Установление равновесия -90o↓ – kt1 –↓ 90o- детектирование

 

Рис. К2.26 Последовательность импульсов в COSY в графическом (верх) и сжатом (низ) представлении

 

Рассмотрим два скалярно сопряженных протона A и B. В результате действия простого импульса и регистрации, a также и последующего фурье-преобразования получают ЯМР-спектр, который на рис. K2.27 показан в виде диаграммы.

 

 

Рис. 2.27. Фурье-преобразование сигнала, возникающего в результате приложения радиочастотного импульса к двухспиновой системе дает ЯМР-спектр

 

Обозначим ларморовы частоты спинов A и B и их скалярное сопряжение (J), соответственно, как ω_A, ω_B, J_AB. Спин A прецессирует с ларморовой частотой ω_A в течение периода t₁, а спин B прецессирует с ларморовой частотой ω_B в течение t₁, хотя в действительности для каждого спина существуют две частоты (ω_A± ½ J_AB и ω_B ± ½ J_AB) вследствие спин-спинового взаимодействия. Теперь рассмотрим результат действия последовательности импульсов изображенных на рис. K2.28. Пусть мы регистрируем данные в течение интервалов t₁ и t₂. После второго 90^o-ного импульса ситуация усложняется. Во-первых, второй импульс не повлияет на часть спинов, т.е. они будут продолжать прецессировать с частотами ω_A и ω_B в течение периода t₂ – также как и в период t₁. Во-вторых, часть намагниченности, связанной со спином A, будет переноситься на спин B в течение времени t₂ из-за скалярного взаимодействия J_AB. Этот результат – следствие процесса, известного как перенос когерентности. Поэтому, часть спинов A, прецессировавших в течение t₁ с частотой ω_A, будет прецессировать с частотой ω_B во время t₂. В аналогичной манере, часть спинов, прецессировавших с частотой ω_B во время t₁, теперь прецессирует с частотой ω_A во время t₂. Далее: поскольку мы наблюдаем ЯМР-спектр по отношению к двум временным периодам, необходимо применить фурье-преобразование для наблюдения описанных частотных компонентов. Это значит, что мы можем представить спектр в двух частотных измерениях на плоскости. Такой график для системы двух спинов показан на рис. K2.28.

 

 

Рис. К2.28. Схематическая иллюстрация контурного графика ¹Н-¹Н-COSY-спектра для двух взаимодействующих спинов. Черными кружками отмечены диагональные пики, а светлыми недиагональные или перекрестные-пики. Пунктирной линией показано, как перекрестные-пики коррелируют с диагональными пиками, полученными из скалярно взаимодействующих спинов

 

Реальный спектр, полученный для 2,3-дибромтиофена с помощью последовательности импульсов, похожей на ту, что изображена на рис. K2.26, показан на рис K2.29. Можно видеть два типа двумерных пиков. Восемь пиков вокруг диагональной линии (пунктирная прямая на рис. K2.29), пересекающей спектр, есть результат взаимодействия одних и тех же спинов в обоих измерениях (± ½ J_AB). Другие восемь пиков за пределами диагональной линии соответствуют взаимодействию между разными спинами (опять же, ± ½ J_AB). Последние восемь пиков в этом случае очень важны, поскольку их появление указывает на то, что существует взаимодействие между двумя сближенными ядрами через скалярное сопряжение. Ниже мы увидим, что перекрестные пики широко используются для трехмерной расшифровки сложных спектров белков, даже в тех случаях, когда резонансные линии в одномерном спектре перекрываются.

 

 

Рис. К2.29 Двумерный спектр 2,3-дибромтиофена (спиновая система AX), полученный с помощью последовательности импульсов, показанной на рис. К2.26. Справа - его структурная формула. Химическая формула 2,3-дибромтиофена - С₄Н₂Br₂S

 

Во втором примере на рис. K2.30a показаны одномерный и 2D-COSY –спектры для небольшого белка из 57 аминокислотных остатков ингибитора протеазы K. Отметим, что двумерный спектр белка может быть изображен двумя различными способами. В первом способе, называемым этажерочным (Рис. K2.30б) высоты пиков показываются в третьем измерении, тогда как во втором, называемом контурным, высоты пиков пропорциональны их интенсивности на двумерной плоскости (Рис. K2.30в).

 

 

Рис. К2.30. ¹H-COSY-спектр D₂O-раствора ингибитора K (0.01 M, pD 3.4, 25^oC, 360 МГц): (а) одномерный ¹H-ЯМР-спектр; (б) этажерочное представление COSY-спектра; (в) контурный график COSY-спектра (Wutrich, 1986)

 

На диагонали, идущей от верхнего правого угла этажерочного ¹H-COSY-спектра (Рис. K2.30б), можно распознать полный одномерный ЯМР-спектр (Рис. K2.30a). Например, высокопольные пики резонансов метильных группы при – 0.9 м.д. имеют координаты (ω₁ = - 0.9 м.д., ω₂ = - 0.9 м.д.), а самые низкопольные резонансы амидных протонов располагаются при 10.3 м.д. (ω₁ = 10.3 м.д., ω₂ = 10.3 м.д). Расположение этих перекрестных пиков лучше всего видно на контурном графике (Рис. K2.30в). Спектр симметричен по отношению к диагонали. Используя эмпирическое правило, что перекрестные пики COSY наблюдаются, за некоторым исключением, только между протонами, разделенными тремя или менее ковалентными связями в аминокислотной структуре можно очертить области a-NH (Рис. K2.30в, ниже диагонали) между этими протонами в аминокислотах.

Спектроскопия с использованием ядерного эффектa Оверхаузера (NOESY)

 

Последовательность импульсов NOESY сходна с таковой в COSY, но отличается дополнительным третьим 90^o-м импульсом (Рис. K2.31). Результирующая последовательность выглядит следующим образом:

установление равновесия – 90^o ↓ t₁↓ 90^o – τ_смеш – 90^o – ↓ t_{2 -} детектирование.

Рис. К2.31. Вверху показана последовательность импульсов в двумерном NOESY. Внизу показан контурный график схематичного двумерного NOE-спектра. Из пяти резонансных линий A-E только три пары близки в пространствe: A и C, B и D, B и E (Kumar et al, 1980)

 

Как и в COSY первая часть последовательности состоит из времени для установления равновесия и начального 90^o-го импульса. После этого вектор z-намагниченности находится в плоскости xy. В течение варьируемого периода развития t₁ ядра приобретают химические сдвиги, соответствующие их микроокружению. Второй 90^o-й импульс поворачивает часть намагниченности обратно к оси z. В течение интервала τ_смеш (который обычно постоянен) продольной намагниченности дают отрелаксировать. Это приводит к смешиванию намагниченности ядер, которые связаны механизмом дипольной релаксации, коррелируя таким образом их химические сдвиги. Третий 90^o–й импульс сообщается системе чтобы повернуть векторы обратно к плоскости xy, где они детектируются в течение периода t₂.

Общие черты 2D-NOE-спектра отмечены в нижней части рис. K2.31. Компоненты намагниченности, которые не обмениваются с другими компонентами в период смешивания τ_смеш сохраняют свои частоты в течение периодов t₁ и t₂. Поэтому соответствующие пики в 2D-спектре лежат на диагонали. Обмен намагниченности между двумя компонентами из-за дипольного взаимодействия во время периода смешивания приводит к образованию перекрестных пиков. Из рис. К2.31 видно, что пик A связан диполь-дипольным взаимодействием с пиком C, а пик B – с D и E.

 

 

 

Рис. К2.32 Контурный график протонного двумерного NOESY-спектра BPTI при 360 МГц. Концентрация белка составляла 0.02 М, растворитель ²Н₂О, рН 3.8, Т=18^оС. Время смешивания равнялось 100 миллисекундам. Полное время накопления – 18 часов. Пунктиром показаны кросс-релаксационные связи для выбранных аминокислот (см. текст). Связанные пики охарактеризованы однобуквенными символами для аминокислот (А= аланин, T = треонин, С = цистеин, Q= глутамин, F = фениналанин, Y = тирозин), положением в аминокислотной последовательности (числа) и типу наблюдаемых протонов. Полосы интенсивных артефактных сигналов простираются от линии воды при 4.85 м.д. параллельно осям ω₁ и ω₂

 

2D-NOESY-спектр BPTI показан на рис. K2.32. Он показывает, например, что протон амидной группы Glu 31 сближен с α-протоном Cys 30, так же видно близкое расположение между 3,5-протонами кольца Tyr 23 и α- и метильными протонами Ala 25. Перекрестные пики указывают на то, что пары протонов разделены менее чем 5 Å, тогда как отсутствие пика говорит о бóльшем расстоянии. NOESY-спектр и его качество имеет принципиальное значение для расшифровки трехмерной макромолекулярной структуры с помощью ЯМР.