Капиллярный электрофорез

Несмотря на существенный прогресс в методологии, техническая реализация электрофореза в гелях является трудоемким процессом, занимает много времени и практически недоступна автоматизации. Капиллярный электрофорез CE выступает в настоящее время как альтернатива электрофорезу в геле со всеми преимуществами современных автоматизированных технологий. CE технология может быть адаптирована и к двумерному электрофорезу.

 

Одномерный капиллярный электрофорез

Как предполагает название, при проведении CE образец перемещается в очень узких капиллярах, внутренний диаметр которых обычно составляет от 20 до 100 мкм. Капилляры из плавленого кварца погружаются в резервуар с электролитом и электродами, на которые подается напряжение. Электроды, сделанные из такого инертного материала как платина, помещаются в электролитный резервуар. Небольшой объем образца вводится в капилляр с одного конца. На рисунке 26.15 представлена схема типичного прибора для капиллярного электрофореза.

Рис. 26.15. Схематическое изображение аппаратуры для капиллярного электрофореза

 

Разделенные молекулы регистрируются детектором, находящимся на конце капилляра, противоположном тому, куда вводится образец. Термин электрофореграмма представляет собой графическое изображение ответа детектора.

Теория капиллярного электрофореза базируется на двух уравнениях. Первое определяет электрофоретическую подвижность, μ, как:

μ = L²/Vt (26.15)

где t – это время, необходимое для перенесения образца к детектору (в секундах), L – длина капилляра (в сантиметрах) и V – прилагаемое напряжение. Второе уравнение определяет эффективность разделения в понятиях общего числа теоретических тарелок, N, как:

N = μV/2D (26.16)

где D – коэффициент диффузии молекулы.

Общее число тарелок или пластин, N, – термин, используемый в хроматографии, – является мерой эффективности разделения. Главным отрицательным эффектом, снижающим разделение в капиллярном электрофорезе, является молекулярная диффузия растворенного вещества внутри капилляра. Диффузия уменьшается с ростом молекулярной массы. Следовательно, теоретически возможно подсчитать число N для многих белков и нуклеотидов в методе CE, исходя из их коэффициентов диффузии. Для больших полинуклеотидов число N может достигать 10 миллионов

Из уравнения 26.15 следует, что для получения наилучшего разрешения необходимо прикладывать наибольшее напряжение к капилляру минимальной длины. Однако имеются практические ограничения для такого подхода. Когда длина капилляра уменьшается, количество тепла, которое должно рассеяться, увеличивается, благодаря уменьшению электропроводности капилляра. Высокое напряжение вызывает больший ток, и как следствие этого большее нагревание. На практике, необходим компромисс при выборе величины напряжения и длины капилляра. Возможен вариант компромисса − это напряжение 20-50 кВ при длине капилляра 40-100 cм. При этом разделение занимает обычно несколько минут. Использование плавленого кварца в качестве материала для капилляра позволяет выполнить определение разделенных компонентов прямо в капилляре. Часть полиамидного покрытия удаляется с конца капилляра, который расположен в освещаемой части оптического детектора. Количество вводимого образца (обычно под давлением) измеряется в нанолитрах. Скорость прохождения через капилляр небольших объемов образца мала, около 1 мкл в минуту, что дает возможность сочетать оборудование CE с ионизирующими источниками масс-спектрометра. Важным усовершенствованием метода CE является использование лазерных источников для возбуждения лазер-индуцируемой флуоресценции непосредственно в капилляре. Этот метод, включающий также окрашивание молекул, обеспечивает определение концентрации молекул от 10⁻¹¹ M и ниже. При введении образца объемом около нанолитра, реальное количество детектируемого вещества, которое можно определить методом CE исчисляется в аттомолях (10^-18 моля) или зептомолях (10^-21 моля). Напоминаем, что объем в 1 зептомоль – это 600 определяемых молекул, то есть анализируется именно число молекул.

Помимо высокой чувствительности, флуоресцентный анализ обладает высокой селективностью при введении различных меток в детектируемую молекулу. Анализ ДНК с использованием меченых нуклеотидов в настоящее время является рутинной практикой.

В отличие от гель-электрофореза в капиллярном электрофорезе важной составляющей, является величина электроосмотического потока (EOF ‒ от англ. Electroosmotic flow). В общем случае электроосмотический поток направлен по направлению к отрицательно заряженному катоду. Отличающиеся электрофоретическими подвижностями, молекулы двигаются к противоположно заряженному электроду. Отрицательно заряженные частицы двигаются к положительно заряженному аноду, положительно заряженные ‒ к катоду в направлении электроосмотического потока. (рис. 26.16). Этот поток значительно сокращает время анализа и может преодолеть тенденцию ионов передвигаться к соответствующему его заряду электроду.

Рис. 26.16. Схематическое изображение явления электроосмотического потока. Электроосмотический поток относится к потокам жидкости в разделительной камере и возникает при взаимодействии заряженных групп со стенками камеры

 

Стенки капилляра, состоящие из плавленого кварца, содержат силанолы, которые ионизируются при контакте с раствором электролита с высоким pH. При диссоциации образуется отрицательный заряд на стенке капилляра, который нейтрализуется ионами металла. При подаче напряжения ионы металла и ассоциированные с ними молекулы воды перемещаются по направлению к катоду. Это движение ионов с ассоциированными молекулами воды, создает поток раствора к детектору. Поток эффективно прокачивает растворенные ионы вдоль капилляра и может рассматриваться как «электронасос» без мотора. Для устранения электроосмотического потока, капилляр внутри покрывается нейтральными гидрофильными полимерами. Такое покрытие стенок повышает вязкость слоев вблизи стенки капилляра, устраняя это явление.

Рис. 26.17. Разделение белков при pH 4.5, методом CE в открытом капилляре. Капилляр с параметрами: 50 cм×75 мкм покрыт линейным полиакриламидом. Напряженность электрического поля – 530 V·cм-1, 1, лизоцим; 2, цитохром c; 3, миоглобин; 4, трипсиноген; 5, α-химотрипсиноген A

Рисунок 26.17 демонстрирует пример высокоразрешающей способности метода CE. Разделение смеси белков выполнялось в открытой камере в капилляре со стенками, предотвращающими адсорбцию образца. Разделение было быстрым, а пики узкими. Если адсорбция образца на стенке капилляра минимальна, эффективность разделения достигает 10⁶ теоретических “тарелок” на метр (мера ширины пика, см. уравнение 26.16). Этот показатель приблизительно в 10-100 раз лучше, чем в жидкостной хроматографии высокого давления.

Сверхбыстрый капиллярный электрофорез

Как следует из уравнений 26.15 и 26.16 для достижения наиболее быстрого разделения молекул в методе CE необходимо максимально увеличить подаваемое напряжение на капилляр минимальной длины. Однако этому препятствует ряд обстоятельств, обсужденных в предыдущем параграфе и в первую очередь сопутствующее выделение тепла. Решение этой проблемы достигается выбором необычной геометрии капилляра – в форме песочных часов – для повышения локальной силы электрического поля в месте разделения. Комбинация такой формы капилляра с ультрабыстрым введением образца дает возможность провести разделение в течение микросекунд. На рисунке 26.18 a схематически представлен узко сфокусированный лазерный пучок, для определения электрофоретически разделенных компонентов. При уменьшении поперечного сечения капилляра в 30-40 раз, электрическое поле напряженностью в 0.1 MВ cм⁻¹ может образоваться на коротком отрезке капилляра при прикладываемом потенциале в 20 кВ. Образец переносится электрокинетически внутри капилляра (рис. 26.18 б).

Рис. 26.18. a) Схематическое изображение фотопроцесса в капилляре для микросекундного разделения молекул. Два сильно сфокусированных лазерных пучка образуют места регистрации входа и выхода молекул при их движении в капилляре. б) Изображение типичной формы кварцевого капилляра (29 мкм внутренний диаметр и 320 мкм внешний диаметр) в геометрии песочных часов. Шкала 250 мкм. На вставке показанa центральная область капилляра длиной ≈ 60 мкм, в которой происходит регистрация продуктов разделения

 

Возможности этой системы продемонстрированы на рисунке 26.19. Область в 0.15 MВ·cм⁻¹ была использована для фракционирования 5-гидрокситриптамина (5HT) и гидрокситриптофана (5HTрп) на микросекундной шкале времени.

 

Рис. 26.19. Электрофоретическое разделение фотопродуктов 5HT и 5HTРП за 10 мкс. Поле напряженностью в 0.15 MВ cм−1 (35 кВ) было использовано для фракционирования компонентов. Расстояние между оптическими зонами детектирования 9 мкм

Будущее этой методологии выглядит многообещающим, особенно для исследования коротко живущих интермедиатов (продуктов промежуточных реакций), которые сегодня традиционно исследуются методами спектроскопии.

 

Электрофоретическая подвижность молекул ДНК

Электрофоретическая подвижность макромолекул, наблюдаемая в CE, отличается от электрофоретической подвижности в растворе из-за существования электростатического потока EOF (см. выше). На рисунке 26.20 показано применение метода CE для измерения подвижности фрагментов ДНК. Капилляр покрыт акриламидным мономером, стабильным при щелочных pH, и, как считается, устраняющим явление EOF, обусловленное стенками капилляра. Двуспиральный фрагмент длиной 20 п. о. был получен методом отжига двух последовательностей: CGCAAAAACGCGCAAAAACG и CGTTTTTGCGCGTTTTTGCG.

Верхняя картинка рисунка относится к индивидуальным, ненормированным измерениям фрагментов. На нижней картинке данные нормированы на электрофоретическую подвижность фрагмента длиной в 20 пар оснований, с тем, чтобы учесть остаточное изменение свойств капилляра под действием ЕОF. Как видно из рисунка, нормализация приводит к существенно меньшему разбросу экспериментальных данных.

 

Рис. 26.20. Зависимость электрофоретической подвижности от логарифма молекулярной массы для фрагментов монодисперсной ДНК в буфере, содержащем трис-ацетат ЭДТА. Капилляр имел в длину 38.8 см. Внешний диаметр 350 μм, внутренний 100 μм. Прикладываемое поле – 200 в.см-¹

 

 

Подвижность фрагмента ДНК длиной 20 п.о. в TAЭ буфере (трис-ацетат в присутствии ЭДТА) оказалась равной (3.00 ± 0.05)×10⁻⁴·cм²·В⁻¹ сек⁻¹, при 25^оC, и не зависела от концентрации ДНК и напряженности электрического поля. Как видно из рисунка 26.20 подвижность ДНК не зависит от ее молекулярной массы, начиная с длины в 170 пар оснований. Удивляет резкость такого перехода. Авторы связывают его с переходом ДНК из конформации двойной спирали в конформацию клубка. Такой переход действительно имеет место, однако он происходит не скачком, а постепенно. Причина такого разного поведения ДНК в явлениях свободного электрофореза и вращения под действием электрического поля пока не ясна. Можно полагать, что наблюдаемое явление связано с полиэлектролитными эффектами, поскольку оно наблюдается также на малых полуфосфатах, полилизине, полистиролсульфанатах, одноцепочечных ДНК.

Из данных капиллярного фореза можно вычислить коэффициенты диффузии олигомеров ДНК (уравнение 26.15). Коэффициент диффузии фрагмента ДНК длиной 20 п. о. хорошо согласуется с величиной полученной методом динамического рассеяния света.

 

Двумерный капиллярный электрофорез

Напомним, что в стандартном двумерном электрофорезе деление как в первом так и во втором направлениях выполняется в полосе геля. К настоящему моменту разработаны приборы, являющиеся прототипом двумерного гель-электрофореза в формате капилляра. Они позволяют провести разделение макромолекул в первом направлении в одномерном капилляре, физически разобщенном с капиллярами, делящими во втором направлении. После окончания первого разделения в горизонтальном направлении, капилляр для деления в первом направлении физически соединяется с капиллярами для разделения во втором направлении, представляющем собой набор параллельных вертикально расположенных капилляров. Использование полидиметилсилоксана для создания системы таких двумерных текучих микросред позволило создать реально работающий прототип прибора для разделения в капилляре в одном направлении и обеспечения пути миграции белков к ортогонально выстроенным капиллярам во втором направлении.