Воздействие на микроорганизмы химических ве­ществ с неспецифической антимикробной активностью

Эффективность действия химического вещества на микроорганизм за­висит от его вида и штамма. Некоторые химические вещества обладают ши­роким спектром антимикробного действия. Примером высокоэффективного вещества является этилена оксид, одинаково воздействующий на споровые и вегетативные формы. Штаммовые отличия в чувствительности микроорга­низмов к химическим воздействиям могут быть генотипическими и фено- типическими. Изменения в генотипе часто обусловлены плазмидами и транс- позонами, обеспечивающими чувствительность (резистентность) к химичес­ким воздействиям. Фенотипические различия связаны с составом среды, рН, температурой, концентрацией клеток в объекте. Факторами, определяющи­ми эффективность действия химического вещества на клетки, являются кон­центрация вещества, время контакта с микроорганизмом, температура.

Влияние температуры на активность биоцида выражается фор­мулой:

К,

или

&2Х) =£l5 h

где: К, и К, - константы скорости, a t, и t, - время полной гибели клеток при температуре Тх и Г,, соответственно.

Температурный коэффициент 0 характеризует эффект увеличения температуры на 1 °С и составляет 1,0-5-1,5. Обычно используют показатель ©|0 (или Q ), который характеризует изменение активности биоцида при повышении температуры на 10 °С. Зависимость между © и 0 выражается уравнением:

Например, Q для фенолов и крезолов составляет 3^3,5, для фор­мальдегида - 1,5, для этилена оксида - 2,7.

Повышение эффективности действия с увеличением температуры связано с тем, что при нагревании изменяется скорость реакций, рН и вяз­кость среды. Повышение температуры позволяет снизить концентрацию вещества и уменьшить его расход.

Влияние рН среды на активность биоцида зависит от химической природы последнего. От рН зависит степень ионизации кислых или ос­новных соединений. Для фенолов, бензойной кислоты и др. активность понижена в щелочной среде. Глутаровый альдегид, ЧАС более активны в щелочной среде.

При повышении рН отрицательный заряд клеточной оболочки воз­растает, что увеличивает активность связывания с клеткой таких биоци­дов, как ЧАС и хлоргексидин.

Двухвалентные катионы (Mg+% Са^), присутствующие в жесткой воде, взаимодействуют с клеточной поверхностью и блокируют сайты связывания биоцидов. С другой стороны катионные соединения могут разрушать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, что способ­ствует их проникновению внутрь клетки.

Наличие в среде веществ, защищающих клетки, например, белков, биологических жидкостей (кровь) или веществ, увеличивающих прони­цаемость клеточной стенки (поверхностно-активных веществ) существен­но влияет на проявление антимикробной активности биоцида.

При всем многообразии неспецифических антимикробных веществ, их повреждающее действие может быть обусловлено: денатурацией бел­ков (фенолы, крезолы); инактивацией ферментов (окислители); измене­нием осмотических свойств клетки (ПАВ). Высокоактивные соединения (Р-пропиолактон, этилена оксид) обладают комплексным действием: алкили- рутот амино-, имино-, гидроксил-, карбоксил-группы, реагируют с тио- и ди- сульфидными группами. Более подробно этот материал изложен в главе 11.

17.2. Асептика. Антисептика. Стерилизация

Асептика - это комплекс мероприятий, направленных на предуп­реждение попадания микробов на (в) какой-либо объект: операционное поле, микробиологический бокс, определенные производственные поме­щения, стерильный раствор или препарат (растворы для инъекций, глаз­ные капли). Работа микробиологов, хирургов и работников, связанных с изготовлением и использованием лекарственных препаратов, проводит­ся с применением метода асептики. Создание асептических условий пре­дусматривает дезинфекцию помещений, стерилизацию аппаратов, инст­рументов и материалов.

Антисепитка обозначает использование химических веществ (ан­тисептиков), убивающих или подавляющих микробов, находящихся в кон­такте с макроорганизмом.

Стерилизацией называют процесс полного уничтожения или уда­ления из объекта всех жизнеспособных форм микроорганизмов. При сте­рилизации фармацевтической продукции требуется обеспечить высокий уровень гарантированной стерилизуемости объектов. Наиболее часто при­меняемым стандартом является гарантия того, что после стерилизации партии препарата, из 106 единиц, количество нестерильных единиц будет равно или менее 1, то есть вероятность нестерильности объекта составля­ет 10~6 при сохранении биологических свойств препарата.

При выборе промышленного метода стерилизации руководствуют­ся определенными критериями.

Учитывают устойчивость объекта к стерилизующему воздействию (термическую, радиационную, светоустойчивость). После стерилизации не допускается снижение биологической активности препарата более, чем на 1-2 % по сравнению с исходным уровнем.

Учитывают эффективность воздействия на различные микроорга­низмы или эффективность их удаления из объекта стерилизации.

Выбранный метод должен иметь максимальную гарантию безопаснос­ти для работающих и жителей прилегающих к предприятию районов (это особенно важно при использовании установок радиационной стерилизации).

Для проведения стерилизации необходимо иметь соответствующие технологические установки (автоклавы, сухожаровые, газовые стерили­заторы и др.)

Выбранный метод должен быть экономически выгодным.

Оценка бионагрузки. Уровень гарантии качества стерилизации за­висит от бионагрузки стерилизуемого материала (рис. 13). Оценка био-


о н
\. -3 ч . s
\
х

 

 


Рис. 13. Зависимость качества стерилизации от бионагрузки


нагрузки включает определение числа микроорганизмов, контаминирую- щих данный объект. При этом может быть произведена оценка их видово­го состава (МАФАМ, грибы и дрожжи, анаэробы) путем использования селективных питательных сред (ГОСТ Р ИСО 11737-1-2000).

Оценка бионагрузки сырья должна производиться поставщиком, на котором лежит ответственность за соответствие качества предусмотренной спецификации. Контроль может также производиться получателем сырья.

Снижение уровня бионагрузки медицинского оборудования дости­гается его предварительной очисткой. В процессе производства следует принимать меры, ограничивающие возможность размножения микроор­ганизмов в период, предшествующий стерилизации (табл. 30).

Таблица 30

Основные методы стерилизации медицинского оборудования

Оборудование Метод обработки Примечание
Шприцы стеклян­ные Сухой жар Автоклавирование не реко­мендуется вследствие плохого проникновения пара внутрь корпуса; корпус и поршень стерилизуют отдельно
Шприцы одноразо­вые Радиация , этилена ок­сид Возможно повреждение этиле­на оксидом
Иглы металличе­ские Сухой жар  
Иглы одноразовые Радиация , этилена ок­сид  
Металлические ин­струменты, вклю­чая скальпели Сухой жар , автоклави- рование Режущий край следует защи­щать от повреждений
Одноразовые инструменты Радиация*, этилена ок­сид  
Резиновые перчат­ки Автоклавирование, радиация , этилена оксид После автоклавирования су­шить с осторожностью
Оборудование для инъекций Радиация , этилена ок­сид  
Детали респирато­ра Автоклавирование, если возможно - сухой жар Не рекомендуется химическая стерилизация, опасная для па­циента
Аппараты для диа­лиза Химическая (формалин) дезинфекция Этилена оксид не рекоменду­ется
Термолабильное оборудование Этилена оксид  
* - предпочитаемый метод

 

В промышленности используют две группы методов стерилизации, основанные на уничтожении или удалении микроорганизмов. Для унич­тожения присутствующих в объекте микроорганизмов применяют терми­ческую, химическую и лучевую стерилизацию. Удаляют микроорганиз­мы из объекта путем мембранной фильтрации.

17.2.1. Термическая стерилизация

Объектами являются оборудование, коммуникации, арматура, пита­тельные среды, добавки, готовые лекарственные формы (инъекционные и инфузионные растворы термоустойчивых веществ), материалы первич­ной упаковки для стерильной продукции, установки для стерилизующего фильтрования, технологическая одежда.

Теплоносителями могут быть: водяной пар под давлением, текучий пар, сухой горячий воздух. Острый пар подается непосредственно в объект (аппарат), глухой пар - в рубашку стерилизатора. Стерилизацию термо­стабильных растворов проводят в стерильных укупоренных флаконах или ампулах в автоклавах при избыточном давлении 0,11 МП А, что соответ­ствует температуре 121 °С в течение 8-15 мин в зависимости от объема препарата. Эффективность автоклавирования составляет Ю"6. Установки для стерилизующего фильтрования стерилизуют в течение 45 мин при температуре 121 °С, а технологическую одежду при такой же температу­ре в течение 40-60 мин.

Некоторые термоустойчивые инъекционные препараты стерилизу­ют текучим паром при температуре 100 °С в течение 30 мин. Материалы первичной упаковки для стерильных препаратов (ампулы, флаконы) мож­но стерилизовать сухим горячим воздухом при температуре 180 °С 2 часа. Эффективность такого метода стерилизации составляет 10~12. Длитель­ное время стерилизации плохо сказывается на показателях качества стек­ла, поэтому для материалов первичной упаковки используют другие ре­жимы обработки: при температуре 300 °С - 20 мин или 350 °С - 2 мин. Стерилизацию ведут в потоке стерильного воздуха, очищенного от меха­нических частиц, при этом одновременно со стерилизацией проходит и депирогенизация обрабатываемых объектов.

17.2.2. Стерилизация газами и химическими растворами

Объектами стерилизации являются термолабильные медицинские изделия из резины и полимерных материалов, лечебные пленки, линзы, резиновые соски, тюбики для глазных капель. Основным действующим веществом является этилена оксид. Это соединение используют в смеси со взрывобезопасными газами - двуокисью углерода, или бромистым ме­тилом, для улучшения движения газа внутри объекта. Эффективность сте­рилизации составляет 10-2, обработку осуществляют в герметично закры­вающихся аппаратах типа автоклава, к которым присоединен баллон с газом.

Антимикробная активность зависит от концентрации биоцида, вре­мени обработки, температуры и влажности среды обработки. Оптималь­ными условиями являются: концентрация газа 50-100 мг/л, время 1-6 ч, температура 50-60 °С, влажность - 30-60 %.

Сдерживает широкое применение этого метода высокая токсичность этилена оксида для персонала и его способность взаимодействовать с ком­понентами объекта. После стерилизации для удаления этилена оксида проводят активную или пассивную десорбцию. При активной десорбции стерильную продукцию продувают стерильным воздухом, при пассивной - выдерживают в течение 20 сут.

Для биотехнологии стерилизацию с использованием химических растворов используют ограниченно, например, для обработки датчиков контрольно-измерительных приборов, применяемых для замера опреде­ленных параметров. В качестве стерилизующего используют 6 % раствор водорода пероксида (Н202). Обработку ведут при температуре 18 °С - 6 ч, а при 50 °С - 3 ч.

Для стерилизации (дезинфекции) аппаратов для диализа рекомен­дован формальдегид. Он менее опасен, чем этилена оксид, не горюч, его утечку можно контролировать по запаху; транспортировка формаль­дегида в виде водного раствора относительно безопасна (не требует бал­лонов).

17.2.3. Радиационная и УФ стерилизация

Объектами радиационной стерилизации являются изделия из поли­мерных материалов: контейнеры для инфузионных растворов, системы для взятия и переливания крови, одноразовые шприцы, чашки Петри из полимерных материалов, бакпечатки.

Эффективность радиационной стерилизации Ю-6. Обработку про­водят в специальных камерах проходного типа (рис. 14), стерилизуют в потоке у-излучения 2 раза по 5 мин. Стерилизующаяся доза 25-30 кГр. Сдерживает широкое применение этого метода наличие прямого и кос­венного повреждающего действия радиации на объект.


 

В промышленности УФ-стерилизацию используют очень ограничен­но. Например, в производстве некоторых вакцинных препаратов, или для стерилизации полимерных планшетов с сухими биохимическими реакти­вами для экспресс-идентификации микроорганизмов. УФ-облучение в процессах фармацевтического производства используют для снижения содержания микроорганизмов в воздухе производственных помещений в сочетании с обработкой химическими веществами.

17.2.4. Стерилизующая фильтрация жидкостей

Объектами являются термолабильные растворимые компоненты питательных сред и добавки (40 % раствор глюкозы, растворы аммиака, фенилуксусной кислоты), термолабильные растворимые лекарственные субстанции (полупродукты), термолабильные парентеральные лекарствен­ные препараты, иммунобиологические препараты, органические раство­рители, растворы дезинфицирующих веществ. Эффективность стерили­зации 10"3.

Обязательным является проведение предварительной фильтрации через мембраны с порами 5 мкм и 0,5 мкм, а затем раствор подают на стерилизующую фильтрацию через мембрану с порами 0,22 мкм. Для предфильтрации можно использовать фильтры из пористых или керами­ческих материалов. Однако их существенными недостатками являются опасность попадания частиц фильтрующего материала в фильтрат, а так­же адсорбция некоторых веществ (белков) материалом фильтра. Для сте­рилизующего фильтрования используют микрофильтрационные мембра­ны, удаляющие частицы размером 0,1-10 мкм. Однако для удаления ви­русов из термолабильных жидкостей используют ультрафильтрационные мембраны, задерживающие частицы размером 0,001-0,1 мкм. Мембраны изготавливают из различных полимерных материалов: эфиров целлюло­зы, полиамида, лавсановой пленки. Для удобства использования выпус­кают в виде патронов или дисков.

Для достижения эффективной стерилизации необходимо предвари­тельно проверить размер пор мембраны, герметичность установки и пра­вильно выбрать режим фильтрования (продолжительность работы, дав­ление (вакуум).

Размер пор мембран оценивают микробиологическим методом с использованием клеток Brevundimonas diminuta, диаметр которых со­ставляет 0,3 мкм (для фильтров с диаметром пор 0,22 мкм). Для фильтров с диаметром пор 0,45 мкм тест-организмом служит Serratia marcescens, размер клеток которого не превышает 0,5 мкм. Концентрация взвеси со­ставляет 107 клеток в 100 мл.

Герметичность установки проверяют пузырьковым тестом. Точка пузырька - это минимальное давление воздуха или газа, необходимое для вытеснения жидкости с поверхности фильтра. Для предотвращения не­контролируемого размножения микроорганизмов на фильтре и возникно­вения пирогенности инъекционного раствора, следует максимально со­кратить время от начала фильтрации до получения стерильного раствора. В соответствии с требованиями GMP это время не должно превышать 8 ч.

Исходная контаминация растворов, подаваемых на стерилизующую фильтрацию, должна быть минимальной, не более 100 клеток в 1 мл ра­створа. С увеличением концентрации будет возрастать возможность по­падания в фильтрат микроорганизмов мелких размеров, имеющих изви­тую форму или лишенных жесткой клеточной стенки.

17.2.5. Новые методы стерилизации

Существующие виды стерилизации обладают теми или иными ог­раничениями, особенно в отношении термолабильных веществ. Исследу­ются возможности применения новых видов стерилизации - световые лучи высокой интенсивности и низкотемпературная плазма. Однако они не пригодны для препаратов, содержащих белки и нуклеиновые кислоты.

Высокоинтенсивная световая стерилизация основана на исполь­зовании генератора коротких вспышек световых волн широкого спектра от ксеноновой лампы, интенсивность которых в 100000 раз превышает интенсивность лучей солнечного спектра. Световая стерилизация может быть использована для воды и растворов таких веществ, как глюкоза, на­трия хлорид и т. п., не содержащих частиц или молекул, поглощающих свет и помещенных в ампулы из материалов, пропускающих УФ лучи.

Низкотемпературная плазма. Плазма - это газ или пар, который под действием электрического или магнитного поля переходит в ионизи­рованное состояние и представляет собой смесь нейтральных частиц, ионов и электролитов, где положительно и отрицательно заряженные ча­стицы находятся в равновесии.

Плазма может быть генерирована из разных веществ, но наиболь­шей антимикробной активностью обладает плазма из хлора, глутарового альдегида и водорода пероксида.

Стерилизация с использованием низкотемпературной плазмы при­менима для тех же объектов, что и стерилизация этилена оксидом, т. е. к изделиям, но не лекарственным веществам.

Плазменный стерилизатор представляет собой камеру, вместимос­тью около 75 л, из которой удаляется воздух, а затем в нее подают водоро­да пероксид (пар), который под действием электрического поля перехо­дит в состояние плазмы. Альтернативно могут быть использованы пары надуксусной кислоты или смеси кислорода, водорода и инертного газа. Время стерилизации от 60 до 90 мин при температуре менее 50 °С. Пре­имуществом такого способа перед газовой стерилизацией с использова­нием этилена оксида является исключение необходимости десорбции газа и отсутствие коррозии или порчи режущих инструментов.

17.2.6. Контроль эффективности работы стерилизующих устройств

Для контроля соблюдения выбранного режима стерилизации исполь­зуют несколько групп методов. Технические методы контроля предус­матривают периодическую проверку показаний манометров, термомет­ров, термопар, дозиметрических устройств. Такой контроль проводят по­верочные службы на предприятии.

Химические методы контроля основаны на использовании различ­ных веществ, изменяющих свой цвет или физическое состояние при сте­рилизации, в частности, имеющих соответствующую температуру плав­ления. Запаянные ампулы с порошком, предварительно смешанным с кра­сителем, помещают в стерилизационную камеру. При достижении в ка­мере определенной температуры порошок плавится, образуя равномер­но окрашенный расплав (табл. 31).

Таблица 31

Температура плавления химических веществ-индикаторов

Название вещества Температура плавления, °С
Бензонафтол
Антипирин
Резорцин
Бензойная кислота

 

Некоторые химические индикаторы изменяют цвет под воздействи­ем этилена оксида или определенной дозы ионизирующего излучения. Имеются индикаторы, реагирующие на температуру и время стерилиза­ции, индикаторы, регистрирующие полноту удаления воздуха из автокла­ва и др.

Наиболее полную информацию о соблюдении режима стерилиза­ции дают методы биологического контроля. Показателем служит гибель тест-микроорганизмов, используемых в качестве контроля, при этом тест- культура должна быть устойчивой к стерилизующему воздействию (табл. 32).

Таблица 32

Биологические индикаторы, рекомендуемые ЕР 2002 для мониторинга процессов стерилизации

Метод стерилизации Вид микроорганизма Инокулюм D
Пар под давлением, 121 °С Bacillus stearothermophilus >5,5x103 >1,5 мин
Сухой жар, 160 °С Bacillus subtilis var. niger >1х105 5-10 мин
Водорода пероксид и надуксусная кислота Bacillus stearothermophilus >5xl05 -
Этилена оксид* {ЕЮх) Bacillus subtilis var. niger >5xl05 >2,5 мин
Формальдегид Bacillus subtilis var. niger >5xl05 -
Ионизирующее излучение Bacillus pumilus >lxl07 1,9 кГр
Примечание: * - при температуре 54 °С, относительной влажности 60 %, концентрации ЕЮх 600 мг/мл.

 

Биоиндикатор для контроля работы автоклава представляет собой суспензию спор Bacillus stearothermophilus 106/мл в жидкой питательной среде мясо-пептонный бульон с добавлением индикатора бромкрезолово- го пурпурного. Ампулу помещают в автоклав вместе со стерилизуемым объектом. После стерилизации биоиндикатор помещают в термостат при температуре 55 °С. При неэффективной стерилизации оставшиеся жизне­способными споры прорастают, дают изменение цвета индикатора рН среды, а в результате размножения клеток среда становится мутной. Не­достаток использования биоиндикаторов по сравнению с химическими состоит в ретроспективности ответа. Для его преодоления создана систе­ма, предусматривающая определение фермента а-глюкозидазы, свидетель­ствующего о жизнеспособности спор и определяемого с помощью реак­ции превращения нефлуоресцирующего субстрата во флуоресцирующий продукт за 1 час. Эта система рекомендована для контроля стерилизации паром под давлением.

Общие требования к организации контроля работы стерилизующих устройств:

1) контроль должен быть постоянным в связи с возможными дефекта­ми в работе стерилизующих устройств;

2) средства контроля должны устанавливаться в наименее благоприят­ных для стерилизующего действия местах;

3) при использовании биоиндикаторов необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы исключить попадание индикатор­ных микроорганизмов в сферу производства.

Контроль стерилизации и гарантия качества Качество стерилизации может быть гарантировано мониторингом всех процессов и определением установленных критериев:

• определение бионагрузки;

• мониторинг окружающей среды;

• валидация и текущий мониторинг процессов стерилизации;

• определение стерильности.

При таких процессах, как термическая или радиационная стерили­зация, гарантией качества является проведение процесса с соблюдением всех регламентированных параметров. В этом случае контроль стериль­ности не требуется.

Валидация и текущий мониторинг процесса стерилизации Процедура валидации процесса стерилизации паром под давлением включает следующие показатели:

■ калибровка и проверка всех контрольно-измерительных приборов, используемых в процессе мониторинга (манометры, термопары, тай­меры);

0 оценка качества пара (соответствия давления пара температуре в сте- рилизационной камере);

■ проверка герметичности камеры как пустой, так и загруженной;

■ использование биологических индикаторов для оценки полноты сте­рилизации;

» проверка воспроизводимости процесса стерилизации (не менее трех раз);

■ документирование всех данных.

17.3. Промышленная дезинфекция

Дезинфекцией называют комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов на (в) объектах внешней среды с помо­щью механических, физических и химических средств и воздействий. В медицине под дезинфекцией понимают процесс уничтожения преиму­щественно патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды с целью прервать передачу инфекционного агента от больного человека к здоровому, В условиях производства важно избавиться и от сапрофитных микроорганизмов, причем число их видов возрастает в соответствии с нор­мативными требованиями к микробной чистоте объектов производства.

Объектами промышленной дезинфекции являются воздух производ­ственных помещений, поверхности помещений, оборудования, коммуни­каций. Частным случаем дезинфекции можно считать промышленную антисептику. Это отдельная область дезинфекции, которая предусматри­вает использование химических веществ неспецифического антимикроб­ного действия (антисептиков) для уничтожения или подавления размно­жения микроорганизмов на поверхности кожи (реже слизистых оболоч­ках) персонала, занятого в производстве.

В медицине сущность антисептических мероприятий заключается в использовании антимикробных препаратов при обработке ран, полос­тей, операционного поля, рук персонала для борьбы с возбудителями ин­фекционных заболеваний. Дезинфекцию на предприятиях химико-фар- мацевти-ческой промышленности осуществляют в ходе подготовки к ра­боте с целью достижения необходимого уровня микробной чистоты по­мещений (при создании помещений определенных классов чистоты), обо­рудования и готового продукта.

Антисептики используют в комплексе санитарно-гигиенических мероприятий при подготовке персонала к работе и в ходе выполнения тех­нологического процесса (в асептических производствах). Различают ме­ханическую, физическую и химическую дезинфекцию. При механичес­кой дезинфекции микроорганизмы только удаляют с объекта, а не унич­тожают, что происходит при влажной уборке, стирке, проветривании.

К физическим методам относят ультрафиолетовую (УФ) обработку. Используют дуговые, газоразрядные низкого давления, бактерицидные лампы ДБ-15, ДБ-30, ДБ-60 (в зависимости от мощности), с длиной вол­ны излучения 253,7 н. м. Срок службы лампы составляет 1500-2000 ч. К концу срока мощность и, следовательно, эффективность воздействия на микроорганизмы снижается на 50 % от исходного уровня. Лампы пря­мого действия используют только в отсутствие персонала, а рассеянного (экранированные) можно применять в процессе работы. Экранированные лампы размещают не ниже 2 м от уровня пола. Гибель микроорганизмов происходит в верхних слоях воздуха, а нижние слои обеззараживаются за счет конвекции. Повышают эффективность обработки специальные уст­ройства для рециркуляции воздуха. Поток воздуха из помещения пропус­кают через камеру, в которую вмонтированы лампы УФО, и возвращают после обработки в то же помещение. Специальные лампы повышенной мощности позволяют проводить дезинфекцию методом вспышки (напри­мер, для обработки 30 м3 воздушной фазы требуется всего 2 мин, для 60 м3-5 мин).

К ограничениям использования УФО относится токсическое дей­ствие на персонал выделяющихся озона (О,) и оксида азота (N0), а также неблагоприятное действие на сетчатку глаз.

К химической дезинфекции относят обработку объекта химически­ми веществами-дезинфектантами: обмывание, протирание, погружение, орошение при распылении дезинфектанта (аэрозольная обработка). Аэро­зольная обработка позволяет уменьшить расход дезинфектанта и его раз­рушающее воздействие на обрабатываемую поверхность, обработать труд­нодоступные места. Эффективность воздействия повышается с уменьше­нием размера аэрозольных частиц. Оптимальным является размер частиц 1-10 мкм, сопоставимый с размером микробных клеток.