ЛЕКЦИЯ 15. ЯДЕРНЫЙ МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС ЯМР Рис. К1.1 Спектр электромагнитного излучения от γ –лучей ν = 1022 Гц до радиочастотных волн 104 Гц
ЛЕКЦИЯ 15. ЯДЕРНЫЙ МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЯМР)
ЯМР как разновидность спектроскопии
Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является разновидностью спектроскопии, основанной на поглощении электромагнитного излучения в радиочастотном диапазоне (10 МГц – 1 ГГц). В отличие от абсорбционной спектроскопии в УФ, видимой и ИК-областях, в которых излучение взаимодействует с электронами внешних оболочек атомов, в ЯМР оно взаимодействует с ядрами атомов. Чтобы поглощение излучения произошло, ядро помещают в интенсивное магнитное поле, где оно принимает соответствующее энергетическое состояние.
На рис. К1.1 показан спектр электромагнитного излучения от радиочастотной области (частота ν = 104 Гц) до γ-излучения (ν = 1022 Гц). В ЯМР используется низкочастотная часть спектра, тогда как остальные спектроскопические методы имеют дело с расщеплением уровней с бóльшей энергией и, соответственно, с бóльшими частотами.
Рис. К1.1 Спектр электромагнитного излучения от γ –лучей (ν = 1022 Гц) до радиочастотных волн (104 Гц)
Как и в оптической спектроскопии, в ЯМР для полного понимания его основ в терминах частот поглощения и энергетических состояний ядер необходимо использовать квантовую механику. Тем не менее, классическое описание тоже позволяет получить хотя и неполную, но достаточно ясную физическую картину процесса.
Магнитные свойства ядра: ядерный спин
Рис. К1.2 Схематическое изображение сферического невращающегося ядраЯдра в отсутствии магнитного поля
Для того чтобы понять, как проходит ЯМР-эксперимент и предсказать его результаты, нам нужен аппарат, с помощью которого мы можем «визуализировать»… Теперь рассмотрим образец, состоящий из множества одинаковых ядер со спиновым…Действие радиочастотного поля
Рис. К1.15 (а) В резонансом эксперименте внешнее радиочастотное магнитное поле B1 находится в плоскости xy. (б) Если…Процессы релаксации
Первый тип связан с установлением теплового равновесия в ансамбле ядер с различной энергией. В отсутствие магнитного поля два энергетических уровня,…Химическиe сдвиги
Рис. К1.20 Внешнее магнитное поле B0 вызывает циркуляцию электронов в атоме в пределах своих орбиталей. Движение электронов, в свою очередь,… Химические сдвиги возникают вследствие того, что реальное магнитное поле B, действующее на ядро атома, немного…Общие принципы
В самом начале становления ЯМР-спектроскопии (1945-1970) для получения спектров использовался так называемый постоянный режим, когда образец…Одноимпульсные эксперименты
В этом параграфе мы опишем ЯМР-эксперименты с использованием только одного…Восстановления
Схема измерения времени спин-решеточной релаксации T1 методом инверсии-восстановления представлена на рис. K2.11. Сначала ядра подвергают действию радиочастотного импульса такой ширины, чтобы вектор M повернулся на 180o по отношении к оси z (смотри параграф К2.2.1). После этого сигнал задерживается на некоторое время τ, называемое временем задержки (delay). Время задержки – ключевой момент для большинства многоимпульсных методов. Длина и число задержек подбираются определенным образом. В данной схеме это обычно 10 задержек, из которых первая – небольшое время, на порядок меньшее ожидаемого релаксационного времени T1, а последняя, напротив, в 10 раз его больше.
Рис. К2.11. Схема последовательности импульсов для измерений времени релаксации T1 методом инверсии- восстановления
Хотя показанная на графическая схема последовательности импульсов достаточно наглядна, чаще всего она представляется в более компактной форме:
Установление равновесия – 180ox ↓ – τ – 90ox – ↓ детектирование
Рис. К2.13 График преобразованной интенсивности пика как функции τ (Williams and King, 1990a)
Измеряемые интенсивности зависят от T1 экспоненциально:
I = I∞ (1 – 2e– τ/T1) (K2.27)
Типичный график зависимости интенсивности от τ показан на рис. K2.13. Интенсивность пика равна нулю, когда τ/T1 = ln(2), т.е. когда τ = 0.693T1.
Измерения времени спин-спиновой релаксации T2 методом спинового эха
Определение времeни спин-спиновой релаксации T2 сопряжено c некоторыми трудностями, связанными с тем, что на практике определяется эффективное время…Перенос поляризации с одних ядер на другие
Другая важная группа многоимпульсных экспериментов включает в себя методы переноса поляризации с одних ядер на другие для усиления… Способы переноса поляризации основаны на эффекте Оверхаузера (NOE),…Ядерный эффект Оверхаузера
Рис. К2.19. Схематическое представление NOE. Молекула содержит два неэквивалентных спина I и S без скалярного…NOE и межъядерные расстояния
NOE ~ f(rIS)∙f(τc) (K2.8) Первая составляющая, f(rIS) - функция расстояния rIS между протонами, а вторая, f(τc) – функция времени…Многомерные и многоядерные эксперименты
Общая схема 2D-ЯМР-спектроскопии представлена на рис. K2.25. Здесь присутствуют четыре последовательных временных периода: приготовление, эволюция,…Установление равновесия -90o↓ – kt1 –↓ 90o- детектирование
Рис. К2.26 Последовательность импульсов в COSY в графическом (верх) и сжатом (низ) представлении Рассмотрим два скалярно сопряженных протона A и B. В результате действия простого импульса и регистрации, a также и…Многомерный, гомо- и гетероядерный ЯМР
Многомерный гомоядерный ЯМР
Напоминаем, что все 2D-эксперименты построены по одной основной схеме: за подготовительным импульсом (P) следует период эволюции (E(t1)) во время… 3D-импульсная схема состоит из двух 2D-импульсных последовательностей, с… Первые 3D-эксперименты были выполнены на 1H-гомоядерных белках. Несмотря на элегантность метода пределом таких…В течение последних 20 лет максимально доступное магнитное поле в ЯМР-экспериментах повышалось с шагом, соответствующим резонансным протонным частотам 400, 500, 600, 750, 800, а теперь уже 900 МГц. Каждый из этих шагов открывал перед ЯМР-методом новые возможности в структурной биологии из-за увеличения чувствительности и более полного разделения пиков. Однако, для гетероядерных экспериментов эти преимущества частично нивелируются зависящим от поля уширением линии вследствие увеличения скорости поперечной релаксации. Чтобы преодолеть это ограничение ученым российской школы К. Первушиным (К. Pervushin), из лаборатории Вютриха была предложена схема TROSY.
Последовательность импульсов TROSY для 2D-15N-1H-корреляционной спектроскопии показана на рис. K2.36.
Рис. К2.36 Основная последовательность импульсов в двумерной 15N-1H-корреляционной спектроскопии
В этом эксперименте сначала создают протонную намагниченность, которая затем переносится на ядра 15N через элемент переноса поляризации (INEPT, см. К2.3.3). После «частотного мечения» 15N-намагниченность в течение периода эволюции t1 возвращается на 1H через элемент обратного переноса поляризации, и затем детектируется на 1H в течение t2. Поперечная релаксация (раздел K2.3) происходит в многомерных ЯМР-экспериментах, т.е. во время периодов переноса поляризации, а также в течение периодов частотного мечения. Скорость поперечной ядерной спиновой релаксации возрастает с ростом молекулярной массы и имеет наибольшее влияние на максимально допустимый размер изучаемых с помощью ЯМР макромолекулярных структур в растворе.
Технически, подход TROSY реализуется следующим образом. В гетероядерных системах двух спинов, таких как 15N-1H и 13С-1H, ЯМР-сигнал каждого ядра расщепляется на два компонента через скалярное спин-спиновое взаимодействие. Поэтому в двумерных корреляционных экспериментах наблюдается четкая структура из четырех линий. При использовании техники TROSY мультиплетная структура не рассогласовывается и сохраняется только самая узкая и наиболее медленно релаксирующая полоса каждого мультиплета.
Осуществление [15N-1H]-TROSY в эксперименте по тройному резонансу дает в несколько раз большую чувствительность для 2H/13C/15N-меченых белков и примерно двукратную чувствительность для 1H/13C/15N-меченых белков. С помощью TROSY в настоящее время можно получать трехмерные структуры белков с молекулярной массой, близкой к 100 кДа.
В заключение заметим, что реализация таких экспериментов на практике требует огромной подготовительной работы по селективному мечению белков и немалых капиталовложений.