Фіксовані препарати мікроорганізмів

У мікробіології часто готують фіксовані препарати. Їх розглядають під мікроскопом в забарвленому вигляді. Під фіксацією мається на увазі така обробка живого об'єкту, яка дає можливість швидко перервати перебіг життєвих процесів в об'єкті, зберігши його тонку структуру. В результаті фіксації клітини міцно прикріпляються до скла і краще фарбуються. Фіксація необхідна і в разі роботи з патогенними мікроорганізмами (в цілях безпеки).

Приготування фіксованих препаратів включає наступні етапи: приготування мазка, висушування, фіксацію і забарвлення.

1. Приготування мазка.

На чисте знежирене предметне скло наносять краплю водогінної води. Прожареною бактеріологічною голкою з пробірки з культурою беруть невелику кількість мікробної маси і вносять до краплі води. Краплю ретельно розмазують петлею по склу на площі 2 – 4 см². У випадку, якщо суспензія густа, її спочатку розводять водою. Для цього прожареною петлею беруть трохи суспензії і переносять в краплю води на інше предметне скло. Суспензію нормальної густини розмазують тонким шаром по склу.

2. Висушування мазка. Мазок сушать на повітрі при кімнатній температурі, правильно приготований тонкий мазок сохне достатньо швидко. Якщо висушування мазка сповільнено, то препарат можна злегка нагрівати в струмені теплого повітря, тримаючи його високо над полум'ям пальника. Сильне нагрівання препарату при сушці не рекомендується, оскільки при цьому можлива коагуляція білків, що спотворює структуру і форму клітин.

3. Фіксація мазка. Висушений препарат фіксують. Фіксацію мазка проводять над полум'ям пальника при дослідженні форми клітин або за допомогою хімічних сполук для вивчення внутрішньої структури клітин. У першому випадку препарат три – чотири рази повільно проводять нижньою стороною над полум'ям пальника. Одін з поширених прийомів фіксації за допомогою хімічних сполук — обробка препарату 96%-ним спиртом або сумішшю рівних об'ємів етилового спирту і ефіру (рідина Никіфорова).

4. Забарвлення препарату. При забарвленні мазка препарат поміщають на препаратотримач. На мазок наносять декілька крапель барвника. Залежно від виду барвника і мети дослідження тривалість забарвлення варіює від 1 до 5 мін, в окремих випадках займаючи до 30 мін і більш. Після закінчення забарвлення препарат промивають водою, фільтрувальним папером видаляють воду, підсушують на повітрі і микроскопують.

2. ДОСЛІДЖЕННЯ МОРФОЛОГІЇ МІКРООРГАНІЗМІВ.

Бактерії. Під спільним поняттям «бактерії» описано понад 1600 видів мікроор­ганизмів-прокаріот, що не мають справжнього складноорганізованого ядра. Біль­шість представників бактерій — одноклітинні організми, що розрізняються розмірами і фізіологічними властивостями.

За формою всі бактерії можна розділити на кулясті (або коки), паличкоподібні, звиті та нитчасті (см. рис. 8).

Рис. 8. Форма бактерій: куляста: а – мікрококи, б диплококи, в тетракоки, , г– стрептококи; паличкопо­дібна: д – палички, які не утворюють спори, е, ж, з – палички, які утворюють спори: е – бацилярний, ж – клостридіальний, з –плектридіальний типи спороутворення; звита: и – вібріони, д – сарцина.

Кулясті бактерії— коки. Вони діляться на такі групи:

1. Мікрококи. У природі зустрічаються у вигляді одиночних кулястих клітин. Прикладом можуть служити клітки Micrococcus agilis.

2. Діплококи (від греч. diploos — подвійний) — кулясті бактерії, сполучені по двоє. До них відноситься Azotobacter chroococcum. Родова назва цих бактерій відображає їх здатність фіксувати азот атмосфери, видове — продукувати коричневий пігмент (від латів. chroo — коричневий).

3. Стрептококи (від греч. streptos — ланцюг) — кулясті бактерії, які створюють в результаті поділу клітин в одній площині ланцюжки різноманітної довжини. До роду стрептококів відносяться в основному патогенні бактерії. Але стрептококову форму мають багато молочнокислих бактерій, наприклад, Lactococcus . lactis. Родова і видова назви цих бактерій відображають їх причетність до молочнокислого бродіння (від латів. lactis — молочний).

4. Сарцини (від латів. sarceo — сполучаю) — кулясті бактерії, що групуються по 8 кліток. Розташовуються у вигляді куба, з кожного боку якого по 4 клітини. Така форма виникає в результаті поділу клітини в трьох взаємно перпендикулярних плоскощинах. Деякі види сарцин формують великі кубоподібні пакети, в яких з кожного боку знаходиться вже не по 4 клітини, а по 4 сарцини. Sarcina Java (сарцина жовта) — найбільш поширений представник мікрофлори повітря.

Паличкоподібні бактерії. До них відносять форми, які утворюють спори (роди Bacillus, Clostrtdium та ін.) і не утворюють їх (роди Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillus і ін.). Спори – це товстостінні довгоіснуючі утворення, які відрізняють­ся дуже високою стійкістю до нагрівання, опромінювання та висушування. Локалі­зація спор в клітині буває різною та є важливоюознакою для ідентифікації бактерій ( рис. 8).

Нитчасті форми. Це ланцюжки циліндрових клітин, часто оточені спільним чохлом. Нитчасті бактерії поширені в ілах, грунті та водоймищах, особливо з високим вмістом заліза. У водоймищах ці бактерії часто утворюють охристі осідання.

Звиті форми. Серед бактерій даної групи виделют наступні форми.

1. Вібріони (від лат. vibrare – звиватися, тремтіти) – злегка зігнуті клітини: вигин їх менше половини кола.

2. Спірили (від лат. spiro – штопор). На відміну від вібріонів їх клітки довші, товщі та звиті: звитість або рівна, або більше половини кола. Спірили можуть мати один завиток у вигляді російської букви З, два завитки у вигляді латинської букви S або декілька — у вигляді спіралі.

3. Спірохети — довгі і тонкі клітини з великою кількістю дрібних та крутих завитків; довжина клітин перевищує їх товщину в 5 – 200 разів.

Гриби. Об'єктами мікробіології служать багато видів мікроскопічних грибів. Грибів відносять до еукаріот. Тіло гриба складається з міцелія, або грибниці, — сплетення тонких ниток – гіф.

Зигоміцети. Нижчі гриби, мають добре розвинений гіллястий одноклітинний міцелій. Розмножуються як статевим шляхом, так і безстатевим, тобто за допомогою спор. Представник класу – мукор (Mucor mucedo) розвивається у вигляді білого або сірого нальоту на продуктах рослинного походження і гної травоїдних тварин. Міцелій мукорових грибів пронизує субстрат і частково стелеться по його поверхні.

Рис. 9. Гриби мікроскопічні:

а — Mucor, б — Aspergillus; в — Penicillium; г — Fusarium, д — Trichoderma; е — Alternarta

Аскоміцети, або сумчасті гриби. Вищі гриби з багатоклітинним або членистим міцелієм, які утворюють спори в сумках, – асках. Вони включають представників еуаскоміцетів (дійсних аскомицетів), у яких сумки із спорами формуються в результаті статевого процесу на поверхні або усередовищані плодових тіл, що утворюються сплетенням гіф міцелія (можливе безстатеве розмноження екзогенними виникаючими спорами – конідіями), і геміаскоміцетів, у яких плодові тіла відсутні. До геміаскоміцетів відносять більшість дріжджів, що розглядаються як окрема група грибів.

Еуаскоміцети включають два найважливіші роди грунтових, грибів — Penicillium і Aspergilius, яких нерідко називають також цвілевими грибами. До групи цвілевих відносять і деяких представників зигомицетов і недосконалих грибів. Пеніцилли і аспергилли мають добре розвинений багатоклітинний міцелій. Розмножуються переважно конідіальним спороутворенням. Спостерігаються у вигляді нальоту блакитного, зеленого, сизого, рідше інших кольорів на продуктах рослинного походження (варенні, томатній пасті, лимонах і апельсинах), виробах зі шкіри, шпалерах. Поширені у верхніх горизонтах грунту.

Дейтероміцети, або недосконалі гриби. Мають багатоклітинний міцелій, але у них немає статевого процесу і досконалої стадії спороутворення. Розмножуються безстатевим шляхом за допомогою конідій або вегетативно ділянками гіфов. У природі широко поширені представники родів Fusarium, Trichoderma, Alternaria, яких формально відносять до дейтеромицетів. Зустрічаються вони на рослинних залишках, плодах, насінні і в грунті. Серед грибів роду Fusarium є сапротрофи, що живуть в грунті і на рослинних залишках, і паразити, що викликають захворювання багатьох видів рослин (в'янення, гнилизни коріння, стебел, плодів, хвороби насіння, різні пігментації органів рослин).

Дріжджі. За сучасними уявленнями, дріжджі – це збірна група одноклітинних мікроскопічних організмів, що відносяться до різних класів грибів, переважно – до класу аскоміцетів. Діаметр клітин дріжджів коливається від 8 до 15 мкм. Форма їх різноманітна: еліпсовидна, грушовидна, округла, циліндрова. Розмножуються дріжджі вегетативним і статевим шляхом. Вегетативні способи розмноження – брунькування і ділення; статевий спосіб розмноження пов'язаний з утворенням спор.

При статевому процесі у дріжджів злиття вегетативних клітин веде до утворення сумок із спорами. Серед дріжджів є аспорогенні дріжджі, не здібні до статевого процесу та спороутворення. Вони відносяться до класу недосконалих грибів.

До дріжджів, що брунькуються, відносяться представники «культурних» дріжд­жів роду Sacchammyces (сахароміцети), до тих, що діляться – види роду Schizosacchammyces (шизосахароміцети).

Рис. 10. Дріжджі: а — що брунькуються; б — що діляться

 

Saccharomyces cerevisiae мають різноманітну форму. Розмножуються вони брунькуванням (вегетативний спосіб розмноження) і аскоспорами. При брунькуванні на материнській клітині виникає маленька опуклість – почка– дочірня клітина, в яку переходить одне ядро. Клітина збільшується в розмірах і відділяється. Якщо умови для такого розмноження сприятливі (достатня кількість цукру, відповідна температура, аерація), процес йде дуже швидко. У деяких представників роду клітини після брунькування не встигають відокремлюватися, і виникає псевдоміцелій.

 

► ХІД РОБОТИ: ◄

1. Ознайомитися з устроєм мікроскопа і правилами роботи з ним.

2. Приготувати препарати роздавлена крапля запропонованих культур мікроорганізмів.

3. Приготувати фіксовані препарати запропонованих культур мікроорганізмів.

4. Мікроськопіровать препарати з об'єктивом 40х і з імерсійним об'єктивом.

5. Замалювати результати спостережень.

 

► КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ: ◄

1. Устрій оптичної частини мікроскопа.

2. Основні технічні характеристики мікроскопа.

3. Порядок роботи з мікроскопом.

4. Особливості імерсійного об'єктиву мікроскопа і правила роботи з ним.

5. Приготування препарату «роздавлена крапля» живої культури мікроорганізмів.

6. Приготування фіксованого препарату мікроорганізмів.

7. Основні групи кулястих бактерій.

8. Основні групи паличкоподібних бактерій.

9. Будова тіла грибів.

10. Особливості мікроорганізмів, що відносяться до групи дріжджів.

 

 

Лабораторна робота № 3.