Толерантностьи аутоиммунитет

Толерантность (неотвечаемость) обеспечивает отсутствие иммун­ного ответа на собственные антигены организма, т. е. иммунная система толерантна к подавляющему большинству антигенов тканей организма (ауто- антигенов). В ряде случаев наблюдают отсутствие ответа на чужеродный антиген. Состояние толерантности поддерживают разнообразные механиз­мы: Т-супрессоры, генетическая рестрикция иммунного ответа, уничтоже­ние клонов Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих соответствующий ре- цепторный идиотип, ограничение антигенпредставляющих клеток и лим­фоцитов. Толерантность к аутоантигенам естественна. Искусственная то­лерантность к чужеродным антигенам может быть достигнута иммуниза­цией по определенной схеме: дробным введением антигена в возрастаю­щих количествах или однократное введение высокой дозы антигена. Аутоиммунитет

При нарушении толерантности к собственным антигенами развива­ются аутоиммунные заболевания, например, системная красная волчан­ка, ревматоидный артрит. Известно несколько механизмов отмены толе­рантности:

® повреждение клеточных мембран, например, при вирусных инфек­циях;

• попадание в организм антигена, эпитопы которого близки к эпито- пам аутоантигена (мимикрирующие антигены);

• связывание чужеродных антигенов с клетками организма (см. аллер­гические реакции III типа);

• острая травма тканей может привести к освобождению антигенов, обычно изолированных от иммунной системы, например, повреж­дение глаза может вызвать иммунную реакцию на его антигены, ко­торые будут распознаны как чужеродные;

в активация иммунокомпетентных клеток митогенами;

в расстройство регуляции иммунной системы (дефицит супрессорных клеток, атипичная экспрессия молекул МНС II класса).

12.5. Влияние факторов внешней среды на формирование защитных систем организма

Функционирование макроорганизма, в том числе систем неспеци­фической защиты и иммунитета зависит от факторов окружающей среды, которые подразделяют на следующие группы:

■ абиотические (климат, магнитное поле, химический состав воздуха, воды, почвы);.

■ биотические (микробиота, флора, фауна);

■ антропогенные, среди которых выделяют химические (выбросы про­мышленных предприятий, транспорта, контакт с химическими ве­ществами в быту и на производстве), физические (электромагнит­ные волны, радиация, шум, вибрация), биологические (выбросы про­мышленных предприятий и др.) и социально-экологические (демог­рафические сдвиги, изменение характера питания и бытовых усло­вий, психофизические нагрузки и др.).

Нормальная микробиота человека играет существенную роль в функционировании организма. Она способствует созреванию и поддер­жанию'иммунной системы; микроорганизмы, колонизирующие слизис­тые оболочки, индуцируют образование антител (IgA), составляя основу местного иммунитета. Продукты нормальной микробиоты, постоянно проникая в кровь, оказывают влияние на метаболизм организма. Наруше­ние симбиоза микро- и макроорганизма вызывает расстройство обмен­ных процессов, приводящее к развитию аллергических и других заболе­ваний. Большинство представителей нормальной микробиоты обладают антагонистическими свойствами по отношению к патогенным микроор­ганизмам, выделяя кислоты, спирты, лизоцим, бактериоцины, способные тормозить развитие гнилостных бактерий в кишечнике, ингибируя обра­зование энтеропатогенными эшерихиями термолабильного токсина, из­бирательно связывая поверхностные рецепторы эпителиальных клеток. Микроорганизмы принимают участие в детоксикации попадающих из внешней среды ксенобиотиков и эндогенных токсических продуктов.

Нарушение нормальной микробиоты создает благоприятные усло­вия для колонизации макроорганизма новыми видами, причем эти про­цессы сопровождаются формированием иммунной недостаточности, что обусловливает развитие внутрибольничных (госпитальных) инфекций. Последнее связано с подавлением нормальной микробиоты терапевтичес­кими антимикробными препаратами, а также с использованием современ­ной медициной многочисленных манипуляционных вмешательств (кате­теризация, бронхоскопия, плазмаферез, зондирование и др.), которые мо­гут служить причиной инвазивной агрессии госпитальных штаммов.

Химические вещества, широко использующиеся в повседневной жизни и загрязняющие биосферу, попадая в организм, могут вызывать различные нарушения - местное раздражающее действие, бронхоспазмы. повреждение барьеров проницаемости (кожа, эпителий), способствующее проникновению микроорганизмов. При хроническом воздействии наблю­дается активация Т-супрессоров, что приводит к развитию иммунологи­ческой толерантности и угнетенного факторов неспецифической резис­тентности.

Возможно образование конъюгированных антигенов и индукция реакций, истощающих иммунную систему, мутагенный эффект.

Контакт с пестицидами может сопровождаться подавлением бакте­рицидных свойств кожи и слизистых, изменением состава их микробио­ты, угнетением фагоцитарной активности лейкоцитов. Хроническое воз­действие этих веществ приводит к негативным изменениям ряда показа­телей иммунитета, развитию аллергических реакций. К тяжелым послед­ствиям приводит употребление детьми воды с высокой концентрацией нитратов и нитритов. Присутствие в воздухе значительных количеств сер­нистого ангидрида, бензола, паров серной кислоты, окиси углерода угне­тает фагоцитарную активность лейкоцитов, что коррелирует с повышен­ным уровнем заболеваемости гриппом, острыми респираторными забо­леваниями, бронхитом. Тяжелые металлы (свинец, кадмий, ртуть, берил­лий) подавляют механизмы неспецифической резистентности, вызывают аллергические заболевания.

Электромагнитные волны и поля СВЧ при хроническом воздей­ствии влияют на фагоцитарную активность лейкоцитов, нарушают син­тез антител.

Шум с интенсивностью 60-90 дБ в течение 2 мес. и более способ­ствует угнетению бактерицидной активности сыворотки крови, сниже­нию титров нормальных и специфических антител.

Климатические факторы (атмосферное давление, температура и влажность воздуха, солнечный свет) индивидуальны для определенных регионов, а проживающее там население адаптировано к привычным ус­ловиям жизни, поэтому при перемене места жительства в период приспо­собления к новой среде наблюдается повышение заболеваемости в связи с ослаблением защитных механизмов организма. Выраженность откло­нений иммунного статуса населения от средних значений по стране сви­детельствует о существенной зависимости показателей иммунитета от метеорологических условий региона проживания.

Недостаточность питания при ее умеренном проявлении не вы­зывает глубоких повреждений иммунной реактивности. Однако при хро­нической белково-калорийной дефицитности отмечается снижение актив­ности фагоцитоза, систем комплемента и пропердина, образования ин­терферона, лизоцима, антител, падение содержания Т- и В-лимфоцитов. Дефицит витаминов и железа снижает сопротивляемость тканевых барь­еров, а в сочетании с недостатком белка угнетает активность иммунных реакций. Угнетение иммунитета наблюдается и при дефиците в рационе нуклеиновых кислот.

Ионизирующая paduaifim вызывает увеличение проницаемости за­щитных барьеров для микроорганизмов, продуктов распада тканей, ток­синов и т.п., резко угнетает бактерицидное действие кожи и слизистых оболочек, блокирует барьерную функцию лимфатических узлов и селе­зенки. У лиц с лучевой болезнью ослабляется воспалительная реакция и фагоцитоз, поэтому организм утрачивает способность локализовать ин­фекционный процесс. Для облученного организма характерно удлинение сроков очищения от патогена, склонность к генерализованным инфекци­ям, снижение резистентности к условно-патогенным микроорганизмам, бактериальным токсинам, резкое изменение состава нормальной микро­биоты, изменение функций клеток и органов иммунной системы.

Таким образом, все многообразие факторов внешней среды оказы­вает дозо- и хронозависимое воздействие на защитные системы организ­ма, что может создавать условия для развития различных патологических процессов.

Глава 13. ИММУНОПРЕПАРАТЫ. ПРОИЗВОДСТВО И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Основные достижения иммунологии, связанные с практическим использованием научных результатов, направлены на профилактику и лечение инфекционных и неинфекционных заболеваний, Иммунопре- параты, особенно вакцины, в этом отношении оказываются значительно полезнее, чем какие-либо фармацевтические продукты.

13.1. Вакцины

Вакцины-это препараты, содержащие антигены одного или несколь­ких возбудителей инфекционных заболеваний, и предназначенные для создания искусственного активного иммунитета с целью профилактики и лечения соответствующего заболевания. Термин предложил Пастер в честь Дженнера, который в 1796 г. показал, что прививки коровьей оспы - вакцинация (vaccina - коровья) - эффективна для профилактики натураль­ной оспы. Вакцина Дженнера - гениальное эмпирическое достижение; развитие иммунологии инфекционных болезней как науки, основанной на знании их этиологии, начинается с открытия Пастера, доказавшего воз­можность ослабления вирулентности возбудителей с сохранением их им­мунологических свойств и создавшего вакцину против бешенства и си­бирской язвы. Это открытие послужило основой для разработки живых вакцин, содержащих микроорганизмы с ослабленной вирулентностью (ат- тенуированные).

Продолжение этих исследований привело к созданию вакцин для профилактики многих инфекционных заболеваний. Работы по созданию новых вакцин направлены на получение более совершенных препаратов с учетом изменяющейся эпидемиологической обстановки в мире.

13.1.1. Основные типы вакцинных препаратов

Живые вакцины готовят из аттенуированных штаммов микроорга­низмов, которые получают в основном путем селекции спонтанных му­тантов с ослабленной вирулентностью. Для этого микроорганизмы дли­тельное время культивируют в неблагоприятных для них условиях или пассируют на невосприимчивых животных. Например, для получения вакцинного штамма BCG (Bacillus Calmette, Guerin) Mycobacterium tuberculosis пассировали 13 лет (230 пересевов) на среде с желчью. Анти- рабическая вакцина была получена Пастером путем многократного (113 пассажей) пассирования инфекционного агента на кроликах до по­лучения так называемого фиксированного вируса, т.. вируса с определен­ным значением вирулентной для кролика дозы и безопасного для человека.

Используют также вакцинные штаммы, полученные путем индуци­рованных мутаций или генетических рекомбинаций. Такие штаммы тре­буют длительного контроля ввиду опасности реверсии к исходному виру­лентному типу.

Живые вакцины используют для профилактики бактериальных (си­бирская язва, туляремия, бруцеллез, туберкулез, чума, сыпной тиф, жел­тая лихорадка, лихорадка Ку) и вирусных (полиомиелит, корь, грипп, эпи­демический паротит) инфекций.

Убитые вакцины получают из клеток высокоиммуногенных штам­мов, инактивированных физическим (нагревание, ультрафиолетовые лучи) или химическим (фенол, этанол, ацетон, формальдегид) методами. Их используют для профилактики бактериальных (брюшной тиф, сыпной тиф, коклюш, холера, лептоспирозы, синегнойная инфекция) и вирусных (кле­щевой энцефалит, гепатит А, герпес, бешенство, грипп) инфекций. Для лечения хронических заболеваний используют вакцины из убитых бакте­рий, выделенных от больного (стафилококков, гонококков, шигелл, бру- целл и др.).

Расщепленные и субъединичные (химические) вакцины готовят из антигенных фракций микробных клеток. Примерами бактериальных хи­мических вакцин могут служить брюшнотифозная вакцина, содержащая гликоконъюгаты клеточных стенок Salmonella spp., капсульные полисаха­риды Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria menin­gitidis и др. Вирусные химические вакцины (против гриппа, герпеса, ящу­ра, клещевого энцефалита, бешенства и др.) содержат компоненты повер­хностных структур капсида. Например, гриппозная вакцина «Гриппол» представляет собой раствор поверхностных антигенов гемагглютинина и нейраминидазы, выделенных из вирусов гриппатипов А и В в комплек­се с иммуномодулятором полиоксидонием (см. ниже).

Преимуществом химических вакцин является относительно низкое содержание балластных веществ, высокая стабильность, малая возмож­ность побочного действия и реактогенность. Отсутствие нуклеиновых кислот исключает опасность реверсии к данному типу, потенциально су­ществующую у живых вакцин. Недостаток таких вакцин - более низкая иммуногенность по сравнению с корпускулярными (содержащими клет­ки) вакцинами из-за быстрого выведения антигена из организма. Для про­лонгирования действия их вводят с адъювантами - веществами, усилива­ющими иммунный ответ.

Анатоксины - это обезвреженные, но сохраняющие иммуноген­ность экзотоксины возбудителей столбняка, дифтерии, анаэробной инфек­ции, ботулизма, холеры, стафилококковый, Pseudomonas aeruginosa и др.

Синтетические вакцины разрабатывают с учетом знания структу­ры антигенных детерминант возбудителя определенного заболевания, не­обходимых для создания иммунитета (протективных, Т- и В-клеточных эпитопов). Их достоинствами являются химическая чистота и безопас­ность. Примером такой вакцины может служить препарат, содержащий синтетический аналог протеина клеточной мембраны малярийного плаз­модия. Этот протеин обеспечивает контакт плазмодия с оболочкой эрит­роцита, образующиеся к нему антитела препятствуют проникновению возбудителя в эритроциты хозяина.

В практику входит компьютерное конструирование вакцин. С раз­витием методов молекулярной биологии появилась возможность выявить, изолировать и клонировать биологические макромолекулы с тем, чтобы использовать их как иммуногенные компоненты в вакцинных конструк­циях. При наличии большого числа геномных данных потенциальные иммуногены определяются с помощью методов биоинформатики и про- теомных технологий.

Генно-инженерные (рекомбинантные) вакцины. Получение ген- но-инженерных вирусных вакцин позволило преодолеть трудности созда­ния иммуногенных препаратов из таких вирусов, которые не удается куль­тивировать в производственных условиях. Успехи генно-инженерных разработок привели к созданию рекомбинантной вакцины против гепатита В, включенной в медицинскую практику многих стран. Препарат содержит полипептидный HbsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В), по­лучаемый методами биотехнологии из дрожжевых клеток, в которых кло­нирован ген, кодирующий этот полипептид. Существенным достоинством вакцины является ее безопасность, т.к. ее изготовление не требует контак­та с возбудителем заболевания.

ДНК-вакцины разрабатываются на основе плазмид, содержащих участки вирусной ДНК. В клетках иммунизированного животного такие плазмиды индуцируют экспрессию антигенов вируса, на которые разви­вается иммунный ответ. При разработке таких вакцин следует учитывать потенциальную опасность злокачественной трансформации клеток организма с участием вакцинной ДНК. Однако имеются заболевания, напри­мер, СПИД, против которых ДНК-вакцина может оказаться перспективной.

Вакцины на основе трансгенных растений являются вакцинами будущего. Показана возможность экспрессии протективных антигенов бактерий и вирусов в листьях и плодах генетически модифицированных растений, скармливание которых экспериментальным животным приво­дило к образованию специфических иммуноглобулинов.

Ассоциированные вакцины - это смесь вакцин, приготовленная и расфасованная в промышленных условиях. Применение ассоциирован­ных вакцин позволяет значительно снизить число вакцинаций. Примером может служить адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) - смесь коклюшной вакцины и очищенных концентри­рованных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия.

Вакцинация незаменима для профилактики инфекционных за­болеваний. Каждая страна имеет свой национальный календарь при­вивок, включающий вакцины, состав которых зависит от эпидеми­ческой обстановки в данной стране и от возможности обеспечения вакцинами.

Кроме того, методы иммунотерапии могут быть использованы для лечения инфекционных онкологических заболеваний, атеросклероза, ги­пертонии и даже наркотической зависимости. Принцип действия таких вакцин - стимулировать образование антител против факторов, опреде­ляющих развитие патологического процесса.

13.1.2. Производство вакцин

Этапы получения вакцин включают выбор штамма, разработку ус­ловий его хранения и культивирования, подготовку посевного материа­ла, накопление биомассы клеток в специальных биореакторах (фермента­торах), отделение микробных клеток от культуральной среды и последу­ющую их обработку. Необходимым этапом является стандартизация вак­цин и контроль их качества.

Выбор штамма имеет решающее значение для получения эффектив­ной и безопасной вакцины. Вакцинные штаммы должны обладать доста­точно высокой иммуногенностью. Иммуногенность вакцины определя­ется в опытах на животных, которых заражают культурой возбудителя после предварительной иммунизации.

Клетки вакциннного штамма должны содержать полный набор ан­тигенов, характерных для данного вида и обеспечивающих протектив- ные свойства вакцины.

Вакцинные штаммы не должны быть высокореактогенными. Ис­пытания реактогенности осуществляют производственные институты на ограниченных группах добровольцев.

Штаммы должны сохранять определенный уровень вирулентно­сти, что особенно важно для живых вакцин.

Вакцинный штамм должен быть аттестован с указанием сведе­ний об истории его выделения, методе аттенуации, иммуногенности, па­тогенности, токсичности и др.

Питательные среды для культивирования и хранения вакцинных штаммов должны отвечать общим требованиям, предъявляемым к пита­тельным средам. Все среды должны быть валидированы.

Среда не должна содержать балластных компонентов, обусловлива­ющих реактогенность и аллергенность препарата. В этом отношении оп­тимальными являются синтетические среды с минимальным содержани­ем компонентов естественных сред.

Требования к сырью должны быть четко определены в документаль­но оформленных спецификациях, содержащих данные о поставщике и способах контроля. Особенно важны микробиологические методы кон­троля. Сырье животного происхождения можно использовать только из тех территорий, которые свободны от прионных заболеваний. В произ­водстве нельзя применять клетки нервной ткани.

Там, где это возможно, следует стерилизовать исходные материалы тепловым методом. Допускается использовать и другие аттестованные методы (стерилизующая фильтрация, ионизирующее излучение). Пред­почтительно, чтобы среды стерилизовались на месте (in situ) или на ли­нии. Все вещества, вводимые в стерильный биореактор (газы, среды, кис­лоты, щелочи, пеногасители и др.), должны быть стерильными.

Посевной материал и банк клеток. Условия хранения и консер­вация культур определяются особенностями штамма. Основные спосо­бы хранения: на питательной среде под слоем масла, при пониженной температуре (в том числе криоконсервирование при температуре от -165 до -196 °С), лиофильное высушивание, обеспечивающее хране­ние до 50 лет. При этом микроорганизмы для сохранения их жизнеспо­собности периодически пересевают на свежие питательные среды.

Для предотвращения нежелательного изменения свойств штамма вследствие многократных пересевов (большого числа генераций) произ­водство иммунобиологических препаратов, получаемых из микробных или клеточных культур, должно быть основано на системе посевных матери­алов или банков клеток. Банк клеток- это система, посредством которой производятся последовательные серии культур, характеризующихся иден­тичностью (клеточные линии) и отсутствием контаминации. Главный банк клеток - культура, распределенная в контейнеры за одну операцию, обыч­но хранится при температуре -70 °С и ниже. Суспензия посевного мате­риала, полученная из главного банка клеток на определенном уровне пас­сажа и расфасованная в отдельные емкости, составляет рабочий банк кле­ток. Эти емкости хранятся в идентичных условиях (обычно при -70 °С и ниже), после взятия из хранилища их более не возвращают.

Отсутствие посторонней микробиоты наряду с регламентированной концентрацией суспензии живых клеток является главнейшим требова­нием к посевному материалу. Поэтому вся работа должна выполняться в чистых помещениях с соблюдением всех требований GMP, причем на ста­диях, предшествующих производственному культивированию, надежность обеспечения асептических условий должна быть тем выше, чем более данная стадия удалена от культивирования.

Культивирование осуществляют в биореакторах (ферментерах) различной емкости. Конструкция биореактора обеспечивает стерилиза­цию питательной среды, перемешивание, аэрацию (при необходимости), введение дополнительных компонентов питательной среды и отбор проб, герметичность для обеспечения асептичных условий процесса, а также автоматическое измерение и регулирование в ходе процесса культивиро­вания температуры, уровня среды, давления в газовой среде, рН, рО,, По­казатели культуры (густота взвеси, микробиологическая чистота, токси- нообразование и др.) определяются в периодически отбираемых пробах. При отборе проб принимают необходимые меры для предупреждения микробной контаминации питательной среды и попадания микроорганиз­мов в окружающую среду.

В биореакторах культивируют не только микроорганизмы, но и клет­ки млекопитающих и растений. К настоящему времени объем биореакто­ров для получения моноклональных антител методом гибридомной тех­нологии достиг 10 м³.

Инактивация микробных клеток. Обезвреживание токсинов. При изготовлении убитых или субъединичных вакцин микробные клетки инак- тивируют физическими или химическими способами. Наиболее часто используют нагревание, обработку этанолом, ацетоном, растворами фе­нола, формальдегида. В специальных случаях используют другие биоци­ды (водорода пероксид, натрия азид, мертиолат, поверхностно-активные вещества и др.), а также ультрафиолетовое облучение. Инактивацию про­водят при тщательном перемешивании, строго соблюдая регламентиро­ванные условия обработки (концентрация биоцида, температура, экспо­зиция) и контролируя полноту инактивации.

Обезвреживание (детоксикация) бактериальных экзотоксинов зак­лючается в их химической модификации, которая приводит к необрати­мому изменению участка белковой молекулы, обеспечивающей ее токси­ческие свойства, при полном сохранении антигенной активности. Полу­ченные при этом препараты (анатоксины) используют для активной им­мунизации. Для обезвреживания чаще всего используют формалин.

Субъединичные вакцины готовят путем извлечения из клеток анти- генноактивной субстанции - протективного антигена, обладающего вы­сокой иммуногенностью. Методы выделения, очистки и концентрирова­ния внутриклеточных продуктов весьма разнообразны, специфичны и постоянно совершенствуются.

Культивирование вирусов осуществляют на эмбрионах птиц и в культуре клеток человека и животных. Ни один из этих субстратов не является абсолютно надежным в отношении возможной контаминации посторонними вирусами. Поэтому важнейшим этапом в технологии про­изводства вирусных препаратов является выбор безопасного субстрата для культивирования вакцинных вирусов. Существуют специальные хозяй­ства, в которых организовано воспроизводство поголовья животных и птиц необходимой кондиции. Однако самым перспективным субстратом для получения вирусного материала являются культуры диплоидных клеток человека и животных.

Для очистки вирусных вакцин применяют методы микро- и ультрафиль­трации, хроматографию на высокопроницаемых сефарозах, модифицирован­ных кремнеземах, пористых полимерных ионитах. На стадии концентриро­вания может быть использовано препаративное ультрацентрифугирование.

13.1.3. Адыоваиты

При высокой степени очистки антигена его иммуногенная активность уменьшается. Это связано с возможным уменьшением стабильности ан­тигена, его быстрым выведением из организма и слабым иммунным отве­том на антигены с малым молекулярным весом и низкой эпитопной плот­ностью. Поэтому создание высокоочищенных антигенных препаратов требует применения адъювантов, усиливающих иммунный ответ. Адью- ванты способны изменить физико-химические свойства антигена (моле­кулярную массу, полимерность, растворимость и др.), что способствует созданию «депо» антигена в организме и замедление его всасывания. С другой стороны адъюванты изменяют динамику развития иммунитета, повышают уровень и увеличивают длительность его сохранения. Свой­ствами адъювантов обладают многие иммуностимуляторы эндогенного, микробного и синтетического происхождения, минеральные масла, ми­неральные основания и соли: алюминия гидроксид, алюминия фосфат, кальция фосфат, кальция хлорид, алюминиево-калиевые квасцы.

Адыовант Фрейнда, широко применяющийся при иммунизации животных, содержит смесь вазелинового масла, ланолина и инактивиро- ванные клетки вакцины BCG или мурамилдипептид.

Особую группу носителей антигенной субстанции составляют ли- посомы и микрокапсулы. Липосо.чы получают путем эмульгирования липидного компонента в водной фазе или наоборот - водного раствора в гидрофобном субстрате при интенсивном перемешивании (например, в ультразвуковом дезинтеграторе). Они обеспечивают создание дискрет­ных частиц, содержащих антиген. Липосомы повышают стабильность ан­тигена, что делает возможным создание препаратов для перорального при­менения, снижают токсичность вакцинного препарата.

Микрокапсулы обеспечивают стабилизацию антигена, позволяют создавать препараты, содержащие несколько антигенов, снизить число вакцинаций, получить препараты для перорального применения.

Среди синтетических полиэлектролитов практическое примене­ние нашел полиоксидоний (сополимер ТЧ-окси-1,4-этиленпиперазина и (Н-карбоксил)-1,4-этиленпиперазиния бромида), на основе которого создана вакцина Гриппол, содержащая очищенные белки - гемагглюти- нин и нейраминидазу вирусов гриппа.

13.1.4. Аллергены

Аллергены - вещества, вызывающие аллергические реакции, исполь­зуют для получения медицинских препаратов, которые применяют для диагностики и лечения аллергических заболеваний. Традиционно аллер­гены получают из природного сырья.

Микробные аллергены. Их используют с целью иммунотерапии больных хроническими инфекционно-аллергическими заболеваниями. Производятся аллергены из Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., E.coli, Pseudomonas aeruginosa и др.

Диагностические аллергены разнообразны по своему составу и спо­собу изготовления. Существуют пыльцевые, бытовые, эпидермальные, пищевые аллергены. Их применяют для выявления иммунологической перестройки организма в результате болезни или вакцинации.

13.2. Иммуномодуляторы

Иммуномодуляторы (иммунокорректоры) - это природные или син­тетические продукты, способные оказывать регулирующее действие на функции иммунной системы. По характеру их влияния на иммунную сис­тему их подразделяют на иммуностимулирующие и иммуносупрессивные.

К иммуностимуляторам относятся препараты тимуса, интерлей- кины, интерфероны, индукторы интерферонов, биологически активные пептиды, полисахариды некоторых грибов, лечебные вакцины. Их актив­ность обусловлена способностью воздействовать на метаболизм клеток и тканей организма, активировать иммунокомпетентные клетки, в резуль­тате чего повышается сопротивляемость организма к инфекционным и неинфекционным заболеваниям.

Иммуностимулирующей активностью обладают пробиотические микроорганизмы (бифидо- и лактобактерии), которые при введении в со­став продуктов питания способствуют восстановлению и поддержанию баланса нормальной микробиоты организма. Иммуностимуляторы при­меняют для лечения и профилактики ряда инфекционных и неинфекци­онных заболеваний.

Основные группы иммуносупрессоров - это гормональные препа­раты, цитостатические средства, антилимфоцитарные и анти-резус им­муноглобулины, моноклональные антитела против определенных рецеп­торов лимфоцитов, некоторые антибиотики (циклоспорин, рапамицин и др.). Их иммуносупрессорная активность связана со способностью уг­нетать гемопоэз, взаимодействовать с белками, участвующими в иммун­ном ответе, ингибиовать синтез нуклеотидов, индуцировать апоптоз лим­фоцитов и др.

Иммуносупрессоры используют для подавления активности лимфо­идных клеток при воспалении, аллергии, трансплантации, лечении ауто­иммунных заболеваний. Как и иммуностимуляторы, их получают из тка­ней животных и растений, путем биосинтеза с применением методов ге­нетической инженерии и химического синтеза.

13.3. Сыворотки и иммуноглобулины

13.3.1. Основные группы препаратов

Препараты, содержащие антитела (плазма, сыворотки, иммуноглобу­лины и др.) создают пассивный иммунитет, который возникает сразу же после их внутривенного введения, а при местном введении содержание ан­тител в крови достигает защитного уровня через 12-44 ч после инъекции. Эти препараты используют для профилактики и лечения иммунодефици- тов, инфекционных, аллергических и других заболеваний. Гомологичные препараты получают из крови здоровых доноров, гетерологичные - из кро­ви животных, в основном лошадей. Гомологичные препараты вызывают побочные реакции у пациентов реже, чем гетерологичные.

Иммуноглобулины человека нормальные содержат антитела к тем инфекционным агентам, с которыми донор имел контакт на протяжении своей жизни в результате болезней, носительства и вакцинации. Уровень антител колеблется в зависимости от эпидемиологической ситуации в ре­гионе проживания донора. Нормальный иммуноглобулин извлекают из пула плазмы крови, полученной не менее чем от 1000 доноров, что позво­ляет нивелировать индивидуальные иммунологические различия крови каждого человека и обеспечивает стандартность препарата. Основным активным компонентом нормальных иммуноглобулинов являются IgG, присутствуют также небольшие количества IgA и IgM. Препарат содер­жит широкий набор антител к возбудителям гриппа, кори, гепатита А и В, ветряной оспы, краснухи, полиомиелита, дифтерии, столбняка, к стафи­лококкам, стрептококкам, энтеробактериям и микробным токсинам. Су­ществуют препараты иммуноглобулинов для внутримышечного, внутри­венного и перорального введения.

Специфические иммуноглобулины человека получают из плазмы доноров, перенесших конкретное инфекционное заболевание, а также иммунизированных в учреждениях службы крови или в противоэпиде­мических целях. Доноров отбирают путем скрининга индивидуальных образцов сыворотки крови по титрам антител. Уровень антител в препа­ратах специфических иммуноглобулинов должен быть в 6-10 раз выше по сравнению с концентрацией антител в нормальном иммуноглобулине. Специфические иммуноглобулины применяют для профилактики и лече­ния некоторых инфекционных заболеваний. С лечебной целью применя­ют также антистафилококковую, антипротейную и антисинегнойную спе­цифическую иммунную плазму человека.

Противоаллергические иммуноглобулины отбирают путем скри­нинга из готовых полуфабрикатов донорского нормального иммуногло­булина по способности защищать морских свинок от смертельного ана­филактического шока на модели пассивной системной анафилаксии и применяют для лечения некоторых аллергических заболеваний.

Для лечения гемолитической болезни новорожденных, вызванной несовместимостью по антигенам системы Rli, и профилактики резус-сен­сибилизации беременных женщин применяют иммуноглобулин анти­резус, который получают из плазмы или сыворотки крови резус-отрица- тельных женщин-доноров.

Гетерологичные специфические сыворотки и иммуноглобулины получают из сыворотки крови животных, чаще лошадей, иммунизиро­ванных определенной вакциной. Используют метод гипериммунизации, т.е. введение животным нарастающих доз антигена, чтобы добиться об­разования максимального количества антител.

13.3.2. Производство препаратов сывороток и иммуноглобулинов

Очистка it концентрация иммунных гетер on огичных сывороток

С целью удаления неактивных балластных белков, повышения эф­фективности иммунных сывороток и получения препаратов с высоким содержанием специфических антител применяют разнообразные методы: Диаферм 3 и его модификации, риванольный, сульфатный, риванол-суль­фатный, спиртовый, полиэтиленгликолевый, каприлатный, используют ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию и их различ­ные сочетания. Постоянное внимание уделяется процессу очистки лоша­диных сывороток. В отличие от человеческого иммуноглобулина, относя­щегося по электрофоретической подвижности к гамма-фракции, в лоша­диных сыворотках антитела сосредоточены в гамма- и бета-глобулинах, а также в промежуточной между ними фракции, обозначенной Ig(T), что затрудняет процесс очистки.

Широкое применение находит метод Диаферм (диализ, фермента­ция), который впервые был предложен в 1936 пив модификациях приме­няется до настоящего времени. Его основные этапы:

■ ферментный гидролиз (пепсином, папаином) белков сыворотки;

■ осаждение балластных белков сульфатом аммония с концентрацией

14-14,5% при рН 4,3;

■ получение фильтрата, содержащего активные фракции;

■ осаждение активных фракций сульфатом аммония с концентрацией

34% при рН 7,1;

■ диализ против проточной воды;

■ дополнительная очистка от балластных белков в их изоэлектрической

точке при рН 5,2-5,6 в присутствии хлороформа (Руководство по

вакцинному и сывороточному делу, 1978).

Пепсин вызывает расщепление молекулы иммуноглобулина с об­разованием фрагмента F(ab)„ папаин - фрагмента Fab (см. рис.7). При­менение в качестве профилактических и лечебных препаратов этих фрагментов, а не цельных молекул антител имеет преимущество, свя­занное с тем, что для нейтрализации антигена (например, токсина) фраг­мент Fc не нужен, а именно он обусловливает развитие сывороточной болезни и анафилактической реакции. Удаление Fc фрагмента приво­дит также к предупреждению нежелательных взаимодействий имму­ноглобулина с Fc-рецепторами тканей, их накопления в тканях и воз­никновения побочных реакций.

Методы фракционирования белков плазмы

Плазма крови является источником многочисленных терапевтиче­ских препаратов. Для их выделения и очистки существуют разнообраз­ные методы: осаждение неорганическими солями (аммония сульфатом, натрия сульфатом); осаждение органическими растворителями (этанолом, эфиром, хлороформом, ацетоном); фракционирование полиэтиленглико- лем; ионный обмен; гельхроматография; препаративный электрофорез; ультрафильтрация.

Белковые компоненты крови довольно близки по своим физико-хи­мическим свойствам, поэтому условия их выделения различаются незна­чительно. В связи с этим проведение технологического процесса требует тщательного соблюдения всех требований регламента и режима каждой операции. В противном случае получаемый продукт будет загрязнен дру­гими белковыми фракциями, что резко ухудшает его качество.

13.3.3. Вирусная безопасность препаратов крови

Лечебно-профилактические препараты, полученные из крови чело­века, могут представлять опасность заражения больного, несмотря на тщательный отбор и обследование доноров. При вирусоносительстве воз­будителей таких заболеваний, как СПИД, гепатит В, гепатит С и других существует серонегативный период различной продолжительности, ког­да противовирусные антитела в крови выявить не удается.

Необходимым этапом в системе обеспечения вирусной безопасно­сти препаратов крови является карантинизация плазмы доноров, т. е. ее выдержка при температуре - 20 °С, продолжительность которой опреде­ляется национальными органами здравоохранения и составляет от 3 до 6 мес. Если за этот период поступают сведения о сероконверсии донора, его плазму не допускают в производство.

Дальнейшие мероприятия направлены на удаление и инактивацию возможно присутствующих вирусов. Например, получение иммуногло­булинов по методу Кона включает операции, снижающие до минимума возможную вирусную контаминацию: доведение рН полупродукта до 4,0, ультрафильтрация при рН 4,0-4,25, выдерживание при рН 4,0^t,25 и тем­пературе +27 °С в течение 21 дня, пепсиновый протеолиз.

Вирусная безопасность должна быть обеспечена не только для по­требителя, но и для лиц, занимающихся заготовкой, контролем, транспор­тировкой и фракционированием плазмы. Поэтому в настоящее время ве­дутся широкие исследования по возможности применения вируцидных стадий обработки индивидуальных образцов плазмы до или после объ­единения в пуловую загрузку. При этом используются стандартные и но­вые перспективные методы: пастеризация, озонирование, гамма-облуче­ние в дозе 20-30 кГр, бета-пропиолактон, ультрафиолетовое облучение, йод-сольвент-детергентный метод, фотоинакгивация. Для большой эффек­тивности используют комбинации нескольких методов.

Методы инактивации или удаления неспецифичны для отдельных вирусов, поэтому способны снизить риск передачи вирусов, о нахожде­нии которых в препарате не было известно.

Эффективность методов инактивации вирусов испытывают на мо­дельных системах. Удовлетворительным считается снижение инфекто- генности предварительно зараженного материала на 99,99 % относитель­но исходного значения. Валидность методов ограничивается пределом чувствительности используемого способа детекции (ПЦР, заражение культуры клеток или чувствительных животных), поэтому используют математическую экстраполяцию кривых инактивации вирусов за преде­лы чувствительности метода до необходимых значений дозы и времени воздействия действующего фактора для полной инактивации, т. е. нуле­вого риска заражения. Метод ПЦР не позволяет отличить инактивиро- ванный вирус от жизнеспособного, поэтому может быть использован только для мониторинга физического удаления вируса, однако FDA при положительных результатах исключает выявляемые серии препаратов из продажи.

13.3.4. Моноклональные антитела

Антитела, присутствующие в плазме крови, образованы многими клонами антителообразующих клеток и, являясь поликлональными, пред­ставляют собою гетерогенную группу иммуноглобулинов. Разнообразие поликлональных антител невоспроизводимо, что осложняет стандарти­зацию препаратов иммуноглобулинов, применяющихся для диагностики, профилактики и лечения соответствующих заболеваний. Наивысшей стан­дартностью и специфичностью обладают моноклональные антитела, ко­торые вырабатываются одним клоном клеток и поэтому идентичны по антигенной специфичности, а также по классу и типу тяжелых и легких цепей в молекуле. Обычные антителообразующие клетки неспособны длительно сохраняться в условиях in vitro. Поэтому в качестве продуцен­тов моноклональных антител используют гибридные клетки (гибридомы), которые получают путем слияния клеток, продуцирующих антитела на определенный антиген, и миеломных клеток, способных к неограничен­ному росту in vitro. Миелома - род злокачественной опухоли, образую­щейся при разрастании плазматических клеток, синтезирующих строго идентичные молекулы иммуноглобулинов неизвестной специфичности.

Культивирование гибридом можно осуществлять in vivo в виде транс­плантируемой опухоли в брюшной полости мышей. Антитела выделяют из асцитической жидкости. Однако этот метод требует соблюдения предель­но строгих санитарно-гигиенических требований, чтобы предотвратить воз­можность инфекционных заболеваний животных и контаминации целевого продукта. Экономически более выгодно выращивание клеток в биореакто­рах. Разработаны различные системы для культивирования клеток в промыш­ленном масштабе, позволяющие получать моноклональные антитела для прак­тического использования. Для выделения и очистки антител используют ме­тоды ионообменной или аффинной хроматографии.

Гибридомы, подобно большинству клеточных культур млекопитаю­щих, растут относительно медленно и требуют сложнбых и дорогих сред. Моноклональные антитела, получаемые с использованием гибридомной технологии, очень дороги, что препятствует их широкому практическому использованию. Поэтому перспективно использование генетически мо­дифицированных микроорганизмов, способных вырабатывать фрагмен­ты иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела, использующиеся в тест-системах имму- ноферментного анализа, позволяют существенно повысить специфичность этого метода, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. Разработаны тест-системы для обнаружения различ­ных соединений (гормонов, маркеров опухоли, маркеров иммунокомпе- тентных клеток, цитокинов, лекарственных препаратов и др.) и патоген­ных микроорганизмов. Последние используются при диагностике хлами- диоза, герпеса, краснухи, гепатита В, легионеллеза, СПИДа и других за­болеваний.

Антитела, специфичные для маркеров опухоли, меченые радиоак­тивным изотопом, используются для определения локализации злокаче­ственных тканей и клеток.

Аффинная хроматография на носителе, конъюгированном со специ­фическими антителами, является эффективным методом выделения и очис­тки биологически активных веществ.

Моноклональные антитела, связанные с лекарственными вещества­ми, могут обеспечить доставку терапевтических агентов к месту их дей­ствия, что позволяет снизить количество вводимого препарата и уси­лить его эффективность. Проводятся исследования по созданию конъю- гатов специфических антител с противоопухолевыми и тромболитичес- кими препаратами. Однако, несмотря на кажущуюся перспективность, метод имеет ряд ограничений, связанных как с трудностями химическо­го присоединения лекарственного препарата к иммуноглобулину, так и с опасностью развития аллергических реакций в ответ на введение чужеродного (мышиного) белка. Поэтому ведутся разработки техноло­гии получения антител, максимально приближенных по структуре к им­муноглобулинам человека, с использованием методов генетической инженерии.