Реферат Курсовая Конспект
Контроль качества иммунобиопрепаратов - раздел Биология, Основы ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Система Государственного Надзора И Контроля За Качеством Биологических Медиц...
|
Система государственного надзора и контроля за качеством биологических медицинских препаратов предусматривает комплекс мероприятий, обеспечивающих поступление в практику здравоохранения полностью безопасных, стандартных и эффективных средств специфической профилактики, лечения и диагностики инфекционных и других заболеваний. Регламентирована система отбора, апробации и внедрения в практику новых иммунобиологических препаратов, обеспечивающая проведение их лабораторного испытания и оценку на ограниченном контингенте добровольцев.
Производство и контроль биопрепаратов регламентируется специальными требованиями. Критерии и параметры, которым должен соответствовать каждый препарат, изложены в Международных требованиях, составляемых группой экспертов ВОЗ. На основании этих требований в каждой стране составляются Национальные требования, которые являются основой для создания технических условий на производство препаратов. В них перечислены все параметры, определяющие стандартность и качество препарата.
Этапы развития системы качества в производстве включают обеспечение и контроль качества по GMP и менеджмент качества на предприятии в соответствии с определенными стандартами. Среди последних большое влияние во всех сферах производства имеют стандарты ISO (International Standartization Organization - Международная Организация Стандартизации). ISO-9000 - это серия международных стандартов управления качеством, определяющих требования и рекомендации для проектирования и реализации плана менеджмента и организации изготовления продукта. В западных странах государственные учреждения не имеют права закупать продукцию у производителя, не имеющего сертификат ISO. Такое же положение постепенно создается и в России.
Высокое качество продукта может быть достигнуто только путем последовательного соблюдения принятых правил производства (GMP), четкого управления и координации действия всех сторон системы качества.
13.4.1. Контроль качества вакцинных препаратов
Качество вакцины обеспечивается следующими основными условиями:
■ использование в производстве хорошо изученного, генетически
стабильного иммуногенного штамма;
Е использование приемлемых питательных сред;
» использование стандартного сырья и реактивов;
■ строгое соблюдение правил GMP и GLP;
■ контроль препарата на соответствие показателям качества.
Контроль вакцин осуществляют на всех стадиях их изготовления,
включая контроль готовой лекарственной формы, в строгом соответствии с утвержденной нормативно-технической документацией. В процессе изготовления контролируют отсутствие посторонних микроорганизмов и сохранение свойств (иммуногенность, токсигенность) вакцинной культуры, При контроле готовых препаратов оценивают: растворимость и гомогенность (для сухой вакцины при добавлении растворителя), безвредность и переносимость. Активность анатоксина определяют по его способности реагировать со специфической антитоксической сывороткой в реакции флокуляции.
Вирусные вакцины проверяют на отсутствие бактерий, грибов и посторонних вирусов. Контролируют культуры тканей и питательные среды, предназначенные для накопления вирусного материала. Сбор вируса испытывают на идентичность и определяют титр вируса.
Показатели качества вощинных препаратов
В связи с разнообразием характеристик препаратов методы их испытания могут различаться. Методы испытания включены в технические условия на каждый препарат, однако они должны соответствовать общим обязательным требованиям показателей качества.
Идентичность определяется с использованием референс-препара- тов методами спектрофотометрии, аминокислотного анализа, пептидного картирования, электрофореза и иммуноэлектрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии и др. При этом удается определить молекулярные изменения антигенов, которые могут возникать в процессе изготовления и хранения вакцин.
Стерильность определяется методом микроскопического исследования и посева на питательные среды. Для вирусных вакцин проводятся специальные исследования на присутствие микоплазм.
Стабильность устанавливается путем проверки свойств препарата через определенные промежутки времени и методом ускоренной термодеградации при выдерживании образцов при 37 °С в течение двух недель. Если вакцина представляет собой конъюгат антигена с носителем, проверяют возможность диссоциации и появления несвязанного антигена.
Токсичность (безвредность) определяют в опытах на животных. Необходим правильный выбор вида животного с учетом его чувствительности к испытуемому препарату. Оценку безвредности препарата производят на основании данных о гибели или выживании животных, клинических проявлений и бактериологических показателей. Токсичность может быть связана не только с иммуногеном, но и с наличием в вакцине стабилизаторов, адъювантов, консервантов и т. п., что требует дифференцированного подхода к исследованию.
Реактогенность (переносимость) каждой серии вакцины проводят на группе добровольцев под строгим медицинским наблюдением. О реактогенности судят по температурной реакции организма и воспалительный реакции на месте введения, а также по другим объективным или субъективным явлениям.
Специфическую активность (иммуногенность) проверяют путем иммунизации чувствительных животных с их последующим заражением летальной дозой возбудителя заболевания; процент выживших животных указывает на степень иммуногенности.
Пирогенность препарата оценивают на кроликах, которым внутривенно вводят одну человеческую дозу вакцины. Препарат считается апи- рогенным, если повышение температуры от исходного уровня составляет не более 0,6 °С, а сумма индивидуальных колебаний температуры у трех кроликов не превышает 1,4 °С. Кроме того, для определения пирогеннос- ти существует LAL-тест, основанный на коагуляции гемолимфы меченосца (Limulus Amoebocytes Lysate) в присутствии бактериальных липополиса- харидов.
Примеси. Идентификацию антигенных примесей в вакцине осуществляют методами иммуноблоттинга, иммуноферментного анализа или другими иммунологическими методами. При изготовлении инактивиро- ванных вакцин проверяют полноту инактивации и содержание инактиви- рующих веществ в продукте. При использовании в технологическом процессе культуры клеток осуществляют контроль биологических веществ, которые присутствуют в среде (трипсин, эмбриональная телячья сыворотка и др.).
Вспомогательные вещества, использующиеся при изготовлении вакцины (стабилизаторы, консерванты, адъюванты, вода и другие реагенты) должны соответствовать требованиям Фармакопеи и контролироваться соответствующим образом.
Государственная система надзора за качеством иммунобиопрепа- ратов основана на принципах гарантии качеств, которая достигается не только путем контроля конечной продукции, но прежде всего за счет создания условий производства, гарантирующих ее эффективность и безопасность. Государственный контроль проводится на этапе регистрации вакцин и в пострегистрационный период. На этапе регистрации проводятся доклинические, клинические испытания вакцин, контроль за соблюдением надлежащих условий освоения производства на предприятии. Пострегистрационный контроль предусматривает регулярное инспектирование предприятия, сертификацию производственных серий вакцин, контроль за побочным действием вакцин и наблюдения за их эффективностью.
Доклинические испытания включают определение следующих показателей качества вакцины: идентичность, специфическая активность, безопасность, токсичность, аллергенность, местные реакции, гематологические и гистологические изменения, стерильность, пирогенность, содержание белка, влажность, стабильность.
Клинические испытания новых вакцин на людях проходят не менее двух стадий: 1) на ограниченном контингенте добровольцев для определения реактогенности, безопасности и специфической активности и 2) на расширенном контингенте для оценки безопасности и эффективности. Все серии препаратов, программа испытаний и НТД контролируются ГИСК им. Л. А. Тарасевича. При испытании применяются препараты сравнения.
Инспектирование предприятий с целью сертификации производства вакцин проводится в плановом порядке не реже 1 раза в 2 года, в связи с сертификацией производства новых вакцин и внепланово в связи с ухудшением качества выпускаемых препаратов. В начале промышленного выпуска новой вакцины Национальный орган контроля проверяет 5 первых производственных серий вакцины и проводит сертификацию ее производства. Сертификат дает право на получение лицензии на право производства и реализацию препарата.
Все вакцины, применяемые на территории РФ, подлежат обязательной сертификации - проверке соответствия свойств отдельных серий вакцин установленным требованиям. Существует несколько видов контроля серий вакцин: выборочный и сплошной, предварительный и последующий, контроль по паспортам, по производственным протоколам и др. Серии поступают от предприятий в плановом порядке, изымаются со склада предприятий, с мест хранения и с мест применения при появлении поствакцинальных осложнений.
Сплошному предварительному контролю подлежат первые серии вакцин при освоении их производства и все серии вакцин при введении особого режима в связи с ухудшением качества препарата.
Одной из форм постлицензионного надзора является предварительный контроль вакцин до их отправки потребителю. Такой контроль может осуществляться путем экспертизы паспортов серии вакцин, протоколов производства и производственного контроля, а также путем лабораторного контроля серий вакцин. Предреализационному контролю подлежат прежде всего серии вакцин календаря прививок и тест-систем для диагностики СПИДа и вирусных гепатитов, с помощью которых контролируется сырье и готовые препараты, предназначенные для введения людям (донорская кровь, иммуноглобулины и др.). Плановый лабораторный контроль осуществляется по графикам, направляемым Национальным органом контроля предприятиям. Постлицензионный надзор позволяет оценить эффективность вакцин при широком применении и провести мониторинг побочного их действия с расследованием случаев поствакцинальных осложнений.
Система обеспечения качества вакцин на предприятиях объединяет все структурные подразделения, обеспечивающие надлежащие условия производства и внутренний контроль. Система управления качеством должна гарантировать соблюдение необходимых условий производства:
■ выполнение правил GMP и GLP;
■ применение сырья, реактивов и вспомогательных материалов установленного качества;
■ наличие метрологической службы, проведение валидации оборудования и технологического процесса;
" лабораторный контроль полуфабриката и готового продукта по установленным показателям; соблюдение условий транспортировки и хранения сырья, полуфабриката и готового продукта;
■ регулярная самоинспекция на всех этапах производственного процесса;
■ наличие системы выявления и устранения нарушений технологического процесса, рассмотрения рекламаций и отзыва продукции от потребителя.
Основное контролирующее подразделение предприятия - Отдел биологического и технического контроля (ОБТК). В его обязанности входит контроль сырья, реактивов, посуды и других материалов, необходимых для производства, лабораторный контроль готовой продукции, контроль соблюдения требований НТД в процессе производства, за соблюдением условий хранения и транспортировки и за своевременным направлением серий вакцин в ГИСК на сертификационный контроль.
На основании результатов испытаний на каждую серию препарата оформляется паспорт, который служит основанием для оформления накладной и сдачи препарата на склад готовой продукции. Готовая вакцина может быть выпущена только после окончания контроля серии препарата в ОБТК и присвоении серии контрольного номера. Если препарат находится на предварительном контроле, ОБТК имеет право выдать контрольный номер только после положительного заключения ГИСК. В случае отрицательного заключения препарат бракуется.
Несмотря на то, что некоторые вакцины могут сохранять свою активность свыше установленного срока годности, указанного в НД и на этикетках, продление срока годности на основании переконтроля серии запрещено.
Кроме ОБТК на предприятии создаются подразделения, ответственные за гарантию качества производства, которые следят за соблюдением технических и санитарно-эпидемиологических требований, проводят ва- лидацию технологических процессов и оборудования и несут ответственность за состояние окружающей среды.
13.4.2. Стандарты качества препаратов крови
Правила производства медицинских продуктов из крови или плазмы человека изложены в приложении 814 к GMP Европейского Союза. Ряд документов ЕС предусматривает меры по предотвращению передачи инфекционных заболеваний и обеспечению качества препаратов из донорской крови.
Обеспечение качества распространяется на все аспекты производства от заготовки исходного материала до получения готового продукта: отбор доноров, контроль контейнеров для крови и плазмы, контроль антикоагулянтов и реактивов для анализов, процесс переработки, условия хранения и транспортировки.
Кровь или плазма должны быть заготовлены в специальных учреждениях и обследованы в лицензированных лабораториях.
Необходимо наличие системы мониторинга, позволяющей прослеживать путь изготовления медицинского препарата таким образом, чтобы выявлять любые отклонения от спецификации качества, а также системы, позволяющей прослеживать путь каждой единицы крови (плазмы) на этапах ее прохождения, начиная от донора и до потребителя.
Кровь, плазма и продукты их переработки должны быть тестированы с использованием валидированных методов к следующим маркерам возбудителей трансмиссивных инфекций:
■ антиген вируса гепатита В;
■ антитела к ВИЧ1 и ВИЧ2;
■ антитела к вирусу гепатита С.
Плазма, объединенная в пул, тестируется по этим же показателям, кроме того, она подвергается анализу на присутствие РНК вируса гепатита С методом ПЦР (полимеразная цепкая реакция).
С целью уменьшения риска микробиологического загрязнения препаратов крови все операции осуществляются в чистых помещениях в соответствии с требованиями GMP.
Качество плазмы должно соответствовать требованиям действующего издания Европейской Фармакопеи и национальных Фармакопей взаимодействующих стран.
ЧАСТЬ III. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА
Глава 14. ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
И ЕЕ СВЯЗЬ С ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ
ПРОМЫШЛЕННОСТЬЮ
В середине XX века медицинские журналы многих стран описывали многочисленные случаи так называемой «лекарственной» инфекции, т. е. заражение больных при приеме препаратов, содержащих патогенные микроорганизмы. В этой связи были предприняты крупномасштабные исследования микробной обсемененности лекарственных средств, источников и путей проникновения микроорганизмов в фармацевтическое производство, были разработаны методы доброкачественного производства, предупреждающие микробную контаминацию лекарственных средств, и созданы системы микробиологического контроля на всех этапах производственного процесса.
По данным ВОЗ в нестерильных лекарственных средствах (таблетках, капсулах, мазях, растворах, настойках и др.) наиболее часто выявлялись следующие микроорганизмы: Escherichia coli, Salmonella, Entero- bacter, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Micrococcus, Bacillus subtilis, B.cereus, плесневые и дрожжевые грибы. В ряде случаев микробную контаминацию обнаруживали и у препаратов, в состав которых входили антибиотики и консерванты.
Основными источниками попадания микроорганизмов в сферу производства и конечный продукт являются: сырье и вспомогательные материалы, вода, воздух, персонал, занятый в производстве, технологическое оборудование. Знание экологии микроорганизмов позволяет оценить вероятность их попадания в фармацевтическую продукцию и в ряде случаев определить возможный источник контаминации, что необходимо для организации производства микробиологически безопасных лекарственных средств.
14.1. Нормальная микробиота человека
В условиях физиологической нормы организм человека содержит сотни видов микроорганизмов, среди которых доминируют бактерии, тогда как вирусы и простейшие представлены значительно меньшим числом видов. Подавляющая часть таких микроорганизмов является сапротро- фами-комменсалами и не наносит хозяину видимого вреда. Так же как и в окружающей среде, в организме человека микробы существуют в виде биоценозов. Суммарно в биоценозе человека обитает 1014-1015 клеток микроорганизмов, представленных более чем 500 видами, причем некоторые из них остаются до сих пор неизученными. Каждому индивидууму свойственны определенные микробные сообщества, сформировавшиеся в процессе его жизнедеятельности.
Термин «нормальная микробиота» объединяет виды, часто выделяемые из организма здорового человека. Информация о качественном и количественном составе микробиоты здорового человека является очень важной для фармацевтов и биотехнологов, так как человек - постоянный участник производственных процессов и источник возможного поступления туда микроорганизмов. На состав микробиоты разных биотопов (topos - место) влияет состояние гормональной, иммунной, нервной и других систем макроорганизма. Значительную роль в изменении состава микробных ассоциаций играют особенности питания, нерациональная лекарственная терапия, наличие соматических (неинфекционных) заболеваний и условия труда.
Органы и ткани, не соприкасающиеся с внешней средой, свободны от микроорганизмов. В норме стерильными являются сердце, кровь, лимфа, мозг, спинномозговая и синовиальная жидкости, мочевой пузырь, матка, а также глубокие ткани. Основные отделы организма, заселяемые бактериями, включают кожные покровы, верхние дыхательные пути, желу- дочно-кишечный тракт и мочеполовую систему.
Различают постоянную и транзиторную микробиоту.
Постоянная (резидентная или автохтонная) представлена микроорганизмами, постоянно присутствующими в организме. Транзиторная (аллохтонная) микробиота неспособна к длительному существованию в организме.
Постоянную мокробиоту можно подразделить на облигатную и факультативную. Облигатная микробиота (бифидобактерии, лактобакгерии, пептострептококки, кишечные палочки и др.) является основой микробиоценоза (сообщества микроорганизмов), а факультативная (стафилококки, стрептококки, клебсиеллы, клостридии, некоторые грибы) включает его малую часть.
В составе постоянной микробиоты преобладают облигатные анаэробы. Микроорганизмы, составляющие нормальную микробиоту, в основном существуют в форме биопленки, устойчивой к различным воздействиям.
Микробиота кожных покровов. Случайная микробиота может быть многочисленной и разнообразной и включает условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, попадающие из других биотопов собственного тела или из окружающей среды, которые быстро погибают за счет бактерицидных свойств колеи, сальных секретов и антагонистических взаимоотношений с нормальной микробиотой.
Постоянными представителями являются Staphylococcus epidermidis, S. saprophyticus, микрококки, пептострептококки, дифтероиды. Место постоянного обитания - роговой слой кожи, протоки сальных желез, волосяные мешочки. Микробиота волосяного покрова имеет идентичный состав. Обычно на 1 см2 выявляют 103—104 микроорганизмов, но на участках с повышенной влажностью это число может достигать 106. У некоторых людей на коже обнаруживают стрептококки, грамположительные спорообразующие палочки.
Наибольшее число микроорганизмов обитает в складках кожи, здесь встречаются грибы рода Candida. В зонах скопления сальных желез (наружное ухо, гениталии) обнаруживают непатогенные кислотоустойчивые микобактерии, коринебактерии, липофильные дрожжи.
На коже волосистой части головы (на скальпе) часто присутствуют Pityrosporum ovalae (на безволосой - P.orbicularae), из дерматофитов обнаруживают виды родов Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton. В числе постоянных обитателей кожи у 5-10% здоровых людей встречается S. aureus.
Микробиота полости рта. В этом биотопе микробиота особенно разнообразна, чему способствуют наличие влаги и питательных веществ, слабощелочные значения рН. Многие условно-патогенные микроорганизмы из состава нормальной микробиоты играют существенную роль в возникновении кариеса, заболеваний парадонта и слизистой оболочки рта. Наличие в полости рта слюны с ее бактерицидными компонентами, лизо- цимом, иммуноглобулинами, некоторыми литическими ферментами ограничивают возможности оральных микробов как возбудителей заболеваний. Среди микроорганизмов полости рта встречаются аутохтонные и аллохтонные виды - иммигранты из других биотопов (носоглотки, кишечника). Среди бактерий доминируют стрептококки - 30-60% от общего количества микроорганизмов. Чаще всего это маловирулентные стрептококки, обладающие определенным тропизмом: Str. mitior - к эпителию щек, Str. salivarius - к сосочкам языка, Str. mutans, Str. sanguis - к поверхности зубов. Они ферментируют углеводы и образуют перекиси. Сдвиг рН в кислую сторону приводит к декальцинированию зубной эмали. Важной является способность синтезировать полисахариды из сахарозы. Глю- козная часть молекулы превращается в декстран (а-1,4 - глюкан), а фруктоза - в фруктан (леван). Нерастворимый декстран способствует образованию зубных «бляшек», с помощью которых происходит прикрепление микробных клеток к ткани зуба. Фруктан может служить субстратом в дальнейших процессах кислотообразования даже при отсутствии поступления углеводов извне.
Среди других грамположительных кокков встречаются пептококки, чаще всего в ассоциациях с фузобактериями и спирохетами при кариесе, пульпите, пародонтите.
Грамотрицательные анаэробные кокки представлены родом Veilo- nella, они не утилизируют дисахариды, но разлагают пируват, лактат, ацетат до углекислого газа и воды, способствуя повышению рН и сдерживая рост возбудителей кариеса, образующих молочную кислоту. Наибольшее количество молочной кислоты образуют грамположительные палочки рода Lactobacillus. Грамотрицательные микроорганизмы представлены в полости рта родами Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia, Они ферментируют сахара до СО,, а пептоны - с образованием продуктов, имеющих плохой запах.
Бактероиды обладают ферментами коллагеназой и гиалуронидазой, разрушающими ткани, и участвуют в развитии заболеваний пародонта. Фузобактерии - палочки веретенообразной формы обитают в десневых карманах в ассоциации со спирохетами.
Лептотрихии имеют вид попарно расположенных «зернистых» палочек, часто нитевидной формы.
Строму «зубного камня» составляют актиномицеты, они входят в состав зубного налета, принимают участие в образовании зубных бляшек и развитии кариеса.
Коринебактерии способны понижать окислительно-восстановительный потенциал, что способствует росту анаэробов.
Микроорганизмы полости рта способны проникать в кровь, например, после экстракции зуба или даже при чистке зубов.
Спирохеты полости рта представлены родами Treponema (T.denticola, T.orale), Borrelia (B.buccalis); Leptospira; простейшие-родами Entamoeba (E.buccalis, E.dentalis) и Trichomonas (T.buccalis); из микоплазм часто встречаются Mycoplasma orale, M. salivarium.
Микробиота верхних дыхательных путей (ВДП), Верхние отделы ДП несут особенно высокую микробную нагрузку, так как они анатомически приспособлены для осаждения бактерий из вдыхаемого воздуха.
В полости носа обнаруживают негемолитические и зеленящие стрептококки, непатогенные грамотрицательные кокки - нейссерии, стафилококки, коринебактерии. У некоторых людей постоянно встречается золотистый стафилококк, т. е. наблюдается резидентное носительство.
В гортани находят негемолитические и а-гемолитические стрептококки, у 100 % людей обнаруживается негемолитический вариант Str. pyogenes, негемолитические стафилококки, дифтероиды. В тканях миндалин - микоплазмы и аденовирусы.
Мелкие бронхи, альвеолы, паренхима легких свободны от микроорганизмов.
Микробиота желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Микробиота ЖКТ различается по качественному и количественному составу в зависимости от его отдела. В желудке здорового человека за счет низких значений рН содержится 103—10" кл/мл содержимого, в основном кислотоустойчивые микроорганизмы: лактобациллы, Helicobacter pylori, дрожжи, при патологии в результате повышения рН их количество возрастает.
В верхних отделах тонкой кишки обнаруживается 104-105 кл/мл, по качественному составу это молочнокислые микроорганизмы, отличающиеся по адгезивности от тех, что находятся в полости рта и желудка, а также бифидобактерии и фекальные энтерококки. Площадь слизистой оболочки тонкого кишечника составляет 180-200 м2. Через нее в кровь постоянно всасываются разнообразные вещества, в том числе микробного происхождения, возможно попадание и самих микробных клеток даже у здорового человека, не говоря о патологических состояниях.
Микробиота толстого кишечника наиболее многочисленна и разнообразна. Количество микробов достигает 109—1011 кл/мл (иногда 1012 кл/мл) принадлежащих к 260 видам. Численно превалируют анаэробы: бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, вейлонеллы, пептокок- ки, клостридии. Факультативно-анаэробные микроорганизмы представлены бактериями группы кишечной палочки (БГКП), фекальными энтерококками.
Группа кишечной палочки объединяет бактерии 4 родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella. Объединение этих микроорганизмов в группу кишечной палочки произведено на основании общих признаков: это грамотрицательные, неспорообразу- ющие, оксидазоотрицательные палочки, ферментирующие глюкозу и лактозу до кислоты и газа при 37°С за 24 часа. БГКП (преимущественно Escherichia coli) занимают по численности второе место после бифидо- бактерий, на третьем месте по численности энтерококки: Enterococcus faecalis и E.faecium. Значительно меньше клостридий: Clostridium perfrin- gens и C.sporogenes.
В кишечнике живут также кишечные амебы (Entamoeba coli), кишечные вирусы, у некоторых людей - дрожжеподобные грибы рода Candida.
Микробиота мочеполовой системы. Состав микробиоты этих биотопов различается в зависимости от пола, возраста и органа. Почки, мочеточники, моча в мочевом пузыре не содержат микроорганизмов. В нижней части уретры встречаются неспорообразующие анаэробы: пептокок- ки, пептострептококки, бактероиды, микобактерии и грамотрицательные бактерии кишечного происхождения. Микробиота влагалища формируется с наступлением половой зрелости. Это молочнокислые бактерии (палочки Додерлайна), коринебактерии, негемолитические стрептококки, дрожжеподобные грибы и простейшие, для которых благоприятна кислая среда этого органа (рН 4,0-4,2).
Значение нормальной микробиоты
Нормальная микробиота является одним из факторов неспецифической резистентности организма и необходима для его нормального функционирования. Большинство микроорганизмов, живущих в разных биотопах, обладает антагонистическими свойствами по отношению к другим, в частности, патогенным бактериям и вирусам. Например, бифидо- бактерии и лактобациллы выделяют кислоты (молочную, уксусную), спирты, лизоцим, бактериоцины, могут активно тормозить развитие гнилостных бактерий в кишечнике, ингибируют выделение энтеропатогенными эшерихиями термолабильного токсина. Важным фактором является избирательное связывание представителями нормальной микробиоты поверхностных рецепторов эпителиальных клеток, что предотвращает колонизацию слизистых оболочек посторонними микроорганизмами, т. е. обеспечивает колонизационную резистентность организма. Нормальная микробиота кишечника способствует пищеварению: расщепляет трудноперевариваемые сложные органические вещества, оказывает влияние на морфологию слизистой и ее адсорбционную способность. С деятельностью микроорганизмов связаны обмен липидов, разложение желчных кислот, разложение белков до конечных продуктов, процессы всасывания веществ, перистальтика и многое другое. Микроорганизмы принимают участие в детоксикации попадающих из внешней среды ксенобиотиков и образующихся токсических продуктов. Масляная кислота, образующаяся при анаэробном сбраживании клетчатки кишечными микроорганизмами, способствует образованию особого фермента, инактивирую- щего ген, ответственный за злокачественное перерождение клетки.
Нормальная микробиота способствует усилению всасывания из кишечника ионов Fe+2, Са+2, витамина D, участвует в образовании витаминов К, группы В, особенно Вр В,, фолиевой, никотиновой, пан- тотеновой кислот. Высокое содержание бифидобактерий и лактобацилл препятствует развитию многих патологических процессов и даже канцерогенеза.
Нормальная микробиота способствует созреванию и поддержанию иммунной системы. У стерильных животных (гнотобионтов) масса лимфатических узлов снижена в несколько раз по сравнению с нормальными животными. Гнотобионты не могут жить в обычных условиях, где есть микробное окружение и погибают от бактерий и вирусов, к которым животные, выросшие в нормальных условиях, не чувствительны. Даже в условиях стерильного существования гнотобионты быстро погибают от дисфункции кишечника, связанной с нарушением процессов переваривания, всасывания и детоксикации веществ из-за отсутствия нормальной микробиоты.
При нормальной колонизации слизистых оболочек бактерии, являясь антигенами, индуцируют образование антител (IgA), составляют основу местного иммунитета и не позволяют возбудителям проникнуть в ткани, а также способствуют поддержанию гомеостаза самих слизистых оболочек.
Тепло, которое выделяется в процессе метаболизма микробов - обитателей кишечника, способствует поддержанию постоянной температуры тела теплокровных животных.
Продукты нормальной микробиоты постоянно попадают в кровь, оказывая влияние на метаболизм макроорганизма. Нарушение симбиоза микро- и макроорганизма приводит к тяжелым последствиям', нарушению обменных процессов, аллергическим, кожным, онкологическим заболеваниям и даже к психическим расстройствам.
Нормальная микробиота способна вызывать развитие инфекционных заболеваний, большая часть которых носит оппортунистический (сопровождающий) характер. Например, кишечные анаэробы (бактероиды) при проникновении в стенку кишечника в результате травмы вызывают формирование абсцессов, а основными возбудителями постгриппозных пневмоний считают микроорганизмы, обитающие в носоглотке любого человека. Ведущую роль в развитии подобных поражений играет не вирулентность самого возбудителя, а ослабление защитных систем макроорганизма (иммунодефицит). Нормальная микробиота является источником генов, в частности, генов устойчивости к лекарственным препаратам.
Дисбактериоз (дисбиоз)
Дисбакгериоз проявляется в нарушении качественного и количественного состава микробиоты и перемещении ее в другие биотопы. Развитию дисбактериозов способствует длительное применение антибиотиков и антисептиков, угнетающих развитие одних видов микробов и не влияющих на другие. Антимикробная терапия сопровождается дисбактериозом в 90 % случаев. Важным фактором является снижение местного и общего иммунитета в результате гормонотерапии, применения иммунодепрессантов, лучевой терапии, инфекционных и аллергических заболеваний, воспалительных процессов. Одной из важных причин развития дисбактериоза является стресс. Группу риска составляют люди, находящиеся в состоянии постоянного напряжения: летчики, моряки, бизнесмены, спортсмены, врачи, журналисты, атакже жители экологически неблагоприятных территорий и пожилые люди. Общее ухудшение экологической обстановки, низкое качество воды, неполноценное и несбалансированное питание также могут стать причиной дисбактериоза. Наиболее часто встречается дисбактериоз кишечника, который проявляется в нарушении его работы, сопровождается общим недомоганием, болями в области живота и повышенным газообразованием. Длительное нарушение соотношения микроорганизмов в кишечнике может провоцировать развитие аллергических заболеваний, таких как бронхиальная астма, хронический бронхит, ревматоидный артрит и др.
Дисбактериоз кишечника выявляют микробиологическим методом. По результатам посевов кишечной микробиоты определяют:
1) содержание общего количества кишечных палочек, типичных по ферментативной активности;
2) наличие гемолитических штаммов Е. coli;
3) наличие прочих условно-патогенных микроорганизмов;
4) наличие бактерий рода Proteus;
5) наличие грибов рода Candida;
6) количественное содержание бифидобактерии, лактобактерий, бактероидов.
Для коррекции дисбактериозов используют препараты эубиоти- ков (пробиотиков), которые содержат живые лиофильно высушенные клетки бактерий (табл. 22), и пребиотиков, которые представляют собой диетические ингредиенты, избирательно стимулирующие развитие нормальной микробиоты кишечника. К пребиотикам относятся некоторые углеводы, пептиды сои и молока, антиоксиданты, витамины, аминокислоты и др.
Таблица 22
Эубиотики (пробиотики), применяющиеся для лечения и профилактики дисбактериозов
|
14.2. Микробиота окружающей среды.
Санитарно-показательные микроорганизмы
В биосфере Земли повсеместно присутствуют микроорганизмы, жизнедеятельность которых вносит важнейший вклад в круговорот углерода, азота, серы, фосфора и других элементов, а также поддерживает динамическое равновесие в биосфере. Естественными средами обитания микроорганизмов являются вода, почва, организмы растений, животных и человека. Микробиоту окружающей среды, включая свободноживущие и паразитические микроорганизмы, а также влияние микробиоты на экологическую ситуацию и здоровье человека изучает санитарная микробиология. Главной задачей санитарной микробиологии является раннее обнаружение патогенной микробиоты в окружающей среде. Основными источниками распространения возбудителей инфекционных заболеваний являются человек и теплокровные животные. Наибольшее их количество поступает в окружающую среду воздушно-капельным и фекальным путями.
Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, несмотря на разработанные методы их ускоренного и прямого количественного определения, имеет ряд трудностей:
■ патогенные микроорганизмы находятся в окружающей среде не постоянно, легко их можно обнаружить в период эпидемий и трудно - в межэпидемические периоды;
■ количество патогенных микроорганизмов, поступающих в окружающую среду, значительно меньше, чем представителей нормальной микробиоты, распространены патогенные микробы в объектах неравномерно;
* при посеве на питательные среды патогенные микробы страдают от конкуренции с сапротрофами, являясь плохо приспособленными к жизни в окружающей среде, патогенные микроорганизмы требуют применения «богатых» и поэтому дорогостоящих питательных сред.
Отрицательный результат обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды еще не говорит с достоверностью об их отсутствии. В санитарной микробиологии оценку состояния различных объектов проводят непрямым путем, устанавливая факт их загрязнения выделениями человека и животных и чем обильнее это загрязнение, тем более вероятно попадание в объект патогенных микробов.
Состав нормальной микробиоты разных биотопов организма человека довольно постоянен и мало меняется при инфекционных заболеваниях. Для многих видов полость рта, кишечник, ВДП являются единственной средой обитания. Обнаружение таких микроорганизмов в ка- ком-либо объекте свидетельствует о его загрязнении соответствующими выделениями. Например, обнаруживая нормальных обитателей кишечника, можно сделать заключение о наличии фекального загрязнения и возможной опасности присутствия брюшнотифозных, дизентерийных палочек. возбудителей других кишечных инфекций.
Выделяемые в таких случаях микробы служат показателями санитарного неблагополучия, потенциальной опасности исследуемых объектов и поэтому названы санитарно-показательными (СПМ). Однако не все микроорганизмы, входящие в состав нормальной микробиоты тела человека, могут быть признаны СПМ.
Основные требования, предъявляемые к с а н и т а р н о - показательным микроорганизмам.
1. Такие микроорганизмы должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в окружающую среду в больших количествах.
2. Они не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных.
3. После выделения в окружающую среду они должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, поступающих в окружающую среду тем же путем.
4. Они не должны размножаться в окружающей среде.
5. У микробов не должно быть во внешней среде «двойников» или аналогов, с которыми их можно спутать.
6. Они не должны изменять свои биологические свойства во внешней среде.
7. Они должны быть достаточно типичными, чтобы их диагностика осуществлялась без особого труда.
8. Методы идентификации должны быть простыми, доступными и экономичными.
Принципы и методы проведения с а и и г а р н о-м и к р о- биологических исследований.
При проведении санитарно-микробиологических исследований необходимо выполнять следующие требования.
1. Правильный отбор проб.
Его проводят с соблюдением всех необходимых правил асептики; при хранении и транспортировке необходимо исключить возможность гибели и дополнительного размножения микроорганизмов. При невозможности немедленно сделать анализ материал хранят не более 6-8 часов.
2. Серийность проводимых анализов.
Микроорганизмы в объектах окружающей среды распределены крайне неравномерно. Для получения адекватных результатов проводят отбор серии проб из разных участков объекта. При проведении анализов все образцы смешивают и отбирают среднюю пробу.
3. Повторностъ отбора проб.
Для получения сопоставимых результатов осуществляют повторный отбор проб в связи с тем, что в исследуемых образцах состав микробиоты меняется достаточно быстро.
4. Применение стандартных методов исследования.
Использование методик, утвержденных ГОСТ, позволяет получать
в разных лабораториях сопоставимые результаты.
5. Использование комплекса тестов необходимо для получения адекватной информации при сочетании прямых и косвенных методов выявления микроорганизмов с учетом влияния факторов внешней среды и собственной микробиоты объекта.
Современная санитарная микробиология стремится использовать простые, точные и надежные методы. Они направлены на определение общей микробной загрязненности и выявления СПМ и включают:
■ прямой подсчет при микроскопии микроорганизмов в объекте;
■ методы выделения и идентификации микроорганизмов;
■ биологические методы с использованием лабораторных животных.
Прямой подсчет применяют в экстренных случаях при необходимости срочного ответа о количественном содержании бактерий (например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и др.). Основной недостаток - невозможность получить точный ответ из-за образования бактериями агломератов или прикрепления к частицам среды. Метод не позволяет отличать живые бактерии от погибших.
Посев на питательные среды производят для количественного подсчета. На плотных питательных средах производят подсчет числа выросших колоний. При этом исходят из предположения, что каждая колония является результатом попадания на среду одной жизнеспособной клетки. Данный метод неточен, так как выявляет только группы микроорганизмов, растущих на определенных питательных средах при определенной температуре. Невозможно создать унифицированную, подходящую для всех микроорганизмов среду. Не все микроорганизмы, находящиеся в объекте, дают колонии на питательной среде из-за конкуренции и антагонизма.
Содержание числа живых клеток в объекте отражает показатель колониеобразующих единиц (КОЕ) — количество клеток, способных образовать колонию при рассеве на питательной среде. Методы, принятые в санитарной микробиологии, позволяют выявить в основном мезофиль- ные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы (МАФАМ). Этот показатель также принят для оценки микробной контаминации объекта.
Характеристика основных групп СПМ
СПМ условно разделяют на 3 группы.
Первая группа включает обитателей кишечника человека, их расценивают как индикаторы фекального загрязнения. В нее входят бактерии группы кишечной палочки (колиформные бактерии), энтерококки, сульфитвосста- навливающие клостридии (включая Clostridium perfringens), коли-фаги.
Вторая группа включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки, которые являются индикаторами воздушно-капельного загрязнения среды. В нее традиционно включали стрептококки и стафилококки, однако в настоящее время СПМ воздушной среды принято считать только стафилококки.
Третья группа включает сапротрофные микроорганизмы, обитающие во внешней среде. Это индикаторы процессов самоочищения. В нее входят бактерии-аммонификаторы и нитрификаторы, некоторые споро- образующие бактерии, актиномицеты, цианобактерии и грибы.
Бактерии группы кишечной палочки (БГКП, кол и форм н ые б а к тер и и)
Преимущество этих бактерий как СПМ связано с тем, что они являются постоянными обитателями кишечника и постоянно выделяются с фекалиями в окружающую среду в больших количествах, их число намного выше, чем других представителей кишечных микроорганизмов.
В настоящее время в соответствии с нормативно-технической документацией к этой группе относят грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие глюкозу, лактозу и маннит, не обладающие оксидазной активностью. Колиформные бактерии подразделяют на две подгруппы:
a) общие колиформные бактерии, расщепляющие глюкозу и лактозу до кислоты и газа при 37 °С в течение 24 ч;
b) термотолерантные колиформные бактерии, расщепляющие глюкозу и лактозу до кислоты и газа при температуре 43-ь44,5 °С. Энтерококки
К роду Enterococcus относят грамположительные, неспорообразую- щие овальные бактерии, которые в мазках из культур, выращенных на жидких средах, располагаются парами или короткими цепочками. До 1984 г. эти микроорганизмы относили к роду Streptococcus, что до сих пор находит отражение в некоторых НТД и других литературных источниках.
Все виды и варианты энтерококков имеют санитарно-показатель- ное значение и отвечают ряду требований, предъявляемых к СПМ:
• это постоянные обитатели кишечника несмотря на то, что их количество меньше, чем БГКП;
• во внешней среде они могут размножаться только при высоком содержании органических веществ и температуре не ниже 20 °С;
• не обладают выраженной изменчивостью во внешней среде, что облегчает их распознавание;
• не имеют аналогов во внешней среде;
• отмирают во внешней среде значительно раньше, чем БГКП, поэтому их присутствие свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.
Главным достоинством является их устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем качества режима пастеризации. Энтерококки устойчивы к высоким концентрациям NaCl (6,5-17%), что позволяет использовать их при анализе морской воды. Энтерококки устойчивы в диапазоне рН 3-12, что можно использовать при анализе стоков кислого и щелочного характера. Эти особенности позволяют дифференцировать роды Enterococcus и Streptococcus (табл. 23).
Таблица 23
Дифференцирующие признаки энтерококков (тесты Шермена)
|
В настоящее время количественная энтерококкометрия принята международным стандартом по воде как дополнительный показатель фекального загрязнения, а при выявлении атипичных E.coli - главным методом выявления фекального загрязнения.
Трудности в индикации энтерококков состоят в необходимости использовать среды сложного состава и в том, что для их выявления требуется больше времени, чем для БГКП.
– Конец работы –
Эта тема принадлежит разделу:
основы... ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ... В А Галынкин Я А Заикииа В И Кочеровец Т С Потехина Н Д Бунатян...
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Контроль качества иммунобиопрепаратов
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов