Эффективность действия химического вещества на микроорганизм зависит от его вида и штамма. Некоторые химические вещества обладают широким спектром антимикробного действия. Примером высокоэффективного вещества является этилена оксид, одинаково воздействующий на споровые и вегетативные формы. Штаммовые отличия в чувствительности микроорганизмов к химическим воздействиям могут быть генотипическими и фено- типическими. Изменения в генотипе часто обусловлены плазмидами и транс- позонами, обеспечивающими чувствительность (резистентность) к химическим воздействиям. Фенотипические различия связаны с составом среды, рН, температурой, концентрацией клеток в объекте. Факторами, определяющими эффективность действия химического вещества на клетки, являются концентрация вещества, время контакта с микроорганизмом, температура.
Влияние температуры на активность биоцида выражается формулой:
К,
или
&{Т2-ТХ) =£l5 h
где: К, и К, - константы скорости, a t, и t, - время полной гибели клеток при температуре Тх и Г,, соответственно.
Температурный коэффициент 0 характеризует эффект увеличения температуры на 1 °С и составляет 1,0-5-1,5. Обычно используют показатель ©|0 (или Q ), который характеризует изменение активности биоцида при повышении температуры на 10 °С. Зависимость между © и 01О выражается уравнением:
Например, Q для фенолов и крезолов составляет 3^3,5, для формальдегида - 1,5, для этилена оксида - 2,7.
Повышение эффективности действия с увеличением температуры связано с тем, что при нагревании изменяется скорость реакций, рН и вязкость среды. Повышение температуры позволяет снизить концентрацию вещества и уменьшить его расход.
Влияние рН среды на активность биоцида зависит от химической природы последнего. От рН зависит степень ионизации кислых или основных соединений. Для фенолов, бензойной кислоты и др. активность понижена в щелочной среде. Глутаровый альдегид, ЧАС более активны в щелочной среде.
При повышении рН отрицательный заряд клеточной оболочки возрастает, что увеличивает активность связывания с клеткой таких биоцидов, как ЧАС и хлоргексидин.
Двухвалентные катионы (Mg+% Са^), присутствующие в жесткой воде, взаимодействуют с клеточной поверхностью и блокируют сайты связывания биоцидов. С другой стороны катионные соединения могут разрушать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, что способствует их проникновению внутрь клетки.
Наличие в среде веществ, защищающих клетки, например, белков, биологических жидкостей (кровь) или веществ, увеличивающих проницаемость клеточной стенки (поверхностно-активных веществ) существенно влияет на проявление антимикробной активности биоцида.
При всем многообразии неспецифических антимикробных веществ, их повреждающее действие может быть обусловлено: денатурацией белков (фенолы, крезолы); инактивацией ферментов (окислители); изменением осмотических свойств клетки (ПАВ). Высокоактивные соединения (Р-пропиолактон, этилена оксид) обладают комплексным действием: алкили- рутот амино-, имино-, гидроксил-, карбоксил-группы, реагируют с тио- и ди- сульфидными группами. Более подробно этот материал изложен в главе 11.
17.2. Асептика. Антисептика. Стерилизация
Асептика - это комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов на (в) какой-либо объект: операционное поле, микробиологический бокс, определенные производственные помещения, стерильный раствор или препарат (растворы для инъекций, глазные капли). Работа микробиологов, хирургов и работников, связанных с изготовлением и использованием лекарственных препаратов, проводится с применением метода асептики. Создание асептических условий предусматривает дезинфекцию помещений, стерилизацию аппаратов, инструментов и материалов.
Антисепитка обозначает использование химических веществ (антисептиков), убивающих или подавляющих микробов, находящихся в контакте с макроорганизмом.
Стерилизацией называют процесс полного уничтожения или удаления из объекта всех жизнеспособных форм микроорганизмов. При стерилизации фармацевтической продукции требуется обеспечить высокий уровень гарантированной стерилизуемости объектов. Наиболее часто применяемым стандартом является гарантия того, что после стерилизации партии препарата, из 106 единиц, количество нестерильных единиц будет равно или менее 1, то есть вероятность нестерильности объекта составляет 10~6 при сохранении биологических свойств препарата.
При выборе промышленного метода стерилизации руководствуются определенными критериями.
Учитывают устойчивость объекта к стерилизующему воздействию (термическую, радиационную, светоустойчивость). После стерилизации не допускается снижение биологической активности препарата более, чем на 1-2 % по сравнению с исходным уровнем.
Учитывают эффективность воздействия на различные микроорганизмы или эффективность их удаления из объекта стерилизации.
Выбранный метод должен иметь максимальную гарантию безопасности для работающих и жителей прилегающих к предприятию районов (это особенно важно при использовании установок радиационной стерилизации).
Для проведения стерилизации необходимо иметь соответствующие технологические установки (автоклавы, сухожаровые, газовые стерилизаторы и др.)
Выбранный метод должен быть экономически выгодным.
Оценка бионагрузки. Уровень гарантии качества стерилизации зависит от бионагрузки стерилизуемого материала (рис. 13). Оценка био-
о н |
\. -3 ч . s |
\ |
х |
Рис. 13. Зависимость качества стерилизации от бионагрузки
нагрузки включает определение числа микроорганизмов, контаминирую- щих данный объект. При этом может быть произведена оценка их видового состава (МАФАМ, грибы и дрожжи, анаэробы) путем использования селективных питательных сред (ГОСТ Р ИСО 11737-1-2000).
Оценка бионагрузки сырья должна производиться поставщиком, на котором лежит ответственность за соответствие качества предусмотренной спецификации. Контроль может также производиться получателем сырья.
Снижение уровня бионагрузки медицинского оборудования достигается его предварительной очисткой. В процессе производства следует принимать меры, ограничивающие возможность размножения микроорганизмов в период, предшествующий стерилизации (табл. 30).
Таблица 30
Основные методы стерилизации медицинского оборудования
Оборудование | Метод обработки | Примечание |
Шприцы стеклянные | Сухой жар | Автоклавирование не рекомендуется вследствие плохого проникновения пара внутрь корпуса; корпус и поршень стерилизуют отдельно |
Шприцы одноразовые | Радиация , этилена оксид | Возможно повреждение этилена оксидом |
Иглы металлические | Сухой жар | |
Иглы одноразовые | Радиация , этилена оксид | |
Металлические инструменты, включая скальпели | Сухой жар , автоклави- рование | Режущий край следует защищать от повреждений |
Одноразовые инструменты | Радиация*, этилена оксид | |
Резиновые перчатки | Автоклавирование, радиация , этилена оксид | После автоклавирования сушить с осторожностью |
Оборудование для инъекций | Радиация , этилена оксид | |
Детали респиратора | Автоклавирование, если возможно - сухой жар | Не рекомендуется химическая стерилизация, опасная для пациента |
Аппараты для диализа | Химическая (формалин) дезинфекция | Этилена оксид не рекомендуется |
Термолабильное оборудование | Этилена оксид |
* - предпочитаемый метод |
В промышленности используют две группы методов стерилизации, основанные на уничтожении или удалении микроорганизмов. Для уничтожения присутствующих в объекте микроорганизмов применяют термическую, химическую и лучевую стерилизацию. Удаляют микроорганизмы из объекта путем мембранной фильтрации.
17.2.1. Термическая стерилизация
Объектами являются оборудование, коммуникации, арматура, питательные среды, добавки, готовые лекарственные формы (инъекционные и инфузионные растворы термоустойчивых веществ), материалы первичной упаковки для стерильной продукции, установки для стерилизующего фильтрования, технологическая одежда.
Теплоносителями могут быть: водяной пар под давлением, текучий пар, сухой горячий воздух. Острый пар подается непосредственно в объект (аппарат), глухой пар - в рубашку стерилизатора. Стерилизацию термостабильных растворов проводят в стерильных укупоренных флаконах или ампулах в автоклавах при избыточном давлении 0,11 МП А, что соответствует температуре 121 °С в течение 8-15 мин в зависимости от объема препарата. Эффективность автоклавирования составляет Ю"6. Установки для стерилизующего фильтрования стерилизуют в течение 45 мин при температуре 121 °С, а технологическую одежду при такой же температуре в течение 40-60 мин.
Некоторые термоустойчивые инъекционные препараты стерилизуют текучим паром при температуре 100 °С в течение 30 мин. Материалы первичной упаковки для стерильных препаратов (ампулы, флаконы) можно стерилизовать сухим горячим воздухом при температуре 180 °С 2 часа. Эффективность такого метода стерилизации составляет 10~12. Длительное время стерилизации плохо сказывается на показателях качества стекла, поэтому для материалов первичной упаковки используют другие режимы обработки: при температуре 300 °С - 20 мин или 350 °С - 2 мин. Стерилизацию ведут в потоке стерильного воздуха, очищенного от механических частиц, при этом одновременно со стерилизацией проходит и депирогенизация обрабатываемых объектов.
17.2.2. Стерилизация газами и химическими растворами
Объектами стерилизации являются термолабильные медицинские изделия из резины и полимерных материалов, лечебные пленки, линзы, резиновые соски, тюбики для глазных капель. Основным действующим веществом является этилена оксид. Это соединение используют в смеси со взрывобезопасными газами - двуокисью углерода, или бромистым метилом, для улучшения движения газа внутри объекта. Эффективность стерилизации составляет 10-2, обработку осуществляют в герметично закрывающихся аппаратах типа автоклава, к которым присоединен баллон с газом.
Антимикробная активность зависит от концентрации биоцида, времени обработки, температуры и влажности среды обработки. Оптимальными условиями являются: концентрация газа 50-100 мг/л, время 1-6 ч, температура 50-60 °С, влажность - 30-60 %.
Сдерживает широкое применение этого метода высокая токсичность этилена оксида для персонала и его способность взаимодействовать с компонентами объекта. После стерилизации для удаления этилена оксида проводят активную или пассивную десорбцию. При активной десорбции стерильную продукцию продувают стерильным воздухом, при пассивной - выдерживают в течение 20 сут.
Для биотехнологии стерилизацию с использованием химических растворов используют ограниченно, например, для обработки датчиков контрольно-измерительных приборов, применяемых для замера определенных параметров. В качестве стерилизующего используют 6 % раствор водорода пероксида (Н202). Обработку ведут при температуре 18 °С - 6 ч, а при 50 °С - 3 ч.
Для стерилизации (дезинфекции) аппаратов для диализа рекомендован формальдегид. Он менее опасен, чем этилена оксид, не горюч, его утечку можно контролировать по запаху; транспортировка формальдегида в виде водного раствора относительно безопасна (не требует баллонов).
17.2.3. Радиационная и УФ стерилизация
Объектами радиационной стерилизации являются изделия из полимерных материалов: контейнеры для инфузионных растворов, системы для взятия и переливания крови, одноразовые шприцы, чашки Петри из полимерных материалов, бакпечатки.
Эффективность радиационной стерилизации Ю-6. Обработку проводят в специальных камерах проходного типа (рис. 14), стерилизуют в потоке у-излучения 2 раза по 5 мин. Стерилизующаяся доза 25-30 кГр. Сдерживает широкое применение этого метода наличие прямого и косвенного повреждающего действия радиации на объект.
В промышленности УФ-стерилизацию используют очень ограниченно. Например, в производстве некоторых вакцинных препаратов, или для стерилизации полимерных планшетов с сухими биохимическими реактивами для экспресс-идентификации микроорганизмов. УФ-облучение в процессах фармацевтического производства используют для снижения содержания микроорганизмов в воздухе производственных помещений в сочетании с обработкой химическими веществами.
17.2.4. Стерилизующая фильтрация жидкостей
Объектами являются термолабильные растворимые компоненты питательных сред и добавки (40 % раствор глюкозы, растворы аммиака, фенилуксусной кислоты), термолабильные растворимые лекарственные субстанции (полупродукты), термолабильные парентеральные лекарственные препараты, иммунобиологические препараты, органические растворители, растворы дезинфицирующих веществ. Эффективность стерилизации 10"3.
Обязательным является проведение предварительной фильтрации через мембраны с порами 5 мкм и 0,5 мкм, а затем раствор подают на стерилизующую фильтрацию через мембрану с порами 0,22 мкм. Для предфильтрации можно использовать фильтры из пористых или керамических материалов. Однако их существенными недостатками являются опасность попадания частиц фильтрующего материала в фильтрат, а также адсорбция некоторых веществ (белков) материалом фильтра. Для стерилизующего фильтрования используют микрофильтрационные мембраны, удаляющие частицы размером 0,1-10 мкм. Однако для удаления вирусов из термолабильных жидкостей используют ультрафильтрационные мембраны, задерживающие частицы размером 0,001-0,1 мкм. Мембраны изготавливают из различных полимерных материалов: эфиров целлюлозы, полиамида, лавсановой пленки. Для удобства использования выпускают в виде патронов или дисков.
Для достижения эффективной стерилизации необходимо предварительно проверить размер пор мембраны, герметичность установки и правильно выбрать режим фильтрования (продолжительность работы, давление (вакуум).
Размер пор мембран оценивают микробиологическим методом с использованием клеток Brevundimonas diminuta, диаметр которых составляет 0,3 мкм (для фильтров с диаметром пор 0,22 мкм). Для фильтров с диаметром пор 0,45 мкм тест-организмом служит Serratia marcescens, размер клеток которого не превышает 0,5 мкм. Концентрация взвеси составляет 107 клеток в 100 мл.
Герметичность установки проверяют пузырьковым тестом. Точка пузырька - это минимальное давление воздуха или газа, необходимое для вытеснения жидкости с поверхности фильтра. Для предотвращения неконтролируемого размножения микроорганизмов на фильтре и возникновения пирогенности инъекционного раствора, следует максимально сократить время от начала фильтрации до получения стерильного раствора. В соответствии с требованиями GMP это время не должно превышать 8 ч.
Исходная контаминация растворов, подаваемых на стерилизующую фильтрацию, должна быть минимальной, не более 100 клеток в 1 мл раствора. С увеличением концентрации будет возрастать возможность попадания в фильтрат микроорганизмов мелких размеров, имеющих извитую форму или лишенных жесткой клеточной стенки.
17.2.5. Новые методы стерилизации
Существующие виды стерилизации обладают теми или иными ограничениями, особенно в отношении термолабильных веществ. Исследуются возможности применения новых видов стерилизации - световые лучи высокой интенсивности и низкотемпературная плазма. Однако они не пригодны для препаратов, содержащих белки и нуклеиновые кислоты.
Высокоинтенсивная световая стерилизация основана на использовании генератора коротких вспышек световых волн широкого спектра от ксеноновой лампы, интенсивность которых в 100000 раз превышает интенсивность лучей солнечного спектра. Световая стерилизация может быть использована для воды и растворов таких веществ, как глюкоза, натрия хлорид и т. п., не содержащих частиц или молекул, поглощающих свет и помещенных в ампулы из материалов, пропускающих УФ лучи.
Низкотемпературная плазма. Плазма - это газ или пар, который под действием электрического или магнитного поля переходит в ионизированное состояние и представляет собой смесь нейтральных частиц, ионов и электролитов, где положительно и отрицательно заряженные частицы находятся в равновесии.
Плазма может быть генерирована из разных веществ, но наибольшей антимикробной активностью обладает плазма из хлора, глутарового альдегида и водорода пероксида.
Стерилизация с использованием низкотемпературной плазмы применима для тех же объектов, что и стерилизация этилена оксидом, т. е. к изделиям, но не лекарственным веществам.
Плазменный стерилизатор представляет собой камеру, вместимостью около 75 л, из которой удаляется воздух, а затем в нее подают водорода пероксид (пар), который под действием электрического поля переходит в состояние плазмы. Альтернативно могут быть использованы пары надуксусной кислоты или смеси кислорода, водорода и инертного газа. Время стерилизации от 60 до 90 мин при температуре менее 50 °С. Преимуществом такого способа перед газовой стерилизацией с использованием этилена оксида является исключение необходимости десорбции газа и отсутствие коррозии или порчи режущих инструментов.
17.2.6. Контроль эффективности работы стерилизующих устройств
Для контроля соблюдения выбранного режима стерилизации используют несколько групп методов. Технические методы контроля предусматривают периодическую проверку показаний манометров, термометров, термопар, дозиметрических устройств. Такой контроль проводят поверочные службы на предприятии.
Химические методы контроля основаны на использовании различных веществ, изменяющих свой цвет или физическое состояние при стерилизации, в частности, имеющих соответствующую температуру плавления. Запаянные ампулы с порошком, предварительно смешанным с красителем, помещают в стерилизационную камеру. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя равномерно окрашенный расплав (табл. 31).
Таблица 31
Температура плавления химических веществ-индикаторов
Название вещества | Температура плавления, °С |
Бензонафтол | |
Антипирин | |
Резорцин | |
Бензойная кислота |
Некоторые химические индикаторы изменяют цвет под воздействием этилена оксида или определенной дозы ионизирующего излучения. Имеются индикаторы, реагирующие на температуру и время стерилизации, индикаторы, регистрирующие полноту удаления воздуха из автоклава и др.
Наиболее полную информацию о соблюдении режима стерилизации дают методы биологического контроля. Показателем служит гибель тест-микроорганизмов, используемых в качестве контроля, при этом тест- культура должна быть устойчивой к стерилизующему воздействию (табл. 32).
Таблица 32
Биологические индикаторы, рекомендуемые ЕР 2002 для мониторинга процессов стерилизации
Метод стерилизации | Вид микроорганизма | Инокулюм | D |
Пар под давлением, 121 °С | Bacillus stearothermophilus | >5,5x103 | >1,5 мин |
Сухой жар, 160 °С | Bacillus subtilis var. niger | >1х105 | 5-10 мин |
Водорода пероксид и надуксусная кислота | Bacillus stearothermophilus | >5xl05 | - |
Этилена оксид* {ЕЮх) | Bacillus subtilis var. niger | >5xl05 | >2,5 мин |
Формальдегид | Bacillus subtilis var. niger | >5xl05 | - |
Ионизирующее излучение | Bacillus pumilus | >lxl07 | 1,9 кГр |
Примечание: * - при температуре 54 °С, относительной влажности 60 %, концентрации ЕЮх 600 мг/мл. |
Биоиндикатор для контроля работы автоклава представляет собой суспензию спор Bacillus stearothermophilus 106/мл в жидкой питательной среде мясо-пептонный бульон с добавлением индикатора бромкрезолово- го пурпурного. Ампулу помещают в автоклав вместе со стерилизуемым объектом. После стерилизации биоиндикатор помещают в термостат при температуре 55 °С. При неэффективной стерилизации оставшиеся жизнеспособными споры прорастают, дают изменение цвета индикатора рН среды, а в результате размножения клеток среда становится мутной. Недостаток использования биоиндикаторов по сравнению с химическими состоит в ретроспективности ответа. Для его преодоления создана система, предусматривающая определение фермента а-глюкозидазы, свидетельствующего о жизнеспособности спор и определяемого с помощью реакции превращения нефлуоресцирующего субстрата во флуоресцирующий продукт за 1 час. Эта система рекомендована для контроля стерилизации паром под давлением.
Общие требования к организации контроля работы стерилизующих устройств:
1) контроль должен быть постоянным в связи с возможными дефектами в работе стерилизующих устройств;
2) средства контроля должны устанавливаться в наименее благоприятных для стерилизующего действия местах;
3) при использовании биоиндикаторов необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы исключить попадание индикаторных микроорганизмов в сферу производства.
Контроль стерилизации и гарантия качества Качество стерилизации может быть гарантировано мониторингом всех процессов и определением установленных критериев:
• определение бионагрузки;
• мониторинг окружающей среды;
• валидация и текущий мониторинг процессов стерилизации;
• определение стерильности.
При таких процессах, как термическая или радиационная стерилизация, гарантией качества является проведение процесса с соблюдением всех регламентированных параметров. В этом случае контроль стерильности не требуется.
Валидация и текущий мониторинг процесса стерилизации Процедура валидации процесса стерилизации паром под давлением включает следующие показатели:
■ калибровка и проверка всех контрольно-измерительных приборов, используемых в процессе мониторинга (манометры, термопары, таймеры);
0 оценка качества пара (соответствия давления пара температуре в сте- рилизационной камере);
■ проверка герметичности камеры как пустой, так и загруженной;
■ использование биологических индикаторов для оценки полноты стерилизации;
» проверка воспроизводимости процесса стерилизации (не менее трех раз);
■ документирование всех данных.
17.3. Промышленная дезинфекция
Дезинфекцией называют комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов на (в) объектах внешней среды с помощью механических, физических и химических средств и воздействий. В медицине под дезинфекцией понимают процесс уничтожения преимущественно патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды с целью прервать передачу инфекционного агента от больного человека к здоровому, В условиях производства важно избавиться и от сапрофитных микроорганизмов, причем число их видов возрастает в соответствии с нормативными требованиями к микробной чистоте объектов производства.
Объектами промышленной дезинфекции являются воздух производственных помещений, поверхности помещений, оборудования, коммуникаций. Частным случаем дезинфекции можно считать промышленную антисептику. Это отдельная область дезинфекции, которая предусматривает использование химических веществ неспецифического антимикробного действия (антисептиков) для уничтожения или подавления размножения микроорганизмов на поверхности кожи (реже слизистых оболочках) персонала, занятого в производстве.
В медицине сущность антисептических мероприятий заключается в использовании антимикробных препаратов при обработке ран, полостей, операционного поля, рук персонала для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний. Дезинфекцию на предприятиях химико-фар- мацевти-ческой промышленности осуществляют в ходе подготовки к работе с целью достижения необходимого уровня микробной чистоты помещений (при создании помещений определенных классов чистоты), оборудования и готового продукта.
Антисептики используют в комплексе санитарно-гигиенических мероприятий при подготовке персонала к работе и в ходе выполнения технологического процесса (в асептических производствах). Различают механическую, физическую и химическую дезинфекцию. При механической дезинфекции микроорганизмы только удаляют с объекта, а не уничтожают, что происходит при влажной уборке, стирке, проветривании.
К физическим методам относят ультрафиолетовую (УФ) обработку. Используют дуговые, газоразрядные низкого давления, бактерицидные лампы ДБ-15, ДБ-30, ДБ-60 (в зависимости от мощности), с длиной волны излучения 253,7 н. м. Срок службы лампы составляет 1500-2000 ч. К концу срока мощность и, следовательно, эффективность воздействия на микроорганизмы снижается на 50 % от исходного уровня. Лампы прямого действия используют только в отсутствие персонала, а рассеянного (экранированные) можно применять в процессе работы. Экранированные лампы размещают не ниже 2 м от уровня пола. Гибель микроорганизмов происходит в верхних слоях воздуха, а нижние слои обеззараживаются за счет конвекции. Повышают эффективность обработки специальные устройства для рециркуляции воздуха. Поток воздуха из помещения пропускают через камеру, в которую вмонтированы лампы УФО, и возвращают после обработки в то же помещение. Специальные лампы повышенной мощности позволяют проводить дезинфекцию методом вспышки (например, для обработки 30 м3 воздушной фазы требуется всего 2 мин, для 60 м3-5 мин).
К ограничениям использования УФО относится токсическое действие на персонал выделяющихся озона (О,) и оксида азота (N0), а также неблагоприятное действие на сетчатку глаз.
К химической дезинфекции относят обработку объекта химическими веществами-дезинфектантами: обмывание, протирание, погружение, орошение при распылении дезинфектанта (аэрозольная обработка). Аэрозольная обработка позволяет уменьшить расход дезинфектанта и его разрушающее воздействие на обрабатываемую поверхность, обработать труднодоступные места. Эффективность воздействия повышается с уменьшением размера аэрозольных частиц. Оптимальным является размер частиц 1-10 мкм, сопоставимый с размером микробных клеток.