Для HJIC рекомендованы такие методы:
увеличение рабочего разбавления препарата (за счет большого объема фосфатного буферного раствора);
добавление специфических инактиваторов (например, пеницилли- назы для b-лактамных антибиотиков) или веществ, замещающих антиметаболит (например, парааминобензойной кислоты для сульфаниламидов);
использование неспецифических инактиваторов-нейтрализаторов, особенно для препаратов с консервантами, например, 0,3-0,4 % раствор твина-80 и твина-20; 0,1-0,5 % раствор соевого лецитина, гистидина, которые предварительно вносят в питательную среду.
Если все перечисленные методы неэффективны, а лекарственное вещество растворимо, то используют метод мембранной фильтрации.
16.4. Контроль стерильности лекарственных препаратов
Целью испытания на стерильность является подтверждение полного отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в объекте. В некоторых случаях, например, в производстве вакцин проводят испытания на полное отсутствие вирусов в объекте.
Анализу подлежит каждая партия препарата. За партию (серию) принимают количество препарата, для которого вероятность нарушения или недостижения стерильности одинакова. Достоверность испытания на стерильность зависит от нескольких факторов: объема (массы) образца для анализа; состава и качества питательных сред; используемого метода исследования; соблюдения асептичных условий проведения анализа.
Объем образца.
В связи с тем, что метод испытания является разрушающим, отбирать на анализ большое количество образцов невыгодно, вместе с тем есть риск получить неадекватный ответ, если проводить испытание на малом числе образцов из серий большого объема. Размер выборочной пробы устанавливают в зависимости от вида стерилизации и числа единиц в серии. Если лекарственное средство стерилизуют паром под давлением 0,11±0,02 МПа и температуре 121 °С, то образец состоит из 10 единиц, независимо от числа образцов в серии. При других видах стерилизации минимальное количество образцов определяют по формуле:
п = OAsfN,
где: и - число единиц для анализа; iV-число единиц в исследуемой серии, при этом п должно быть не менее 3 и не более 40.
Качество питательных сред. Питательные среды должны быть максимально пригодны для контроля микроорганизмов, т. е. учитывать различные потребности, обеспечивающие прорастание клеток, хотя известно, что универсальной среды практически быть не может. По современной НТД применяют жидкие питательные среды тиогликолевую и Сабу- ро, а для иммунобиологических - только тиогликолевую. Эта среда обладает некоторыми преимуществами: снижает окислительно-восстановительный потенциал и способствует росту анаэробных микроорганизмов, обеспечивает рост грибов, нейтрализует антимикробное действие некоторых консервантов.
Контроль качества питательных сред проводят путем проверки стерильности и ростовых свойств для доказательства отсутствия торможения роста. В качестве тест-микроорганизмов для тиогликолевой среды используют определенные штаммы Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Для проверки ростовых свойств среды Сабуро используют Candida albicans.
Для контроля стерильности проверяют 5 % от партии приготовленной питательной среды путем выдерживания в термостате при температуре 30-35 °С 48 ч для тиогликолевой и 20-25 °С 70-72 ч для среды Сабуро.
Метод анализа. Контроль стерильности можно проводить двумя методами: прямым посевом образца в питательные среды и мембранной фильтрацией. При прямом посеве испытуемый препарат предварительно растворяют или суспендируют и вносят в среду в количестве, зависящем от объема содержимого одной единицы: если в ампуле 1 мл, то весь объем, для ампул объема 1^4- мл засевают 1 мл, если объем составляет 5-19 мл - 2 мл, для объема 20-100 мл - 2-4 мл, а при анализе содержимого флаконов объемом более 100 мл предпочтительным является метод мембранной фильтрации. Объем питательной среды должен в 10 раз превышать объем образца для посева.
Посевы втиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35 °С, а в среде Сабуро -20-25 °С. Продолжительность инкубации 14 суток.
Интерпретация результатов. Посевы просматривают ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других признаков микробного роста. Выявленный рост подтверждают микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Препарат считают стерильным при отсутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе) испытание проводят повторно на таком же количестве образцов. При отсутствии роста испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям. В случае роста микроорганизмов при повтором посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, обнаруженными в первичном посеве испытуемый препарат считают нестерильным. Если выявлена другая морфологическая группа, то испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста в третьем испытании препарат считают стерильным. Если хотя бы в одной пробирке обнаружен рост, испытуемый препарат считают нестерильным.
Испытание на стерильность методом мембранной фильтрации. Испытание проводят с использованием открытой или замкнутой системы. При испытании в открытой системе используют фильтродержатели и мембраны диаметром 47 мм. Метод основан на фильтрации образца через мембрану с порами 0,45 мкм со скоростью, предотвращающей проскок микроорганизмов. При испытании препаратов с антимикробной активностью после фильтрации мембрану тщательно промывают раствором, объем которого определен заранее. Предварительно экспериментально определяют тип и объем промывной жидкости, необходимой для полного удаления антимикробного вещества. Полноту отмывки мембраны можно проверить биологически по тест-микроорганизмам или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Мембрану после отмывания растворяют в 2 мл ацетона и оценивают присутствие антимикробного вещества.
В анализах на стерильность целесообразно использовать мембраны, выполненные из инертных полимерных материалов, не взаимодействующих с антимикробными агентами. Для предотвращения подтекания фильтруемой жидкости под мембрану, применяют мембраны с гидрофобным краем. После фильтрации мембрану стерильными ножницами разрезают пополам и одну часть помещают в тиогликолевую среду, а другую в среду Сабуро с последующим термостатированием в течение 7 суток при ранее указанных температурах. Одновременно проводится контроль на асептичность посева. Используют такую же стерильную установку, через которую пропускают заведомо стерильную жидкость и производят посев. Параллельно ставят контроль на отсутствие следов антимикробного вещества. После внесения мембраны во флакон со средой добавляют суспензию, содержащую приблизительно 100 клеток тест-микроорганизмов. В случае их прорастания делают вывод об устранении антимикробной активности.
Испытание на стерильность в закрытой системе «Стеритест» проводят для препаратов с выраженным антимикробным действием или имеющим объем более 100 мл (инфузионных растворов). Преимуществами метода мембранной фильтрации являются:
1) высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возможности концентрирования или удержания на мембране даже единичных клеток при пропускании большого объема препарата;
2) высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при устранении антимикробной активности;
3) сокращенные сроки испытания.
К ограничениям метода мембранной фильтрации можно отнести необходимость проведения испытания в строго асептичных условиях (при использовании открытой системы), необходимость использовать эффективное оборудование, мембранные материалы, а также повышенные требования к квалификации персонала.