МИКРООРГАНИЗМОВ-Деструкторов

Загрязнение окружающей среды происходит в результате выброса разнообразных ксенобиотиков, многие из которых плохо подвержены деструкции или биотрансформации во внешней среде. Эти вещества накапливаются в почве и воде, что приводит к отрицательному влиянию на природную флору и фауну.

Долго бытовало ошибочное убеждение, что природные сообщества микроорганизмов (консорциумы) способны усваивать все органические соединения, и поэтому возможной ощутимой токсичности по отношению к человеку и животным подобных соединений первоначально не придавали должного значения (например, в отношении пестицидов или гербицидов). Существовало мнение, что в результате повсеместного присутствия микроорганизмов в окружающей среде и их большого катаболического потенциала любое соединение, попавшее в биосреду, будет полностью минерализовано. Эта точка зрения изменилась с появлением неразлагаемых пестицидов, таких, как дихлордифенилтрихлоретан (ДДТ) (Мюллер, 1940), и сведений о накоплении их в огромных концентрациях в организме животных и человека. Ниже приводится пример увеличения концентрации ДДТ в живых организмах в ряду последовательных трофических уровней (звеньев пищевой цепи) водной экосистемы:

 

Водная среда (1 ед.)

¯

Фитопланктон

¯

Зоопланктон

¯

Мелкая рыба (10⁶ ед.)

¯

Крупная рыба

¯

Хищные птицы (10⁸ ед.)

 

Судьба токсичных соединений в окружающей среде предопределена рядом физических, химических и биологических факторов.

Тип почвы, ее минеральный и органический состав, влажность, содержание О₂, температура оказывают влияние на скорость деградации как в результате небиологических процессов (таких, как адсорбция, окисление, гидролиз), так и под влиянием микроорганизмов, присутствующих в почве. Например, деградация гербицида далапона в суглинках осуществляется преимущественно за счет деятельности бактерий, а в иле и глине в этих процессах участвуют многие грибы.

На скорость разложения ксенобиотика влияет его химическая структура. При попадании в окружающую среду ксенобиотики могут разлагаться либо полностью, либо происходит их частичная деградация, либо происходит накопление этих веществ в природной среде. Соединения, которые подвергаются полной деградации, т.е. минерализации до диоксида углерода (СО₂), воды, аммиака, сульфатов и фосфатов, обычно проходят весь метаболический путь и могут использоваться в качестве источника углерода и энергии микроорганизмами.

Некоторые соединения (например, монохлорацетат) не являются субстратом для роста микроорганизмов, т.е. поначалу он не разлагается микробами. Но существуют микроорганизмы, которые могут вначале катализировать процесс превращения монохлорацетата в 2-монохлорпропионат, а уже затем обеспечивают трансформацию, отщепляя галогены. Осуществляется этот процесс микроорганизмами рода Pseudomonas, в частности Ps. putida.

Различные типы почв, водных и воздушных сред характеризуются своим консорбциумом (сообществом) микробных популяций. Именно благодаря этой гетерогенности природных популяций многие ксенобиотики способны подвергаться биодеградации во внешней среде. При этом часто один вид организмов осуществляет один этап (определенную стадию) разложения, а следующий осуществляет другой, и так до полного разложения (до полной минерализации). В такой последовательности ферментативных реакций продукт первого превращения становится субстратом для последующего и т.д. Происходит так называемая синергическая деградация ксенобиотиков. Синергическая деградация препятствует появлению токсичных промежуточных продуктов разложения, т.к. процесс идет до СО₂ и Н₂О.

Благодаря возможностям микробных сообществ разрушать токсичные вещества, микроорганизмы могут быть использованы для борьбы с загрязнениями окружающей среды, особенно органическими соединениями, в частности галогенорганическими.

Галогенорганические соединения являются одной из крупнейших групп загрязнителей природной среды. Они высокотоксичны, накапливаются в организме и устойчивы. Среди них всевозможные растворители, краски, лаки, гербициды и т.п. Эти соединения часто попадают в окружающую среду прямо или косвенно; их токсичность привела к тому, что многие из них включены в список основных загрязнителей окружающей среды. Причиной устойчивости и токсичности этих соединений является труднорасщепляемая галогенуглеродная связь. Наличие дополнительных заместителей - галогенов в молекуле превращает соединение, которое могло расщепляться микроорганизмами, в устойчивое.

 

?????????????

 

 

Однако отдельные распространенные в природе микроорганизмы могут метаболизировать эти соединения. Встречающиеся в природных условиях галогенсодержащие яды, помимо вносимых человеком, являются метаболитами грибов, бактерий, водорослей и млекопитающих. Механизм детоксикации осуществляется с помощью реакций ацилирования, дегалогенирования, хотя эти механизмы трансформации ксенобиотиков в начальном периоде интоксикации окружающей среды могут быть неэффективными. Со временем этот процесс может обеспечиваться за счет сверхпродукции индуцибельных ферментов или благодаря популяционной мутационной изменчивости микроорганизмов, приводящей с созданию фермента с измененной субстратной специфичностью. Дальнейшая адаптация может произойти благодаря адаптивной перестройке микроорганизмов.

Огромные возможности природных микробных сообществ в отношении биодеградации новых химических соединений известны давно. Заслуживает внимания то обстоятельство, что при повторном попадании нового соединения в окружающую среду период подготовки к его расщеплению уменьшается по сравнению с периодом при первом попадании. В течение этого периода подготовки к деградации вещества популяция микроорганизмов адаптируется или селектируется на способность деградировать соединение. Это приводит к распространению популяции, которая может затем сохраняться до 3-х месяцев после истощения субстрата. Таким образом, к моменту поступления следующих порций каких-то токсичных или химических соединений микроорганизмы, способные к разложению этих веществ, уже присутствуют в популяции и, следовательно, деградация начинается раньше.

Микроорганизмы, которые способны разрушать галогенорганические соединения, были выделены из почвы. Это микроорганизмы, которые в состоянии расщеплять галогенуглеродные связи с помощью ферментов делагогеназ. Эволюция природных популяций микроорганизмов в условиях загрязнения природной среды веществами с галогенуглеродной связью была направлена на то, чтобы селектировать или отбирать те микроорганизмы, которые обладают повышенным уровнем дегалогеназ. В ряде случаев выделяемые штаммы микроорганизмов обладают более чем одной активной формой дегалогеназ. Как известно, в генетическом плане в природе у микроорганизмов происходит случайное, ненаправленное изменение генетического материала, но как только происходит требуемая для данных условий (“удачное” сочетание генов) мутация, то “новый” микроорганизм получает селективное преимущество, т.е. природными условиями осуществляется отбор полезных генетически измененных микроорганизмов. Таким образом, в процессе эволюции в окружающей среде, в частности в почве, создались новые популяции микроорганизмов, с помощью которых можно бороться с загрязнением почв.

В результате интенсификации применения пестицидов в почве растет количество неорганических ионов, в то время как концентрация полезных органических веществ снижается. Почва все больше загрязняется и катионами тяжелых металлов. Ученые предсказывают, что возможность очистки почв от тяжелых металлов может быть найдена, и эти надежды связываются с почвенными микроорганизмами. Пока еще этот вопрос в стадии изучения и, возможно, такие микроорганизмы удастся получить с помощью генетических манипуляций.

Серьезным и стойким загрязнением почвы является нефть. Естественная почвенная микрофлора способна разрушать и такие загрязнения. Исследования по рекультивации загрязненной нефтью почвы включали смешивание загрязненной почвы с сосновой корой, то есть использовали микроорганизмы, существующие на поверхности коры и адаптированные к росту на сложных углеводородах, входящих в состав сосновой смолы, а также на способности коры адсорбировать нефтепродукты. Этот метод называется “микробное восстановление загрязненной почвы”. В этом методе используются природный сорбент и природная микрофлора.

Значительную угрозу окружающей среде представляют неочищенные сточные воды.

Существует проблема загрязнения почв и твердыми отходами, которые образуются при защите от загрязнений водных систем. Речь идет об использовании активного ила, который образуется при переработке сточных или канализационных вод. По данным авторитетных источников, в Великобритании до 40% от ежегодных расходов на утилизацию сточных вод приходится на переработку и ликвидацию ила. В странах ЕЭС до 30% произведенного ила применяется в качестве удобрения в сельском хозяйстве, так как ил по содержанию азота, фосфора, калия не уступает навозу. Но применение ила или ликвидация его путем закапывания в почву осложняется двумя обстоятельствами: присутствием в иле патогенных организмов и присутствием токсичных элементов. В активном иле часто находят сальмонеллу и бычий цепень, хотя могут присутствовать и другие патогенные виды. Бактерии рода Salmonella вызывают заболевание сальмонеллез. Представляют опасность и гельминты, вызывающие гельминтозы. Борьба с распространением этих заболеваний через ил основана на стабилизации ила, т.е. на сбраживании ила с помощью микробов и на других методах.

В иле содержатся и ионы тяжелых металлов, концентрация которых, как известно, не должна превышать определенный безопасный предел, после которого ионы тяжелых металлов вызывают нежелательные последствия. Отрицательное воздействие ионов тяжелых металлов в почве объясняется двумя типами токсического воздействия: фитотоксичностью, которая снижает количество и качество урожая, и зоотоксичностью, при которой металлы накапливаются в растениях до уровня, делающего их токсичными к моменту использования в качестве пищи. Металлом, наиболее накапливающимся, является кадмий, а именно он накапливается в растениях. Другие металлы (медь, цинк, никель) преимущественно фитотоксичны.

Таким образом, при захоронении ила в почву должен осуществляться строгий контроль за содержанием патогенных бактерий и ионов тяжелых металлов. Естественным в такой ситуации является вопрос: “Каким образом избавиться от металлов в иле, как проводить его детоксикацию?”. В настоящее время используются процессы детоксикации ила, когда ионы металлов удаляют с помощью подкисления, дальше проводят их ресорбцию на специальных биополимерах. Если бы удалось полностью расшифровать механизм реакций связывания ионов металла полимером, то можно было бы получать биологические полимеры, которые будут подобны бедным рудам, и из этих биополимеров можно будет извлекать металл.

Это один из возможных путей обезвреживания твердых отходов, но самым перспективным представляется метод обезвреживания с использованием микроорганизмов и их сообществ. Твердые отходы - это не только ил. Сюда входят коммунальные отходы, отходы сельского хозяйства, и для их переработки в будущем возможно использование не только микроорганизмов, но и других биологических объектов, то есть речь идет о биологических методах в экологии и охране окружающей среды.

Как известно, для уничтожения насекомых, сорняков, болезнетворных микробов в сельском хозяйстве широко используются пестициды. Более того, современное сельское хозяйство немыслимо без применения пестицидов. Однако даже широкое применение пестицидов не обеспечило полную защиту сельскохозяйственных культур, так как многие болезни и сорняки продолжают развиваться. Кроме этого, вредители постепенно вырабатывают устойчивость, или резистентность, к определенным инсектицидам и фунгицидам. Например, быстро размножающиеся насекомые становятся устойчивыми к инсектицидам за короткое время. Привыкание ведет к необходимости применения более высоких доз для эффективности обработки, что влечет нежелательные последствия.

Актуальная задача - поиск и применение взамен химическим препаратам биологической альтернативы для уничтожения вредителей. Применение биологических агентов для уничтожения вредителей известно давно (например, использование. муравьев для уничтожения вредителей в зернохранилищах, насекомоядных птиц для уничтожения красной саранчи, домашних кошек -“первого биологического средства” - для борьбы с крысами и др.). “Классическая” форма биологической борьбы с вредителями определяется как введение специфического самовоспроизводящегося и способного искать хозяина паразита или хищника из экзотического источника, который будет дополнять окружающую флору и фауну и таким образом поддерживать вид-вредитель на субэкономическом уровне. Существует такое понятие, как “усиленный биологический контроль”. Это селективное использование, введение или поддержание биологических агентов для подавления вредителей (в Великобритании, например, в питомниках по выращиванию огурцов теперь пользуются фактически только биологическими средствами защиты от вредителей).

Биологические средства защиты имеют перспективность, так как производство и использование химических препаратов, обладающих высокой устойчивостью и токсичностью, будут ограничиваться; во-вторых, уже в настоящее время существенно расширились возможности биотехнологии: клеточная, генная и белковая инженерия, производство бактериальных токсинов, рост знаний в области экологии вирусов и бактерий и др. Это непременно приведет к разработке и широкому применению биопестицидов.

ГИГИЕНИЧЕСКАЯ РЕГЛАМЕНТАЦИЯ И

СТАНДАРТИЗАЦИЯ

Гигиеническое регламентирование неблагоприятных производственных факторов появилось в связи с увеличивающейся опасностью их вредного действия, обусловленной развитием промышленности и расширением химического производства. Регламентация содержания вредных веществ в воздушной среде рабочей зоны составляет лишь часть нормативов, обеспечивающих санитарную охрану всей окружающей человека среды: рабочей зоны, атмосферы населенных мест, воды водоемов, почвы, пищевых продуктов и т.д.

Начало гигиенической регламентации профессиональных ядов в СССР в воздушной среде производственных помещений было положено 10 апреля 1922 г., когда были утверждены первые «Правила о мерах безопасности работ в производстве хромовых солей». С развитием химической промышленности для защиты здоровья работающих возникла потребность в теоретической и экспериментальной разработке понятия предельно допустимой концентрации химических веществ. В 1924 г. появляется первая экспериментальная работа по обоснованию допустимого содержания бензола, а затем были разработаны методы регламентирования пыли. В 1930 г. появился термин ПДК и в эти же годы было установлено ПДК для 25 веществ. В 1939 г. Н.В.Лазарев заложил теоретическую и экспериментальную базу гигиенической регламентации, создав «Основы промышленной токсикологии», где впервые высказал важное предположение о существовании порога хронического действия. Затем в 1957 г. были предложены ПДК для некоторых пестицидов, применяемых в сельском хозяйстве. Такова вкратце история развития гигиенической регламентации.

Задачи гигиенического регламентирования веществ в воздухе рабочей зоны вытекают из определения ПДК рабочей зоны. Это такие концентрации, которые при ежедневной работе в пределах 8 часов в течение всего рабочего стажа не могут вызвать у работающих заболеваний или отклонений в состоянии здоровья, обнаруживаемых современными методами исследования, непосредственно в процессе работы или в отдаленные сроки.

Рабочей зоной считается пространство высотой до 2 м над уровнем пола, на котором находятся рабочие места постоянного или временного пребывания работающих.

Величина ПДК может корректироваться при получении новых данных о токсичности уже регламентированного вредного вещества. Например, ПДК бензола менялось 4 раза с 200 мг/м³ 1940-1947 гг. до 5 мг/м³ в 1971 г., ПДК анилина тоже 4 раза с 10 мг/м³ в 1930 г. до 0,01 мг/м³ в 1973 г.

ПДК является основой для проектирования производственных помещений, юридической основой санитарного надзора. Одной из главнейших задач токсикологии в любом ее направлении является возможно более точное установление ПДК.

Значение экспериментальных исследований

для определения ПДК

В начале развития гигиенической регламентации при установлении ПДК вредных веществ в воздухе производственных помещений ученым казалось, что эту проблему легко будет разрешить путем проведения экспериментов на людях и на животных. Но вскоре от этой мысли отказались, т.к., во-первых, нельзя изучать даже на добровольцах действие мало изученных ядов, а, во-вторых, даже при проведении тщательных хронических опытов на животных нельзя вывести ПДК, т.к. в каждом частном случае для каждого яда соотношение в чувствительности человека и лабораторных животных будет неодинаковым. В настоящее время на людях-добровольцах производится определение только порогов однократного раздражающего действия и порогов запаха.

Для гигиенической регламентации содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны требуется знать сравнительную токсичность веществ для человека и лабораторных животных, причем не в дозах, а в концентрациях, т.к. ингаляционный путь поступления наиболее реален в рабочей зоне. Иначе говоря, необходимо исследовать в эксперименте хроническое действие промышленных ядов на нескольких видах животных. При экспериментальном подходе к определению ПДК необходимы хронические испытания и потом расчеты для перехода от результатов хронических опытов к определению величины ПДК. Хронические опыты, как правило, проводятся в течение 4-х месяцев. Эти месяцы для работы с разными ядами могут попасть на 4 разных времени года. Однако это уже может дать дополнительную вариабельность результатов. Поэтому для экспериментаторов существует общее правило: ставить сравниваемые серии опытов при прочих равных условиях. Если это невозможно, то нужно проводить опыт с известным в токсикологическом отношении веществом параллельно с экспериментами, ставящимися для выяснения токсичности другого вещества.

Методы установления ПДК вредных веществ

в воздухе рабочей зоны

Организация токсикологических исследований включает в себя предварительную токсикологическую оценку, полную токсикологическую оценку и клинико-статистический метод или натурные исследования влияния нового химического соединения на работающих.

Предварительная токсикологическая оценка. Предварительная токсикологическая оценка вещества начинается во время разработки проектного задания или технологического проекта еще до разработки рабочих чертежей. Совместными усилиями токсикологов и химиков (чаще всего по заданию предприятия-заказчика) производится рассмотрение теоретических схем синтеза вещества, изучение кинетики соответствующих реакций, а также литературных сведений о токсичности и опасности исходных и промежуточных продуктов. На основании физико-химических свойств, а также структурной химической формулы изучаемых новых веществ вычисляются токсикологические показатели и ориентировочные предельно допустимые концентрации. Возможно ориентировочное регламентирование и по аналогии с близким по химическому строению веществом путем экстраполяции и интерполяции в рядах одного класса соединений. Более надежные результаты расчетов ориентировочных ПДК для воздуха рабочих помещений могут быть получены на основании экспериментального определения смертельной концентрации и дозы на мелких животных. Ориентировочные рассчитанные ПДК доводят до сведения районного центра гигиены и эпидемиологии, где ими временно пользуются для оценки и контроля за работой лабораторных и полузаводских установок, когда воздействию нового малоизученного вещества подвергаются не более 100 работающих. Кроме контроля за составом воздушной среды опытных производств, центр гигиены и эпидемиологии проводит обязательные периодические осмотры работающих (еще до включения производства в обязательный список).

Предварительная токсикологическая оценка дает не только ориентировочную величину ПДК, но и понятие об общем характере действия вещества (наркотическом, раздражающем, гемолитическом и т.п.), указывает на возможность кожно-резорбтивного влияния, степень опасности острого отравления при аварийных ситуациях, предположения о наличии специфического действия. На основании указанных сведений появляется возможность прогнозировать ориентировочную величину смертельных доз (концентраций) яда, а также ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ).

Результаты предварительной токсикологической оценки вещества содержат следующие количественные характеристики: сведения о физико-химических свойствах (насыщающей концентрации – С₂₀, коэффициентах распределения вода-воздух - l и масло-вода – К), о среднесмертельных дозах (DL₅₀) и концентрациях (CL₅₀), об отношении CL₅₀ / C₂₀ (которое дает некоторое представление о реальной опасности острого отравления) и практические рекомендации. Практические выводы способствуют выбору оптимальной (с точки зрения экономики и профилактической медицины) технологии и средств промышленной санитарии (организация и расчет вентиляции, внутренняя отделка помещения, расположение и исполнение технологического оборудования), а также выбору наименее токсичного вещества из ряда эквивалентных с технологических позиций. Так, например, в случае производства и-кислоты с самого начала было возможно направить синтез в обход канцерогенного b-нафтиламина путем сульфирования, амино-тобиас-кислоты, минуя последующие перестройки технологического процесса.

Опыт показывает, что тесное сотрудничество токсикологов, химиков и технологов на первом этапе разработки проекта приносит значительные технико-экономические и медико-профилактические выгоды.

Полная токсикологическая оценка вещества. Полная токсикологическая оценка вещества включает в себя острые и подострые опыты на животных, токсикологические испытания технологических образцов, хронические опыты на животных, изучение отдаленных последствий, обследование работающих на полузаводских или лабораторных установках. Детальные токсикологические исследования могут завершаться серией дополнительных исследований, в частности, изучением механизмов действия, разработкой приемов ранней и дифференциальной диагностики, а также разработкой методов лечебной профилактики и экспериментальной терапии.

Полная токсикологическая оценка нового вещества должна быть завершена до приема промышленного объекта в эксплуатацию, что вполне возможно, если учесть, что ориентировочный безопасный уровень воздействия этого вещества был известен проектным организациям к моменту разработки рабочих чертежей и учитывался в ходе проектирования.

Наиболее ответственными и трудоемкими являются хронические эксперименты на животных для обоснования ПДК. Длительные эксперименты проводят на нескольких видах животных (на мышах, крысах, кроликах) в течение 4-6 месяцев, подвергая их ежедневным (кроме выходных) затравкам длительностью не менее чем по 4 часа. Выбор концентраций для проведения хронического эксперимента определяется данными однократных и повторных подострых опытов.

Порог хронического воздействия получается при испытании не менее 2-3 концентраций, одна из которых окажется ближе к пороговой, чем другие. Он устанавливается по изменению показателей (отобранных после подострого эксперимента), которые включают в себя интегральные и непременно специфические тесты. Состояние организма подопытных животных оценивается по изменению функций на уровне целостного организма, отдельных органов и систем, на клеточном и субклеточном уровнях. Порогом вредного действия вещества считается такая минимальная его концентрация (доза), при воздействии которой возникают изменения, выходящие за пределы физиологических приспособительных реакций, или скрытая (временно компенсированная) патология.

Логические рассуждения при выборе пороговой концентрации базируются на оценке всех полученных в эксперименте сведений: скорости возникновения и фазности патологических изменений, характера специфических и интегральных тестов, степени функциональной кумуляции яда, видовой чувствительности животных, сроков и полноты восстановления всех функций органов животных.

Полученный порог хронического действия требует определения так называемого «коэффициента запаса» для перехода к ПДК. На коэффициент запаса делится экспериментально полученная в хроническом опыте пороговая концентрация. При этом учитывается: 1) степень кумуляции (коэффициент кумуляции), 2) абсолютная токсичность вещества, 3) его летучесть, 4) зоны острого и хронического действия, 5) видовые различия в токсичности. Коэффициент запаса увеличивается при выраженном кожно-резорбтивном действии. Наименьшие коэффициенты запаса чаще всего применяются для раздражающих веществ (2-4). Наиболее часто используемый коэффициент запаса равняется 10. Современное состояние вопроса о коэффициенте запаса при обосновании величин ПДК вредных веществ в объектах внешней среды изложено в работе И.В.Саноцкого и К.К.Сидорова (1975).

С целью увеличения чувствительности испытаний и укорочения хронического опыта широко применяются интегральные методы, функциональные пробы, постановка животных в неблагоприятные условия или использование их в периоды особенно напряженной жизнедеятельности (к числу их относятся: временная качественная или количественная недостаточность питания, в результате которой токсическое действие выявляется в затягивании восстановительного периода для веса подопытных особей по сравнению с контрольными: частое применение физических нагрузок; инфицирование животных; использование растущих животных или самок в периоде беременности и т.п.).

Предельно допустимая концентрация, установленная, главным образом, на основании экспериментальных данных, утверждается в законодательном порядке, но ввиду ее приблизительного характера не является вечной, она может изменяться в результате накапливания клинических данных, требующих ее снижения, или новых данных о токсичности близких соединений.

Клинико-статистический метод. Клинико-статистический метод (натурное исследование) осуществляется в течение первых трех лет работы новой технологической установки, но может продолжаться и далее для изучения отдаленных последствий воздействия вещества на работающих, в том числе и в комплексе с другими неблагоприятными факторами. Клинико-статистический метод не может заменить экспериментальный, но дополняет последний и дает возможность проверить утвержденную на основе эксперимента ПДК.

На этом третьем этапе исследования проводят углубленное гигиеническое обследование предприятия, включающее в себя изучение технологического процесса с вытекающими неблагоприятными факторами, работу санитарно-технических средств, производительность и эффективность вентиляционных установок, проверяют динамический анализ воздушной среды с регистрацией колебаний концентраций интересующего яда. Разработка учетно-статистических сведений о заболеваемости с временной утратой трудоспособности и анализ полученных данных при периодических медицинских осмотрах, сопоставленные с фактическими концентрациями в цехе, являются основным материалом, на котором базируется оценка действующих ПДК. Все исследования в целом вносят необходимые коррективы в санитарные нормативы, позволяют уточнить медико-технические требования к организации процесса , к планировке и внутренней отделке помещений, санитарно-техническим устройствам, выбору индивидуальных средств защиты.