Электрофоретические методы в присутствии поддерживающей среды: зональный электрофорез

Первая работа Тизелиуса по электрофорезу была выполнена в свободном растворе. Однако вскоре выяснилось, что при использовании этого метода возникает много проблем, которые могут быть устранены только при стабилизации среды. Роль такого стабилизатора выполняла пористая механическая подложка, смоченная буфером для электрофореза. Подложка снижала конвекционые потоки и диффузию, так что разделенные компоненты предстали в виде четких зон. Ранее используемыми подложками были фильтровальная бумага и ацетатцеллюлоза. В течение многих лет они успешно использовались для разделения малых молекул, таких как индивидуальные аминокислоты, пептиды и карбогидраты. Однако введение в качестве подложек различных гелей, таких как агароза или полиакриламид, привело к существенному усовершенствованию электрофореза как метода для анализа макромолекул. Напомним некоторые свойства подложек.

Агарозные гели

Агароза – линейный природный полисахарид, выделенный из содержащих агар морских водорослей. Физические и химические свойства агарозы, такие как температура застывания, пористость, твердость могут варьироваться. Агарозный гель (agarose gel) формируется помещением сухой агарозы в буфер с последующим нагреванием. После охлаждения до комнатной температуры на плоской поверхности образуется прозрачный студенистый гель. Агарозный гель используется для электрофореза белков и нуклеиновых кислот (рис. 26.6).

Рис 26.6. Химическая структура агарозы

Полиакриламидные гели

Сетчатый полиакриламидный гель (polyacrylamide gel) получают путем полимеризации акриламидных мономеров в присутствиии небольшого количества сополимера (бисакриламида). Бисакриламиды являются бифункциональными агентами, которые ковалентно сшивают соседние линейные акриламидные цепи. Мономеры полимеризуются по принципу «голова-хвост» в длинные цепи и бисакриламидные молекулы (сшивка) встраиваются изредка в растущую цепь, в результате чего образуется место для разветвления цепи. Основной характеристикой полиакриламидного геля является размер пор, которые образуются при его полимеризации. Этот показатель определяет способность биомакромолекул продвигаться внутри геля в процессе проведения электрофореза. Полимеризации геля приводит к формированию полимера с хаотически свернутой структурой, который содержит разветвленную сеть пор. Структура такого рода позволяет просеивать макромолекулы с различными размерам (рис. 26.7).

Рис. 26.7 Элементарное звено макромолекулы полиакриламида

Соотношение между сшивающим агентом и акриламидом является очень важным показателем, так как оно существенно влияет на свойства геля: чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация бисакриламида, и наоборот; одновременное увеличение содержания обоих компонентов приводит к образованию гелей с повышенной жесткостью и хрупкостью, а одновременное снижение – к возрастанию мягкости и эластичности.

Разделение по массе: SDS-электрофорез

В методе, называемом SDS-электрофорезом (SDS-poliacrylamide gel electrophoresis или SDS-PAGE), изучаемые белки перед нанесением на гель прогреваются в буфере с низкой ионной силой, содержащем в разбавленном растворе до 2% додецил сульфата натрия (SDS: CH₃-(CH₂)₁₀-CH₂OSO₃^-Na⁺). Эта процедура разрушает нативную структуру белка с распадом элементов вторичной, третичной и четвертичной структуры. Добавление специального агента, β-меркаптоэтанола, приводит к разрыву дисульфидных связей. Такая обработка разворачивает белковые молекулы и образует структуры в форме палочек с включением отрицательно заряженных молекул SDS в полипептидную цепь (рис. 26.8).

Рис. 26.8. Схематическое представление белка в растворе SDS. Белок денатурирует и покрывается «шубой» из молекул SDS, приобретая одинаковый заряд на единицу длины. Собственный заряд белковой молекулы нейтрализуется. Добавление β-меркаптоэтанола разрушает все дисульфидные связи

 

В среднем, одна молекула SDS связывается с двумя аминокислотными остатками. Природный заряд нативной молекулы белка, следовательно, подавляется отрицательно заряженной молекулой SDS. Поэтому в присутствии SDS все белки имеют сходную структуру, отрицательный заряд и отличаются только по молекулярной массе. Развернутые додецилсульфатом натрия пептиды движутся через гель по определенной схеме: молекулы с наименьшей молекулярной массой мигрируют быстрее, чем большие молекулы.

Некоторые белки могут связывать больше или меньше количество SDS, по сравнению со средним количеством, что делает их пробег в геле аномальным. Если белок сам по себе имеет очень большой положительный или отрицательный заряд, то он будет искажать заряд, приобретаемый пептидом при связывании с SDS. Специфическим примером является гистоный белок H1, который имеет молекулярную массу около 21 кДa, но ведет себя в электрофоретическом эксперименте в SDS как молекула с молекулярным весом в 30 кДa, поскольку обладает собственным сильным положительным зарядом.

В большинстве случаев, единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Подвижность SDS-белковых комплексов обратно пропорционально логарифму молекулярной массы: низкомолекулярные комплексы движутся быстрее, чем высокомолекулярные. Это означает, что молекулярная масса белков может быть определена по относительной подвижности белка в геле, а наличие одной полосы в такой геле может являться хорошим критерием чистоты препарата (рис. 26.9)

Рис. 26.9. Общий принцип зонального электрофореза. Объяснение в тексте

 

На рисунке 26.10 представлен график подвижности полипептидых цепей в 10% SDS-PAGE эксперименте как функция молекулярной массы.

Рис. 26.10. Относительная подвижность 37 различных полипептидных цепей в10% SDS-PAGE, как функция молекулярной массы

В заключение обратим внимание на связь между размерами пор геля и молекулярной массой белка. Обычно, разделяющий белки акриламидный гель, имеет концентрацию 15%. Этой концентрации соответствует определенный размер пор в геле, через которые белки с молекулярной массой 10 кДa проходят относительно свободно, в то время как белки с массой 100 кДa проходят с трудом. Это означает, что 15% полиакриламидный гель пригоден для разделения белков с массами в интервале 10- 100 кДa. Для белков с молекулярной массой более 100 кДa используется 10% или даже 7.5% гель. Рисунок демонстрирует высокую степень разрешения; достигаемую в методе SDS-PAGE на примере рибосомного белка S1.

Рис. 26.12. Анализ белков рибосом и рибосомных субъединиц из E. coli и T. thermophilus методом SDS-PAGE. M – молекулярная масса маркеров в кДa. Отчетливо видно присутствие белка S1 из E. coli в 70S рибосоме и в 30S субъединице T. thermophilus и его отсутствие в 50S субъединице. Содержание белка S1 в препаратах рибосом из T. thermophilus обычно ниже, чем содержание того же белка в стандартных препаратах рибосом E. сoli

 

Разделение по заряду: изоэлектрическое фокусирование

Изоэлектрическое фокусирование (IEF – от англ. Isoelectric focusing) является электрофоретическим методом для разделения амфотерных молекул в градиенте pH. Амфотерной называется молекула, которая способна нести положительный, отрицательный или нулевой заряд, в зависимости от рН окружения. Общий заряд амфотерной молекулы определяется величиной рH ее локального окружения. Белки являются наиболее известными примерами амфотерных молекул, несущих положительный, отрицательный или нулевой общий электрический заряд, в зависимости от pH их окружения. Для каждого белка имеется своё значение pH, называемое pI, при котором он не несет заряда. Следовательно, pI, является характеристическим свойством белка.

В градиенте pH белок будет перемещаться электрическим полем, пока не достигнет изоэлектрической точки (рис. 26.11).

Рис. 26.11. Изоэлектрическое фокусирование. В градиент pH, создаваемый молекулами амфолитов под действием электрического поля, помещается молекула белка. Градиент изменяется от кислого (pH 3) на аноде, до щелочного (pH 10) на катоде. В изоэлектрической точке рI, общий (суммарный) заряд белка равен нулю, что приводит к его остановке в электрическом поле, т. е. фокусированию

 

Его общий заряд в этой точке будет равен нулю и электрическое поле больше на него не будет действовать. Ситуация сходна с таковой в экспериментах по равновесной седиментации в градиенте плотности, когда частица движется к точке, в которой ее плотность становится равной плотности растворителя и где происходит ее остановка.

Метод IEF является идеальным для разделения белков в соответствии с их зарядом. Он обладает высокой разрешающей способностью, что позволяет разделять белки с разницей в изоэлектрической точке в 0.01 pH. Наиболее широко используемой системой в этом методе является горизонтально расположенный на стекле гель. Разделение достигается приложением разности потенциалов к гелю, содержащему pH градиент. Стабильный линейный градиент pH – ключ к успеху в экспериментах по IEF. Создание такого градиента сопровождается введением в гель соединений, известных как амфолиты. Амфолиты являются сложной смесью синтетических полиамино-поликарбоксильных кислот. Величина рН комплектов коммерческих амфолитов может варьировать от 3 до 10 или иметь более узкий интервал значений, например, от 5 до 6 единиц pH. Область рH выбирается таким образом, чтобы значение pI образца находилось внутри выбранного интервала значений рH.

Поскольку белки при изоэлектрической фокусировке перемещаются свободно в соответствии с их зарядом в электрическом поле, то, как правило; используют низкую концентрацию геля, чтобы избежать эффекта сита.