Лекция 7. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Лекция 7. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Электрофоретические эксперименты
Другое направление объединяло различные электрофоретические методы в поддерживающей среде из различных носителей. Двумерный электрофорез в… Появился также новый метод для разделения макромолекул, капиллярная… В этой Лекции мы сначала обсудим метод свободного электрофореза в растворе. Недавние инновации в этом методе вселяют…Макромолекулы в электрическом поле
Заряд молекулы и ее электрофоретическая подвижность Заряд – фундаментальное свойство молекул, которое тесно связано с их… F = Q E (26.1)Электрофоретические методы в отсутствие поддерживающей среды: свободный электрофорез
Различные методы электрофореза пока широко не используются в качестве зонда структуры. Причина проста: сложные взаимодействия между ионами,…Электрофоретические методы в присутствии поддерживающей среды: зональный электрофорез
Агарозные гели Агароза – линейный природный полисахарид, выделенный из содержащих агар…Разделение по массе и заряду: двумерный гель-электрофорез
Двумерный электрофорезобъединяет два метода: изоэлектрофокусировку IEF с SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле. Этот объединенный метод называется кратко двумерным электрофорезом (2DE – от англ. Two-dimensional Electrophoresis) и в настоящее время является наиболее используемым аналитическим методом для разделения белков.
На первом этапе этого метода полипептидные цепи разделяют методом изоэлектрического фокусирования IEF. При таком изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в узкой трубочке, заполненной полиакриламидным гелем, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней. Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза.
На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии SDS и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном SDS-PAGE. Так осуществляется разделение во втором направлении двумерного гель-электрофореза (рис. 26.13).
Рис. 26.13. Общий принцип двумерного электрофореза. Объяснение в тексте.
Неразделенными в результате остаются только те белки, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко. Используя различные методы окрашивания белков, можно выявить следовые количества практически всех полипептидных цепей. За один раз методом двумерного гель-электрофореза можно разделить до 2000 отдельных полипептидных цепей; этого достаточно, чтобы выявить большинство бактериальных белков. Разрешение этого метода настолько велико, что позволяет разделить два практически идентичных белка, отличающихся одной заряженной аминокислотой.
Уже первые эксперименты по разделению белков показали колоссальные возможности метода. Так, 1100 белков из E. coli были разделены в одном опыте. Было предсказано, что до 5000 белков могут быть разделены методом двумерного электрофореза. Несмотря на эти выдающиеся возможности и широкое применение для решения различных задач, почти 20 лет прошло, пока метод двумерного электрофореза стал составной частью протеомики.
Способность метода разделять одновременно большое число белков, затем идентифицировать индивидуальные белки как химическим анализом их концевых аминокислотных последовательностей, так и с помощью поиска этих последовательностей в компьютерных базах данных, привела к быстрому пополнению наших знаний о белковых компонентах клетки. Более того, сейчас с помощью этого метода можно следить за экспрессией практически всех белков в клетке и сравнивать информацию, идущую от «нормальных» и «аномальных» клеток. На рисунке 26.14 представлена типичная картина двумерного гель-электрофореза на примере разделения белков из 30S рибосомных частиц.
(а) 
(б) 
Рис. 26.14. Электрофоретическое разделение белков 30S рибосомной частицы из E. coli (левая панель) из T. thermophilus (правая панель. Электрофорез в первом направлении выполняется при кислом значении рH (5.5). Во втором направлении используется 15% SDS-PAGE. Сравнение результатов электрофоретического разделения белков 30S субчастицы из E. coli и T. thermophilus в этой системе показало, что пятно в положении, обозначенном (►) в правой половине рисунка, соответствуют пятну белка S1 из E. coli в левой половине рисунка