть дисбактериоз.

Глициклины - новая группа аналогов тетрациклина. Активны против бактерий, устойчивых к другим тетрациклинам, резистентность которых связана с активным выбросом антибиотика.

6.1.3. Рифамицины

Рифамицины в виде комплекса антибиотиков продуцирует Streptomyces mediterranei, из них наиболее перспективен рифамицин В, на основе которого создан полусинтетический аналог рифампицин - ан­тибиотик широкого спектра действия. Резистентность развивается доволь­но быстро, поэтому его рекомендуют использовать ограниченно, в основ­ном при микобаюгериозах. Препарат плохо всасывается при приеме внутрь, поэтому применяется парентерально или местно.

6.1.4. Аминогликозидиые антибиотики

Это большой класс соединений, образуемых некоторыми актино- мицетами и бациллами. Аминогликозиды содержат в своей структуре аминосахара: дезоксистрептамин - в молекулах неомицина, фрамицети- на, гентамицина, канамицина, тобрамицина, амикацина, нетилмицина, си- зомицина и стрептидин в молекулах стрептомицина и дигидрострепто- мицина. Аминоциклитолстрептомицин не имеет углеводного компонен­та. Это антибиотики широкого спектра действия. Стрептомицин и кана- мицин эффективны при туберкулезе. Аминогликозиды слабо действуют на стрептококки, не действуют на энтерококки, провиденции, бактерои­ды и другие анаэробы.

Гентамицин широко используется при лечении тяжелых бактериаль­ных инфекций. Паромомицин активен против Entamoeba histolytica и ис­пользуется при лечении кишечного амебиаза и острой бактериальной ди­зентерии.

Модификация аминогликозидных антибиотиков позволяет получить препараты, устойчивые к инактивирующему действию ферментов резис­тентных штаммов микроорганизмов (нетилмицин).

6.1.5. Макролиды

Молекулы макролидов содержат большие лактонвые кольца, соеди­ненные с аминосахарами гликозидными связями. Оказывают преимуще­ственно бактериостатическое действие против грмположительных кок­ков, микоплазм, хламидий, легионелл. Способны создавать высокие кон­центрации в тканях, обладают низкой токсичностью, не дают переркест- ных аллергических реакций с Р-лактамами. Наиболее важные представи­тели этой группы - эритромицин, олеандомицин, триацетилолеандоми- цин, спирамицин, мидекамицин, фиозамицин; различаются по активнос­ти против отдельных возбудителей инфекционных заболеваний, стабиль­ности и переносимости, что определяет показания к их применению.

6.1.6. Линкозамиды

Линкомицин и клиндомицин активны против грамположительных кокков, кроме Enterococcus faecalis. Не действуют на энтеробактерии.

6.1.7. Стрептограмины

Пристинамицин представляет собой смесь двух синергидно действу­ющих компонентов - макролида (I) и депсипептида (II). Новые антибио­тики - кинупристин и далфопристин представляют собой производные пристинамицина (I) и (II), соответственно. Антибиотики вводят внутри­венно совместно в соотношении 30:70 при тяжелой бактериемии Entero­coccus faecalis, резистентного к ванкомицину.

6.1.8. Полипептидные антибиотики

Полипептидные антибиотики представляют довольно разнообраз­ную группу соединений, синтезируемых бациллами и актиномицетами. Они включают бацитрацин, активный против грамположительных и грам- отрицательных кокков, но не бактерий; полимиксины, активные против многих грамотрицательных бактерий, исключая Serratia marcescens и Proteus spp.; капреомицин и виомицин, действующие на Mycobacterium tulerculosis.

Бацитрацин из-за высокой токсичности разрешен к применению только местно или в случаях крайней необходимости.

Полимиксины обладают нефротоксичностью, в меньшей степени токсичны полимиксины В и Е (колистин). Для парентерального введения используют сульфометат натрия кол истина. Натрия сульфомиксин - смесь сульфометилированного полимиксина В и натрия бисульфита менее ток­сичен, чем полимиксина В сульфат при сохранении его активности.

6.1.9. Гликопептиды

В данную группу входят ванкомицин (продуцент-Nocardia oriental is) и тейкопланнн, ранее применявшийся препарат ристомицин не использу­ется в связи с высокой токсичностью. Главное клиническое значение гли- копептидов заключается в их активности против полирезистентных ста­филококков и энтерококков.

' 6.1.10. Катионные пептиды

Это новый класс антибиотиков, получаемых как из природных ис­точников, так и химическим синтезом. В природе они присутствуют по­всюду - у бактерий, грибов, растений, животных и человека. У человека катионные пептиды (дефенсины) представлены группой пептидов, содер­жащих от 23 до 35 аминокислот; присутствуют в лейкоцитах и других тканях, активны против бактерий, простейших, грибов и вирусов, обла­дают хемотаксической активностью. У растений это тионины, которые образуются в ответ на инфекцию, активны против некоторых бактерий и грибов. У бактерий они выполняют функции бактериоцинов: колицин Е. coli, низин Lactococcus lactis, субтиллин В. subtilis и др. Они менее актив­ны по сравнению с другими антибиотиками, однако, действуют на устой­чивые к другим антибиотикам штаммы, вызывают быструю гибель мик­роорганизмов, индуцируют развитие резистентности.

Катионные пептиды нейтрализуют отрицательный заряд липополи- сахаридов бактерий, связываются с ними, препятствуя их взаимодействию с клетками организма, предотвращая, таким образом, развитие эндоток- сического шока у пациентов.

Катионные пептиды слабоиммуногенны, так как имеют общие ан­тигены с макроорганизмом. Разрушаются пептидазами кишечника, поэто­му не попадают в окружающую среду.

Мупироцин (псевдомоновая кислота А) - основной продукт фер­ментации Pseudomonas fluorescens. Активен против стафилококков и не­которых стрептококков, не действует на Enterococcus faecalis и грамотри­цательные бактерии. В основном используется для ликвидации носитель- ства на коже и в полости носа штаммов Staphylococcus aureus, устойчи­вых к метициллину.

Низин получают при ферментации L. lactis или рекомбинантного штамма В. subtilis, используют для консервации пищевых продуктов, для лечения мастита у коров.

6.1.11. Другие антибактериальные антибиотики

Описанные ниже антибиотики не могут быть отнесены ни к одной рассмотренной ранее группе.

Хлорамфеникол (левомицетин), синтезируемый S. venezuelae, анти­биотик широкого спектра, оказывает только бактериостатическое действие, активен против спирохет, риккетсий, хламидий. У части пациентов вызы­вает апластическую анемию, поэтому рекомендован к применению толь­ко при отсутствии альтернативных средств. Его фторированные произ­водные активны против резистентных микроорганизмов.

Фузидиевая кислота, выделяется из культуры гриба Fusidium cocci- neum, используемая в форме натриевой соли, активна против грамполо­жительных бактерий, особенно стафилококков, хотя стрептококки отно­сительно устойчивы. Действует на полирезистентные штаммы стафило­кокков, однако, и к этому препарату могут появляться устойчивые формы бактерий.

Линкомицин (продуцент S. lincolniensis) и его синтетический ана­лог клиндамицин по спектру активности сходны с макролидами, однако, не эффективны в отношении Е. coli. Применение клиндамицина сопряже­но в риском чрезмерного размножения в кишечнике Clostridium difficile - возбудителя диарейной инфекции. Возможна перекрестная резистентность между линкомицинами и эритромицином,

6.1.12.Антифунгальные антибиотики

В отличие от большого разнообразия антибактериальных антибио­тиков, имеется лишь небольшое количество антифунгальных антибиоти­ков для системного применения.

Гризеофульвин продуцируется Penicillium griseofulvum, активен про­тив дерматофитов, не действует на Candida spp. и бактерии. Применяется орально в форме таблеток. Проникает в глубокие слои кожи и кератин волос, поэтому эффективен при терапии дерматомикозов.

Полиены. Полиеновые антибиотики продуцируются стрептомице- тами, характеризуются наличием в своей структуре большого лактонного кольца и гидрофобной области, состоящей из последовательности от 4 до 7 конъюгированных двойных связей. Наиболее важные из них - амфоте- рицин В и нистатин.

Нистатин активен против Candida spp. и применяется при кандидо- зе ротовой полости и желудочно-кишечного тракта, поскольку плохо

всасывается из кишечника и неэффективен при других формах кандидоза.

Амфотерицин В эффективен при системных микозах. Плохо всасы­вается из кишечника, поэтому его вводят внутривенно под строгим ме­дицинским контролем, учитывая его нефротоксичность. Метиловый эфир амфотерицина менее токсичен с сохранением антифу нгальной активности.

Эхинокандины - новый класс антибиотиков, представленный мно­гочисленными продуктами ферментации Aspergillus nidulans и A. rugulosus и их полусинтетическими аналогами. Активны против грибов рода Candida, Aspergillus, Pneumocystis. Это семейство циклических липопеп- тидов, различающихся боковыми радикалами (остатками жирных кислот) у гексапептидного кольца. Считают, что в ближайшем будущем они най­дут клиническое применение.

6.2. Синтетические химиотерапевтические препараты

Сульфонамиды - большая группа химиотерапевтических веществ, действуют на стрептококки, Е. coli, Proteus mirabilis, обычно неактивны в отношении Pseudomonas aeruginosa, индолположительных штаммов про­тея и Klebsiella spp. Резистентные штаммы появляются у Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Neisseria honorrhoea, N. meningitidis, E. coli, Proteus mirabilis и др. Сульфонамиды различаются по способности вса­сываться из желудочно-кишечного тракта, например, сульфадимидин и сульфадиазин всасываются быстро, тогда как сукцинилсульфатиазон и фталилсульфатиазол - очень плохо. Их используют при лечении раз­личных инфекционных заболеваний, вызванных грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами.

Производные дисшинопиримидина составляют группу веществ с противоопухолевой (метотрексат), антипротозойной (пириметамин) и антибактериальной (триметоприм, тетроксоприм) активностью. Послед­ние обладают широким спектром действия, однако, к ним появляются резистентные формы бактерий.

Дапсон (диаминодифенилсульфон) применяется для лечения леп­ры. Для предупреждения развития резистентности возбудителя его исполь­зуют в комбинации с рифампицином и клофазимином.

Производные изоникотиновой кислоты (изониазид, этионамид, протионамид) как и парааминосалициловая кислота эффективны против микобактерий, применяются при туберкулезе. Этионамид менее активен, чем изониазид, однако действует на устойчивые к изониазиду штаммы бактерий. Протионамид по активности не отличается от этионамида, но лучше переносится больными.

Пиразинкарбоновой кислоты амид - пиразшитид действует на туберкулезные бактерии, устойчивые к другим противотуберкулезным препаратам.

Соединения нитрофураиа. Синтезировано несколько сотен соеди­нений нитрофурана, однако, терапевтическими свойствами обладают лишь немногие из них

Нитрофураны действуют на широкий спектр микроорганизмов. Фуразолидон высокоэффективен против энтеробактерий и применяется при лечении диареи и желудочно-кишечных расстройств бактериальной этиологии. Нитрофурантион используют при инфекции мочевыводящих путей, поскольку препарат концентрируется в моче. Он наиболее активен при кислом значении рН. Нитрофуразон в основном используют местно при обработке ран и ожогов, а также некоторых типов заболеваний уха.

Хинолоны. Налидшсовая кислота применялась некоторое время для лечения инфекций мочевого тракта. Она действует только на грамотрица­тельные бактерии. Хинолоны II поколения (ципрофлоксацин, норфлокса- цин и др.) применяются при лечении системных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Хинолоны III поколения (спарфлокса- цин, левофлоксацин) активны против пневмококков, хламидий, микоп- лазм. Моксифлоксацин (препарат IV поколения) действует на неспорооб- разующие анаэробы (Bacteroides fragilis).

Производные имидазола. Метронидазол угнетает рост патогенных простейших, например, Trichomonas vaginalis и Entamoeba hystolyticum. При оральном применении высокоэффективен при урогенитальных ин­фекциях, вызванных Т. vaginalis. Эффективен против анаэробных бакте­рий и факультативных анаэробов в анаэробных условиях. Вводится ораль­но или в форме суппозиториев.

Клотримазол, миконазол, эконазол, кетоконазол активны против патогенных грибов и некоторых бактерий, применяются местно. Не от­мечено развития резистентности in vitro или in vivo.

5-фторцитозин с наибольшей активностью действует на дрожже­вые грибы - Candida и Cryptococcus.

Синтетические аллилалшны. Тербииафии действует как ингиби­тор скваленэпоксидазы, участвующей в биосинтезе эргостерола у грибов. Активен при пероральном применении в отношении многих видов дер- матофитов и дрожжей. Может применяться местно в виде кремов.

Синтетические кароиматы. Толнафрат используется местно при лечении или профилактике дерамтофитии.

6.3. Полимерные производные антимикробных препаратов

Полимеризация антимикробных препаратов позволяет получить соединения с улучшенными свойствами (феноксиметилпенициллин, ус­тойчивый к р-лактамазе, спирамицин пролонгированного действия, ген- тамицин с пониженной токсичностью и др.). Полимерные антисептики на основе поверхностноактивных соединений отличаются значительно меньшей токсичностью по сравнению с исходными веществами (катапол).

Глава 7. ПРОИЗВОДСТВО ХИМИОТЕРЛПЕВТИЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ

7.1. Общие представления о промышленном производстве

лекарственных препаратов

Промышленное производство лекарственных препаратов включает широкое использование машин, аппаратов, поточных механизированных и автоматизированных линий. Оно предусматривает массовый, серийный выпуск препаратов по стандартным прописям, рассчитанным на средне­го потребителя.

Укрупненное фармацевтическое производство состоит из комплек­са специализированных цехов. Цех - основное производственное подраз­деление, специализированное для выполнения однородных процессов (дробильный, экстракционный, фасовочный и т. д.) или для выпуска од­нотипной продукции (таблеточный, ампульный, аэрозольный и др.). Каж­дый цех имеет несколько участков, где осуществляются однотипные опе­рации, составляющие технологический процесс. Например, таблеточный цех имеет участки смешивания ингредиентов, гранулирования, сушки гранулята, прессования и др.

Работа промышленных предприятий характеризуется строгой рег­ламентацией и планированием производства. Производственный процесс проводится в определенных стандартных условиях, предусмотренных точными инструкциями, объединенными в одни сводный документ - ре­гламент. Регламент представляет собой совокупность правил, определя­ющих порядок деятельности фармацевтического предприятия по выпус­ку готовой продукции. В нем дается характеристика исходных продуктов, полуфабрикатов и готового продукта, указаны последовательность ста­дий технологического процесса, режим обработки материалов по стади­ям, аппаратурная схема, методы анализа, правила по технике безопаснос­ти, производственной гигиене и другие условия производства. Регламент является законом производства, отступление от него недопустимо. За со­блюдением регламента следит отдел технического контроля.

В фармацевтическом производстве технологические процессы под­разделяются на химические, связанные с химическим синтезом лекарствен­ных веществ, и физические. К последним относятся механические, свя­занные с обработкой твердых материалов (измельчение, просеивание, смешивание, дозирование, прессование), гидромеханические (перемеши­вание жидкостей, эмульгирование, фильтрование), тепловые (испарение, конденсация, плавление), массообменные (растворение, кристаллизация, сушка, экстракция, ректификация). Все эти процессы требуют соответ­ствующего аппаратурного оформления, т. е. выполняются с использова­нием специальных машин и аппаратов.

Основным исходным материалом для изготовления лекарственных препаратов являются лекарственные вещества, которые могут быть получены путем химического или биологического синтеза, а также путем переработки лекарственного растительного сырья или тканей и органов животных.

Лекарственные препараты имеют определенную лекарственную форму, т. е. удобное для применения состояние. Существуют твердые (по­рошки, таблетки, гранулы), жидкие (растворы, суспензии, эмульсии) и мягкие (мази, суппозитории) лекарственные формы.

Этапы химического синтеза определенного лекарственного веще­ства могут включать процессы смешивания ингредиентов реакции, их термической обработки, экстракционного или хроматографического раз­деления продуктов реакции, упаривания, кристаллизации, сушки и т. п.

Основные этапы микробиологического синтеза антибиотиков, фер­ментов, органических кислот и т. п. показаны на схеме (рис. 9).

Из лекарственного растительного сырья готовят сборы, порошки, настойки, экстракты, а также получают максимально очищенные экстрак­ционные препараты или препараты индивидуальных веществ.

Из животного сырья получают гормоны, ферменты и препараты не­специфического действия. Они могут представлять собой высушенные, обезжиренные и измельченные ткани или экстракты (максимально очи­щенные или препараты индивидуальных веществ).

В основу гомеопатической фармации положен принцип потенци­рования (динамизации) - особая технология приготовления гомеопати­ческих лекарств. Сущность этого принципа состоит в том, что процесс включает в себя поэтапное снижение концентрации исходного гомеопа­тического вещества в носителе (растворе или порошке) в 10 или 100 раз на каждом этапе путем интенсивного встряхивания, растирания и пере­мешивания. В результате получают препараты, в которых содержание ис­ходной субстанции снижено до ничтожных значений.

Для современной фармацевтической промышленности характерно непрерывное совершенствование и комплексное применение новых тех­нологических подходов, основанных на понимании механизма действия

Рис. 9. Этапы получения продуктов микробиологического синтеза

 

и фармакологического эффекта лекарственного вещества и направленных к общей цели - созданию более эффективных и безопасных медицинских препаратов.

Современное фармацевтическое производство требует от персона­ла понимания смысла и значения каждой ступени технологического про­цесса и строгого контроля выполнения требований регламента. В связи с этим центральное место в общем направлении развития фармацевти­ческой технологии наряду с химией и биотехнологией принадлежит микро­биологии, научный поиск и развитие этих направлений определяют успех развития всей отрасли.

Существенная часть требований к качеству фармацевтической про­дукции и к условиям производства контролируется микробиологом: сте­рильность, микробная контаминация сырья и нестерильных лекарствен­ных средств, соблюдение правил производственной гигиены, предусмот­ренных GMP. Эти требования должны быть хорошо известны всем участ­никам производственного процесса и неукоснительно соблюдаться с осоз­нанием важности тщательного выполнения каждого из них.

С появлением фармацевтических препаратов, получаемых с исполь­зованием методов генетической инженерии, более 80 % стерильных ле­карственных форм готовят асептично, поскольку эти вещества лабильны и не могут быть простерилизованы в готовом виде. Лекарственные препа­раты, приготовленные с использованием асептичной технологии, превос­ходят по своему качеству препараты, производимые ранее.

Техникой работы в асептичных условиях должны владеть не только микробиологи, но и химики, а также весь персонал, от которого зависит выпуск микробиологически безопасной продукции.

7.2. Производство антибиотиков

Получение препаратов антибиотиков - сложный и многоступенча­тый процесс. Он слагается из комплекса последовательных исследований, которые можно свести в основном к следующим этапам:

1.) изыскание микроорганизмов-антагонистов в природе и выделение их в чистую культуру;

2) изучение спектра действия и определение антибиотической актив­ности выделенных культур антагонистов;

3) подбор условий культивирования продуцентов антибиотиков;

4) первичная идентификация антибиотика на ранних этапах изучения;

5) выделение и химическая очистка активно действующего начала из культуральной жидкости и клеток, а также сравнение полученного антибиотика по оиологическим и химическим показателям с уже известными препаратами для выявления новых свойств полученных веществ;

6) изучение механизма действия и испытание токсических и лечебных качеств антибиотиков на животных;

7) разработка технологии получения антибиотика в лаборатории и вне­дрение ее в промышленное производство;

8) получение из исходных штаммов новых генотипов микроорганиз­мов, обладающих повышенной активностью, путем мутаций и ре­комбинаций методами генетической и клеточной инженерии. Для получения новых антибиотиков помимо изыскания новых или

генетически измененных продуцентов используют следующие методиче­ские подходы:

1. Получение из исходного антибиотика препарата с новыми свойства­ми путем химической или биохимической модификации его моле­кулы;

2. Направленный биосинтез путем биохимической модификации струк­туры, полученной химическим методом;

3. Химический синтез с использованием природных структур в каче­стве шаблонов;

4. Мутасинтез. Этот метод включает следующие этапы:

a) получение мутантов - идиотрофов, требующих для образования ан­тибиотика определенный фрагмент его молекулы (предшественник);

b) получение химическими методами аналога этого предшественника (мутасинтона);

c) культивирование идиотрофа на среде, содержащей мутасинтон. При этом идиотроф включает мутасинтон в молекулу продуцируемого им антибиотика. В результате получаются новые (мутасинтетичес- кие) структуры.

5. Получение гибридных антибиотиков, т.е. веществ, продуцируемых генетическими гибридами; гибридный антибиотик может содержать структуры двух различных метаболитов. От антибиотиков, получа­емых перечисленными выше методами, они отличаются тем, что представляют собой продукт комбинации генов.

Основные этапы получения гибридных антибиотиков:

a) выбор продуцента, образующего известный антибиотик;

b) изыскание нового микроорганизма для гибридизации;

c) исследование биохимических путей синтеза антибиотика, интерме- диатов и ферментов;

d) определение генов, контролирующих образование ферментов био­синтеза и его регуляторов;

e) получение рекомбинантной ДНК, содержащей комбинацию генов, благоприятную для процесса биосинтеза;

f) клонирование новой генетической структуры в культуре реципи­ента;

g) химическое, микробиологическое и фармакологическое исследова­ние нового антибиотика.

Природные антибиотики получают путем культивирования микро­организма - продуцента с использованием методов биотехнологии. По объему выпускаемых антибиотиков антибиотическая промышленность является самым крупным биотехнологическим производством.

Цель любой биотехнологии - на базе понимания физиологических и генетических свойств продуцента получить максимальный выход ко­нечного продукта. Необходимые для этого биотехнологические манипу­ляции реализуются в соответствующей аппаратуре. Управление процес­сами метаболизма продуцента может осуществляться следующими спо­собами:

1) изменением состава питательной среды;

2) изменением условий внешней среды (температура, рН, аэрация);

3) конструкцией биореактора (ферментера);

4) регламентированием введения дополнительного субстрата;

5) фиксацией физиологического состояния культуры применением ме­тода непрерывного культивирования;

6) использованием генетически модифицированных штаммов проду­цента.

Реализация этих способов требует специальных инженерно-техно­логических подходов, обеспечивающих биохимическую регуляцию био­синтеза при сохранении свойств популяции продуцента (отсутствие по­вреждений клеток, автолиза, инфекции и др.).

Ферментация антибиотиков, как правило, аэробный процесс, требу­ющий подачи воздуха в ферментационную среду и перемешивания. В ан­тибиотической промышленности преимущественно применяют биореак­торы объемом от 30 до 200 м³ с механической мешалкой, снабженные системой автоматического контроля и управления процессом фермента­ции. Температуру ферментации (обычно 24-26 °С) обеспечивает система охлаждения. После ферментации биомассу отделяют, антибиотик выде­ляют из фильтрата (для некоторых антибиотиков - из клеток продуцента) путем экстракции, ионообмена, ультрафильтрации, осаждения и кристал­лизации. Процесс подготовки посевного материала, ферментации и мно­гие из дальнейших операций проводят в асептических условиях.

Культура продуцента. Исходный штамм микроорганизма, продуци­рующего антибиотик или другие БАВ, выделяют из природных источников (почва, растительные субстраты и др.) специальными методами скрининга; природный (дикий) штамм обладает низкой активностью, поэтому требу­ется длительная генетико-селекционная работа, обычно с применением мутагенов для повышения его активности. Полученный производственный штамм хранится в состоянии анабиоза (например, при низкой температуре в лиофилизированном состоянии). Такая культура может быть возвращена в активное состояние путем посева на соответствующую питательную сре­ду и использована для приготовления посевного материала.

Приготовление посевного материала. Культуру с поверхности косого агара асептично переносят в колбу с посевной средой. При ра­боте с грибами и актиномицетами используют споровый посевной ма­териал (500-5000 спор на 1 л среды). Колбы инкубируют в термостате на качалке. Материал из колб переносят в инокулятор объемом 0,5-1 м³ (0,1% посевного материала от объема среды) и выращивают от 2 до 4 сут. Далее посевной материал асептично переносят в посев­ной ферментатор объемом 5-20 м³ (10-12 % инокулята от объема пи­тательной среды, время культивирования от 1 сут.). Постоянно отби­рают пробы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5-20 % от объема питательной среды. Ступенчатая подготовка посев­ного материала позволяет получить его в количестве, необходимом для обеспечения быстрого и продуктивного роста в биореакторе, и под­держивает культуру в фазе логарифмического роста.

Питательная среда конструируется таким образом, чтобы обеспе­чить быстрый рост микроорганизма в начальной стадии и максимальный выход продукта в конце ферментации. Среду стерилизуют паром под дав­лением при 120-140 °С непосредственно в ферментаторе или в специаль­ной установке непрерывной стерилизации.

Ферментация. Ферментер и систему трубопроводов перед запол­нением средой моют, проверяют на герметичность и стерилизуют острым паром. Для обеспечения стерильности часто применяют предварительную обработку ферментера химическими дезинфицирующими веществами.

Количество стерильной охлажденной питательной среды в фермен­тере не должно превышать 70 % от его объема. Через линию посевного материала с помощью стерильного воздуха в ферментатор вводят посев­ной материал. Температура и рН питательной среды до подачи посевного материала должны быть доведены до оптимальных значений для данной культуры.

Ферментацию проводят при аэрации путем подачи стерильного воз­духа и перемешивании, которое способствует растворению кислорода в жидкой среде и полному контакту клеток с питательными веществами. Для предотвращения попадания нестерильного атмосферного воздуха в аппарат давление воздуха над поверхностью жидкости повышают до 20-30 кПа (0,2-0,3 кгс/см³). При необходимости вводят химические пе- ногасители.

Во время ферментации автоматически регулируются температура и рН среды, по специальной программе вводятся добавочные компоненты питательной среды. Систематически берут контрольные пробы жидкости из ферментера, в которых определяют необходимые физико-химические показатели, активность и отсутствие посторонних микроорганизмов.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максималь­ное количество полезного продукта. По окончании ферментации культу- ральную жидкость охлаждают до 10-25 °С и перекачивают в резервуары, из которых она подается на дальнейшую обработку.

Способы выделения и очистки антибиотиков индивидуальны и оп­ределяются его физико-химическими характеристиками. Например, пе­нициллин выделяют из культуральной жидкости экстракционным мето­дом, стрептомицин - методом ионообменной хроматографии.

7.3. Микроорганизмы как продуценты биологически активных

веществ и биоиндикаторы

Микроорганизмы и синтезируемые ими вещества широко исполь­зуются в фармацевтическом производстве и в аналитических целях. Помимо антибиотиков и иммунобиопрепаратов они служат для полу­чения декстранов, витаминов, аминокислот, органических кислот, фер­ментов, железохелирующих агентов и других препаратов, применяю­щихся в медицинской практике (табл. 12). Микробная трансформация является необходимым этапом при получении ряда лекарственных ве­ществ (стероидов, антибиотиков и др.). Ауксотрофные штаммы при­меняют для определения некоторых витаминов и аминокислот. Осо­бые мутантные штаммы предложены для быстрого определения кан­церогенной и мутагенной активности химиотерапевтических препара­тов. Микроорганизмы могут служить модельными системами на на­чальном этапе исследования метаболизма лекарственных веществ. При испытании стерильности пенициллинов и цефалоспоринов фармако­пея рекомендует применение Р-лактамазы для инактивации антибио­тиков.

Получение рекомбинантных штаммов методами генетической ин­женерии расширяет возможности использования микроорганизмов в фар­мацевтической практике.

Таблица 12 БАВ Продуцент Декстраны Leuconostoc dextranicum L. mesentericus Витамины Рибофлавин (В2) Цианкобаламин (Bt2) Eremothecium asbbyii Aschbya gossypii Bacillus subtilis (мугантный штамм) Propionibacterium freudenreichii P.shermanii Brevibacterium flavum Pseudomonas denitrificans Streptomyces olivaceus Micromonospora spp. Аскорбиновая кислота Acetobacter xylinum A. suboxydans (превращение В-сорбита в L-сорбозу) Каротиноиды Blakeslea trispora Choanephora cucurbitarum Аминокислоты Глутаминовая кислота Глутамин, пролин L-аланин, L-валин Corynebacterium glutamicum Лизин L-изолейцин L-орнитин L-гистидин L-аргинин L-треонин, L-триптофан L-цитрулин Corynebacterium spp. Brevibacterium spp. Brevibacterium spp. Arthrobacter spp. Brevibacterium spp. Corynebacterium spp. мутанты C.glutamicum B.flavum, Bacillus subtilis рекомбинантные штаммы Escherichia coli ауксотрофные мутанты C.glutamicum, Bacillus subtilis Органические кислоты Молочная Глюконовая Масляная Пропионовая Койевая 2-кетоглюконовая Lactobacillus delbrueckii, L.bulgaricum, L.brevis Rhizopus oryzae Gluconobacter suboxydans Aspergillus niger Clostridium butiricum Propionibacterium shermanii P.freudenreichii Aspergillus niger Pseudomonas fluorescens

Некоторые БАВ, продуцируемые микроорганизмами

 

Окончание табл. 12 БАВ Продуцент 5-кетоглюконовая Gluconobacter suboxydans Винная Gluconobacter suboxvdans Пировиноградная Pseudomonas aeruginosa Уксусная Acetobacter spp. Лимонная Aspergillus niger Сидерофоры   Десферроксамин Streptomyces pilosus Ферменты   Стрептокиназа Streptococcus sp. Стрептодорназа Streptococcus sp. L-аспарагиназа Escherichia coli   Erwinia carotovora Нейраминидаза Vibrio cholerae В-лактамаза Escherichia coli

Глава 8. ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Генетическая инженерия или технология рекомбинантной ДНК основана на конструировании фрагментов ДНК in vitro с последующим введением новых (рекомбинантных) генетических структур в живую клет­ку и их экспрессией. Техника генетической инженерии используется при исследовании строения генов высших организмов, разработке методов генной терапии, методов молекулярной диагностики. Технологию реком­бинантной ДНК используют для создания новых продуцентов антибио­тиков, производящих антимикробные препараты с измененными свойства­ми. Генетическая инженерия дает возможность получать препараты кро­ви от трансгенных животных, производить белки человека путем культи­вирования рекомбинантных штаммов микроорганизмов.

8.1. Методы генетического конструирования микроорганизмов in vitro

Типовой эксперимент в генетической инженерии состоит из следу­ющих этапов: 1) получение фрагментов ДНК; 2) конструирование in vitro рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, полученных на первом этапе, и векторов - небольших автономно реплицирующихся в клетке-реципиенте структур (плазмид, фагов, вирусов); 3) введение ре­комбинантных ДНК в клетку-реципиент; 4) отбор клонов, несущих нуж­ную рекомбинантную ДНК.

Источники ДНК для клонирования. Существуют три источника молекул ДНК, используемых в генетической инженерии: фрагменты гене­тического материала различных организмов; ДНК, полученная путем хи­мико-ферментативного синтеза; ДНК, комплементарная мРНК (кДНК). Получение кДНК необходимо для экспрессии в бактериях генов белков че­ловека: гены эукариот содержат интроны, а в клетках бактерий отсутствует механизм, обеспечивающий сплайсинг, поэтому используя в качестве мат­рицы зрелую мРНК (не содержащую интронов), получают кДНК, состоя­щую из последовательностей нуклеотидов, соответствующих экзонам.

Рестриктазы. Ферменты рестриктазы являются необходимым ин­струментом при манипулировании с генами. Это специфические эндонук- леазы, которые являются составной частью системы рестрикции - моди­фикации прокариотических клеток, обеспечивающей их защиту от про­никновения чужеродной ДНК. Рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности нуклеотидов и расщепляет ее на фрагменты (рестрикты).

Особую ценность представляют рестриктазы, под действием кото- рык образуются фрагменты с самокомплементарными липкими концами: они эффективно используются при конструировании рекомбинантных молекул.

Методы воссоединения фрагментов ДНК. Для соединения фраг­ментов ДНК, полученных после обработки рестриктазой, используют от­жиг, в результате которого образуются водородные связи между компле­ментарными основаниями липких концов, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами. Наличие липких концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Имеются ферменты, способные соединять полностью двунитевые фраг­менты, однако эта реакция протекает лишь при высоких концентрациях ДНК и лигазы.

При объединении ДНК донора и вектора при отжиге и лигировании образуются не только гибридные молекулы, но и исходные векторы, что затрудняет дальнейшую работу по клонированию ДНК донора. Поэтому разработаны специальные методы, позволяющие направить процесс пре­имущественно на получение гибридных молекул. Один из них основан на ращеплении ДНК вектора несколькими рестриктазами, чтобы уменьшить вероятность самосборки вектора. Другой эффективный метод заключает­ся в отщеплении концевых фосфатных групп от линейной ДНК вектора при действии щелочной фосфатазы. Образование лигазой кольцевых мо­лекул ДНК в этом случае возможно только в присутствии фрагментов до- норной ДНК, имеющих неповрежденные 5'-фосфатные группы.

Идентичные взаимокомплементарные концы двух молекул ДНК, подлежащих объединению, могут быть получены при гидролизе этих молекул одной и той же рестриктазой. Однако часто возникает необходи­мость клонировать фрагменты ДНК, полученные расщеплением одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рест- риюгазы. Для этого существует метод, позволяющий рекомбинировать практически любые фрагменты ДНК. Он предусматривает использова­ние линкеров - коротких синтетических двухцепочечных олигонуклео- тидов, имеющих сайты узнавания для определенной рестриктазы. Линке­ры пришивают с помощью лигазы по концам молекулы ДНК, подлежа­щей клонированию, и обрабатывают рестриктазой, в результате чего об­разуются липкие концы. Этой же рестриктазой гидролизуют молекулу вектора. В результате отжига и обработки лигазой получают рекомбинант- ные молекулы ДНК.

Линкерная молекула может иметь больше, чем один сайт узнавания рестриктазой. Тогда ее называют полилинкером или адаптером. Приме­нение таких молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации ДНК универсальным, поскольку исходные фрагменты можно получить самыми различными способами.

Коннекторный метод воссоединения фрагментов основан на свой­стве фермента - терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы - достраивать нуклеотидные последовательности к З'-ОН-концам фрагмен­тов ДНК. К концам одного из соединяемых фрагментов ДНК присоединя­ют однонитевой полинуклеотид, например, поли-А (dA), а к концам дру­гого - комплементарный ему, например, поли-Т (dT). Достроенные таким образом фрагменты смешивают и отжигают. Возможные бреши ликвиди­руют обработкой ДНК-полимеразой и лигазой, в результате чего полу­чают ковалентно замкнутые кольцевые молекулы.

Векторы. Векторами называют молекулы ДНК, способные перено­сить в клетку-реципиент чужеродную ДНК и обеспечить ее экспрессию. В векторные молекулы с помощью ферментов встраивают определенные гены. Такие молекулярные гибриды называются химерами или рекомби- нантными молекулами ДНК. Их вводят в реципиентные клетки, в резуль­тате чего происходит разделение молекул. Каждый из выделенных кло­нов содержит индивидуальную рекомбинантную ДНК. Эта процедура называется клонированием рекомбинантных молекул ДНК (клонирова­нием генов).

Чтобы стабильно существовать в клетке, вектор должен быть реп- ликоном (автономно реплицироваться в клетке). Вектор должен иметь один или несколько маркеров, позволяющих фенотипически определять его присутствие в клетке-реципиенте. Для обеспечения воссоединения с ДНК донора в векторной молекуле необходимо присутствие сайтов расщепле­ния рестриктазами, которые должны локализоваться в области, не суще­ственной для репликации вектора. Кроме того важно, чтобы вектор до­пускал вставку донорной ДНК различной молекулярной массы и давал большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку ре- комбинантной ДНК. Лучше всего разработана система векторов для E.coli в качестве реципиента. Она включает следующие типы векторов: плаз- миды, бактериофаг 1, космиды, фазмиды и бактериофаг М13. Созданы векторы и для других микроорганизмов, в том числе важных для про­мышленности (Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces и др.). Особенно удоб­ны двурепликонные (челночные) гибридные векторы, системы реплика­ции которых принадлежат плазмидам, имеющим разных хозяев. Они спо­собны реплицироваться в различных клетках, например, в E.coli, дрож­жей или животных. Это позволяет все предварительные операции по кло­нированию проводить в E.coli с последующим перенесением рекомби- нантной ДНК в нужный объект.

Клетка-реципиент. Клетка-хозяин - это та среда, в которой может функционировать рекомбинантная молекула ДНК. В качестве реципиен­та рекомбинантной ДНК часто используют Escherichia coli - микроорга­низм, хорошо изученный и применяющийся в разнообразных исследова­ниях в области генетики и молекулярной биологии. Но для целей биотех­нологии Е. coli не представляется идеальным продуцентом по следую­щим причинам. Е. coli входит в состав нормальной микробиоты человека, поэтому опасно заражение обслуживающего персонала рекомбинантным штаммом с нежелательными для человека свойствами. Помимо этого E.coli чувствительна к фагам, образует пирогены и не выделяет продукты био­синтеза в культуральную среду, что затрудняет их очистку. Поэтому перс­пективны другие микроорганизмы - бациллы (Вас. subtilis, Вас. stearo- thermophilus, Вас. brevis), стрептомицеты, дрожжи (Saccharomyces сеге- visiae). Используют также культуры клеток млекопитающих, которые дают продукты, аналогичные природным, что полезно при получении препа­ратов человеческого белка. Однако широкому применению подобных ре­ципиентов препятствуют трудности их культивирования (медленный рост, высокая стоимость питательных сред, опасность бактериальной и ви­русной контаминации).

Введение молекул ДНК в клетки. Система клонирования состоит из двух компонентов - вектора и реципиентных клеток. Реципиентные клетки служат для выделения из смеси нужного типа рекомбинантных молекул, для последующей идентификации клонируемых генов и полу­чения генов или их продуктов. В качестве реципиентных используют пер- миссивные клетки, т. е. клетки, обеспечивающие репликацию рекомби­нантной ДНК.

Способ введения ДНК в клетки определяется природой вектора. Плазмидные векторы вводят путем трансформации, фаговые - путем трансфекции или трансдукции. Возможна также передача ДНК путем конъюгации.

Методы идентификации клонов, содержащихрекомбинантные молекулы. В большинстве экспериментов по молекулярному клонирова­нию в результате действия рестриктаз получается сложная смесь фраг­ментов ДНК, Существуют специальные приемы, позволяющие отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Например, при ис­пользовании фазмид, дают урожай исключительно фаговые частицы, в головки которых пакуются рекомбинантные молекулы. При примене­нии плазмид отбирают клоны с рекомбинантными ДНК по инактивации одного из маркеров вектора и т. д. Следующая, более трудная задача со­стоит в том, чтобы найти среди рекомбинантов клон, несущий нужный исследователю ген.

Методы скрининга рекомбинантных клонов могут быть основаны на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного продукта рекомбинантного гена, либо на свойствах самого продукта. Од­ним из таких приемов является тест на комплементацию, который при­меняется в том случае, когда клонируемый ген обеспечивает комплемен­тацию мутаций генома клетки, например, ее переход из ауксотрофного в прототрофное состояние. При этом гибрид может быть обнаружен про­стым отбором на селективной среде.

Если продукт гена, т. е. белок, вырабатывается в достаточных коли­чествах, возможен отбор нужного клона иммунологическим методом.

При отсутствии экспрессии гена в клетках реципиента клоны могут быть идентифицированы по первичной структуре ДНК или по характеру белка, синтезированного в подходящей системе (ооциты лягушки, бес­клеточные экстракты). Тестирование первичной структуры ДНК осуще­ствляется гибридизацией с меченой мРНК.

Если известна первичная структура гена или кодируемого им белка, для скрининга клонов можно использовать синтетические олигонуклео­тиды - зонды, комплементарные искомому гену. Зонды имеют радиоак­тивную метку, которая позволяет обнаружить их присутствие при связы­вании с искомым фрагментом ДНК.

8.2. Направленный мутагенез

Свойства любого белка зависят от аминокислотной последователь­ности в полипептидной цепи, закодированной в ДНК. Замена единствен­ного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включе­нию в него аминокислоты, что сопровождается изменением свойств бел­ка, например, изменением специфичности и т. д. Технология рекомбинан- тных ДНК дает возможность производить специфические замены в кло­нированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного лу- тагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага М13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного та­ким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют одноцепочечными ДНК Ml 3 клетки E.coli. Часть образующихся в клетках фаговых частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его свой­ства. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР.

Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, произво­дится с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом полу­чают методом генетических исследований или рентгеноструктурного ана­лиза белка.

8.3. Клеточная инженерия

Клеточная инженерия - это важный раздел новой биотехнологии, объектами манипулирования которой являются культуры клеток расте­ний, животных, человека, а также клетки микроорганизмов. Культуры клеток высших организмов могут быть использованы для производства вакцин, моноклональных антител и других иммунологических препара­тов, регуляторов роста при выведении новых сортов растений. Получе­ние протопластов дает возможность конструировать генетически новые объекты путем клеточной гибридизации или вводить в них чужеродный генетический материал.

Протопласты - это структуры, которые образуются после полно­го удаления клеточной стенки. Неполное удаление клеточной стенки при­водит к образованию сферопластов. В клеточной инженерии использу­ют как протопласты, так и сферопласты. Однако в ряде случаев экспери­менты со сферопластами оказываются менее эффективными, чем с про­топластами.

Трансформация протопластов является универсальным способом введения молекул ДНК в клетки бактерий, актиномицетов, дрожжей и грибов.

С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов микроорганизмов, которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой. Таким образом, возмож­но получение гибридных форм у микроорганизмов, имеющих важное зна­чение для микробиологической промышленности, что создает предпосыл­ки для их генетического изучения и расширяет возможность для селекци­онной работы. Метод слияния протопластов позволяет объединить в одном геноме мутации, положительно влияющие на продуктивность и получен­ные в разных селекционных линиях, в том числе и такие, которые трудно или даже невозможно индуцировать в одной и той же клетке, а также избав­ляться от вредных мутаций.

Метод слияния протопластов как способ генетического обмена от­личается от конъюгации, трансдукции и трансформации, при которых в реципиентную клетку попадает лишь часть ДНК донора, тем, что при слиянии протопластов объединяются целые геномы и все компоненты цитоплазмы родительских клеток. Кроме того, в акте слияния могут уча­ствовать более двух протопластов разных штаммов и в результате сразу получаются рекомбинанты, несущих признаки всех родителей.

Для получения протопластов у микроорганизмов (протопластиро- вания) используют методы, основанные на подавлении синтеза клеточ­ной стенки или на ферментативном лизисе клеточной стенки.

Можно подвергать ферментной обработке клетки, выращенные на среде с ингибитором синтеза клеточной стенки.

Эффективным индуктором слияния протопластов является полиэти- ленгликоль (ПЭГ). Поверхность клеток и протопластов заряжена отрица­тельно и окружена водным слоем. Действие ПЭГ заключается в сниже­нии поверхностного заряда и удалении воды, что создает условия для тес­ного контакта и слипания мембран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двух соседних протопластов объединяется.

8.4. Генная терапия

Целью медико-биологических исследований является создание ме­тодов лечения наследственных заболеваний. Нормальная работа организ­ма обеспечивается функциями множества взаимосвязанных генов, мута­ция даже в одном из них может иметь самые разные последствия. Так, мутация, в результате которой изменяется активность того или иного фер­мента, может приводить к накоплению токсичного субстрата или дефи­циту соединения, необходимого для нормального функционирования клет­ки; мутация в гене, кодирующем структурный белок, - к нарушениям на уровне клеток, тканей и органов; мутация в гене, экспрессирующемся в одной ткани, может сказаться на другой ткани и привести к появлению множества симптомов. Наследственные заболевания имеют сложные кли­нические проявления, их лечение носит во многом симптоматический характер. Некоторые нарушения корректируют назначением специальной диеты или заместительной терапии, проводят трансплантацию костного мозга. Лечение обычно длительное, дорогое, часто малоэффективное. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных генов предпринимаются попытки использовать их для коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на моле­кулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ех vivo и in vivo.

Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:

■ получение клеток от больного;

■ исправление генетического дефекта путем переноса нужного гена в изолированные клетки с помощью вектора (ретро-, аденовирусного или др.);

■ отбор и накопление генетически «исправленных» клеток;

■ трансплантация

Использование собственных клеток пациента гарантирует, что у него не разовьется на них иммунный ответ.

Генная терапия in vivo предполагает доставку нужного гена непос­редственно в клетки определенной ткани пациента. Разработаны разно­образные вирусные и невирусные векторные системы доставки генов, учитывающие характер потенциальных тканей-мишеней (кожа, мышцы, легкие, мозг, селезенка, печень, клетки крови и др.).

Перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. Так, в опухолевые клетки последовательно вводят ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и ганцикловир. В результате образуется ганцикловирт- рифофсфат, токсичный для быстроделящихся клеток.

В качестве лекарственных средств можно использовать олигонук- леотиды. С помощью так называемых антисмысловых олигонуклеотидов можно подавить экспрессию гена того или иного наследственного забо­левания. Введенный в клетку-мишень антисмысловой олигонуклеотид гибридизуется со специфической мРНК и блокирует ее трансляцию. Изу­чается терапевтическое действие различных олигонуклеотидов: модифи­цированных с помощью генетической инженерии рибозимов, расщепля­ющих специфические мРНК, особых нуклеотидов-аптамеров, которые связываются со специфическими белками и блокируют их функции и др.

8.5. Контроль безопасности в области молекулярной

биотехнологии

Молекулярная биотехнология оказывает все большее влияние на разные стороны жизни современного общества (сельское хозяйство, ме­дицину и др.), поэтому необходимо учитывать все возникающие при этом проблемы - этические, правовые, экономические и социальные. Сомне­ния в безопасности работ с рекомбинантными ДНК привели к разработке строгих правил, регулирующих исследования в этой области, и утвержде­нию требований, которым должны удовлетворять продукты, полученные методами биотехнологии. Производство и поступление на рынок фарма­цевтических продуктов, полученных с помощью генно-инженерных тех­нологий, как правило, не требует специального контроля помимо подтвер­ждения их аутентичности и контролируемых показателей свойств.

В отношении пищевых добавок, полученных с помощью методов генетической инженерии, используется прецедентный подход для реше­ния вопроса об их биобезопасности. Каждый продукт должен пройти те­стирование на соответствие ряду специфических критериев в зависимо­сти от своей природы, прежде чем он будет разрешен к употреблению человеком.

Генная инженерия человека включает генную терапию соматиче­ских клеток и клеток зародышевой линии. Первая становится важным ме­тодом лечения различных заболеваний. Существуют специальные прави­ла, регулирующие исследования в этой области, и биомедицинские эти­ческие критерии, которым должны соответствовать все эксперименты, свя­занные с медициной. Генная терапия клеток зародышевой линии (сперма­тозоидов, яйцеклеток, зигот) может оказать нежелательное воздействие на последующие поколения, поэтому в настоящее время она запрещена. Запрещены в большинстве стран все эксперименты по клонированию че­ловека, однако, не исключена возможность, что в будущем этот вопрос будет пересмотрен.

В РФ существует система государственного регулирования в облас­ти генно-инженерной деятельности. Федеральный закон РФ, принятый в 1996 г., предусматривает необходимость общей координации и разра­ботки системы безопасности, устанавливает уровни риска потенциально вредного воздействия генно-инженерной деятельности на здоровье чело­века и определяет виды генно-инженерной деятельности, подлежащей ли­цензированию. К ним относятся все виды работ по созданию генетически модифицированных организмов (ГМО), их испытанию, выпуску в окру­жающую среду, использованию для производства препаратов, утилиза­ции отходов и т. п. Координацию действий исполнительной власти и заинтересованных субъектов РФ по реализации этого закона осуществ­ляет Межведомственная комиссия по проблемам генно-инженерной дея­тельности, создания и поддержания централизованного банка данных в области биобезопасности.

Экспертный совет Минпромнауки России по вопросам биобезопас­ности в целях обеспечения объективности и надлежащего уровня каче­ства проверки представленных заявителем сведений о безопасности ГМО проводит экспертизу этих сведений и устанавливает наличие или отсут­ствие нежелательного воздействия ГМО на окружающую среду. Государ­ственная стратегия обеспечения биобезопасности в России отвечает по­ложениям Международных Конвенций «О биологическом разнообразии», «О защите прав и достоинства человека в связи с применением достиже­ний биологии и медицины» и открывает возможности для гармонизации национального механизма биобезопасности с международными аналога­ми. РФ является членом Международного центра генной инженерии и биотехнологии и принимает его устав.

Глава 9. ПРИМЕНЕНИЕ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

9.1. Химиотерапия инфекционных заболеваний

Термин «химиотерапия» относится к лечению инфекционных бо­лезней путем системного применения антибиотиков или других лекар­ственных препаратов. В ее основе лежит избирательное действие химио- терапевтического препарата, подавляющего размножение патогенного микроорганизма без нарушения функций организма хозяина, что помога­ет его защитным силам справиться с инфекцией.

Химиотерапевтический препарат будет эффективным при следую­щих условиях:

1) при его использовании для лечения или профилактики заболевания, вызванного чувствительным к данному препарату микроорганизмом;

2) при достижении в тканях его концентрации, достаточной для подав­ления роста инфицирующего агента;

3) при достаточно продолжительном периоде лечения;

4) при отсутствии тяжелых побочных реакций. Терапевтическое действие препарата обеспечивают следующие фак­торы: сохранение стабильности структуры при введении в организм, ско­рость абсорбции и элиминации, способность к проникновению в ткани и биологические жидкости. Основными критериями оценки эффективно­сти антимикробных препаратов являются терапевтический индекс и до­стижимая концентрация в сыворотке.

Терапевтический индекс-частное отделения величины минималь­ной токсической дозы препарата на величину минимальной дозы, прояв­ляющей антимикробную активность; более высокое значение соответству­ет большей эффективности препарата.

Достижимая концентрация в сыворотке - величина, зависящая от массы тела пациента, дозы препарата, способа и схемы введения и ско­рости его элиминации из организма. Этот показатель не отражает концен­трацию препаратов в тканях организма, которая может значительно пре­вышать концентрацию в сыворотке.

Принципы химиотерапии. Факторы, которые необходимо учитывать при выборе химиотерапевтического средства, представлены в табл. 13.

Таблица 13 Факторы, которые необходимо учитывать при назначении химиотерапевтического препарата Фактор | Показатели Микробиологический Природа инфицирующего агента, его чувст­вительность к химиотерапевтическим препа­ратам. Фармакологический Дозировка, интервал между приемами препа­рата, продолжительность лечения. Общий клинический и токсикологический Общее состояние больного: возраст, беремен­ность, генетические факторы, сопутствующие заболевания и лечение, состояние печени, по­чек, иммунной системы и т. д. Побочные реакции Вторичные инфекции, авитаминоз, дисбакте- риоз, иммунные реакции и т. д. Эпидемиологический Частота распространения устойчивых штам­мов в среде, окружающей больного. Предот­вращение распространения устойчивости.

 

Микробиологический фактор. Природа инфицирующего агента и его чувствительность к химиотерапевтическим препаратам является ос­новой для выбора последних. Следует также учитывать возможность раз­