Химическиe сдвиги

Рис. К1.20 Внешнее магнитное поле B₀ вызывает циркуляцию электронов в атоме в пределах своих орбиталей. Движение электронов, в свою очередь, генерирует дополнительное поле B`, противоположное направлению поля B₀

 

Химические сдвиги возникают вследствие того, что реальное магнитное поле B, действующее на ядро атома, немного отличается от внешнего поля B₀. Поле B несколько меньше B₀, из-за экранирования ядра окружающими электронами. Внешнее поле вынуждает электроны циркулировать по своим атомным орбиталям, как электрический ток, проходящий через катушку. Это приводит к образованию слабого поля B^′, чей вектор напряженности имеет направление, противоположное B₀ (Рис. K1.20). Поле B^′ пропорционально B₀ и обычно в 10⁴-10⁵ раз его слабее. Действующее на ядро магнитное поле может быть записано как

B = B₀ – B ^′ = B₀ (1 – σ) (K1. 16)

где константу пропорциональности σ обычно называют константой экранирования. Тогда условие резонанса (Уравн. К1.1) принимает следующий вид:

ν = γ B₀ (1 – σ)/2π (K1.17)

т.е. резонансная частота ядра внутри атома немного меньше таковой ядра, лишенного электронов (Рис. К1.21).

Рис. К1.21 Энергетические уровни ядра со спином ½

Величина константы экранирования в значительной степени зависит от химического окружения ядра. Для протонов метильной группы она больше, чем для протонов метиленовой группы и меньше для протонов гидроксильной группы. Для изолированного ядра водорода константа экранирования равна нулю.

Константа экранирования σ не очень удобна для характеристики химического сдвига. Поскольку его абсолютную величину определить трудно, да и требуется она редко, то химический сдвиг выражают в терминах разности резонансных частот между интересуемым ядром (ν_x) и эталонным (ν_этал) через безразмерный параметр δ:

δ = (ν_x – ν_этал)/ ν₀ (K1.18)

где ν₀ – частота спектрометра. Разность частот ν_x – ν_этал делят на величину ν₀ для того, чтобы определить δ как свойство, независимое от внешнего магнитного поля. Химический сдвиг δ принято выражать в миллионных долях (м.д.). Преимущество такого определения заключается в том, что для данного пика величина δ всегда одинакова вне зависимости от частоты используемого инструмента, будь то спектрометр с рабочей частотой 60 МГц или 100 МГц (Рис. K1.22). Обычно пики ЯМР отмечают на линейной шкале δ, при этом напряженность поля растет слева направо. В примере на рис. K1.22 эталонный пик тетраметилсилана определяет нулевое значение шкалы δ, а значения δ увеличиваются справа налево.

Рис. К1.22. Стандартная шкала абсцисс для ЯМР-спектра (Skoog et al.,1995)

 

Наиболее удобным способом получения эталонного сигнала является добавка определенного соединения к образцу. В случае со спектрами ¹Н и ¹³С для этого обычно служит тетраметилсилан (СН₃)₄Si (английская аббревиатура TMS). Эта молекула инертна, растворима в большинстве органических растворителей и все его 12 протонов дают один резонансный пик. Более того, ядра ¹Н и ¹³С сильно экранированы (большие значения δ) поэтому резонанс TMS сдвинут к низкочастотному концу спектра. К сожалению, TMS не растворим в воде, поэтому в водных растворах в качестве эталонного соединения используют натриевую соль 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоновой кислоты (английская аббревиатура DSS). Протоны метильной группы этого соединения дают пик почти в том же самом месте спектра, что и TMS. Однако протоны метиленовой группы DSS продуцируют серию небольших пиков, которые могут мешать измерению. По этой причине большинство коммерческих препаратов DSS имеют дейтерированную метиленовую группу, что позволяет избавиться от этих нежелательных сигналов

Химический сдвиг ядра зависит от многих факторов, но более всего от окружающей электронной плотности. Высокая электронная плотность приводит к сильному экранированию, поэтому чтобы добиться резонанса, магнитное поле следует увеличить. Сдвиг в область высокого поля приводит к более низким значениям δ. Наоборот, низкая электронная плотность обуславливает сдвиг вниз (в область низкого поля) и рост значения δ. Например, химические сдвиги протонов метильной группы по отношению к TMS становятся больше по мере роста электрон-акцепторных свойств X: δ(CH₃ –CH₃) ≈ 1, δ(CH₃ –C₆H₆) ≈ 2, δ(CH₃ –OH) ≈ 4. Если протон присоединен непосредственно к электроотрицательному атому, как, например, в карбоксильной группе, у которой очень низкая электронная плотность, то химический сдвиг может иметь очень большое значение δ: δ(COOH) ≈ 10. На рис. K1.23 показаны примерные значения химического сдвига для протонов различного типа. Большинство протонных полос лежат в диапазоне значений δ от 1 до 13.

Рис. К1.23. Приблизительные величины химических сдвигов, выраженные в миллионных долях (м.д.) относительно эталонных значений для различных типов протонов. Чем меньше значения δ, тем больше химическое экранирование и тем сильнее сигнал протонов сдвигается в область высокого поля. Эталонный сигнал – сигнал TMS для неводных растворов или DSS для водных растворов (Tinoco et al., 1998)

 

 

Интенсивность поглощения строго пропорциональна концентрации ядер (в нашем случае протонов), что очень важно при определении структуры. То есть ЯМР можно использовать для расчета относительного содержания протонов различного типа в молекуле.

На рис. K1.25 показан одномерный ¹H-ЯМР-спектр трипсинового бычьего ингибитора панкреатической железы быка (английская аббревиатура BPTI), где положения резонансных пиков различных атомов водорода определяются величиной их химического сдвига δ, выраженного в м.д. Видно, что резонансные линии всех метильных групп расположены справа около 1 м.д.; линии лабильных амидных протонов полипептидного остова расположены слева от 7 до 11 м.д.; в середине находятся пики групп метилена при 2-3 м.д., α-протоны при 4-5 м.д., а протоны ароматических колец при 6-7,5 м.д.

 

Рис. К1.25. Одномерный ¹Н-ЯМР-спектр D₂O-раствора белка BPTI (концентрация белка 5 мМ, pD=4.5, T=318 K, частота ¹Н- ЯМР = 360 МГц). HDO отмечает резонансный пик воды растворителя (Wuthrich, 1995)

 

Все боковые группы аминокислот в полностью развернутой полипептидной цепи находятся в одинаковом окружении растворителя, поэтому многочисленные копии определенной аминокислоты в цепи имеют почти одинаковые химические сдвиги ядер ¹H. Таким образом, ¹H-ЯМР-линии развернутой полипептидной цепи соответствуют сумме резонансных полос составляющих аминокислотных остатков. На рис. K1.27 показан рассчитанный таким образом спектр неупорядоченного клубка денатурированного BPTI. Сложность ЯМР-спектра нативного BPTI (Рис. K1.25) зависит прежде всего от конформационных различий в химических сдвигах ¹H, вызванных влиянием растворителя: внутренние пептидные участки глобулярных белков экранированы от растворителя и окружены другими пептидными участками (Рис. K1.26). Линии ЯМР между 7.5 и 11 м.д. в глобулярном белке соответствуют амидным протонам полипептидного остова белка, которые медленно обмениваются с молекулами ²H₂О растворителя благодаря своему положению в третичной структуре. Они не имеют аналогов в спектре развернутого белка, так как спектр на рис. К1.27 был рассчитан с тем предположением, что эти протоны полностью обменялись с ²Н.

Рис. К1.26. Схематическое представление боковых цепей аминокислот в протяженной неупорядоченной конформации(а) и в свернутой глобулярной конформации (б) (Wuthrich, 1995)

 

Рис. К1.27. Расчетный ¹Н-ЯМР-спектр неупорядоченного клубка BPTI в растворе ²H₂O, где все подвижные протоны N-H и O-H-групп заменены на ²H. Все резонансные полосы в спектрах были приписаны отдельным атомам водорода в белке. Черточками отмечены положения и интенсивности γСН₃-резонансов треониловых остатков в положениях 11, 32 и 54, а также протонов ароматической группы остатков тирозина в положениях 10, 21 и 35 (Wutrich, 1995)

 

Установлено, что магнитные свойства кристаллов ароматических соединений различны в зависимости от ориентации ароматического кольца по отношению к внешнему полю. Это называется эффектом кольцевого тока.

Для некоторых ядер диапазон химического сдвига больше, чем для ядер ¹H. Эта величина для ядер ¹³C в различных функциональных группах обычно лежит в диапазоне от 0 до 220 м.д. Для ядер ¹⁹F диапазон может составлять 800 м.д., а для ядер ³¹P – 300 м.д. или более.

Одномерный ЯМР

 

ЯМР-спектроскопия с Фурье-преобразованием