ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

У лабораторних умовах мікроорганізми культивують на поживномусередовищі, яке повинно містити всі речовини, необхідні для їх зростання і розвитку. Запропоновані сотні різниї середовищ для культивування мікроорганізмів, склад яких визначається потребами мікроорганізмів в сполуках, необхідних для біосинтезу і отримання енергії. Конструктивні і енергетичні процеси у мікроорганізмів дуже різноманітні, тому настільки ж різноманітні їх потреби в поживних речовинах. З цього виходить, що універсального середовища, однаково придатної для зростання всіх без винятку мікроорганізмів, не існує.

Основними компонентами будь-якого поживного середовища для культивування мікроорганізмів є вуглець- і азот-вмісні сполуки. І саме ці сполуки визначають специфічність переважної більшості поживних середовищ. За потребами у вуглеці мікроорганізми прийнято ділити на дві великі групи — автотрофи і гетеротрофи. Автотрофні мікроорганізми здатні як єдине джерело вуглецю використовувати вуглекислоту – сполуку, що містить вуглець в найбільш окисленій формі. Відповідно до цього при культивуванні автотрофів необхідно забезпечити клітки вуглекислотою, оскільки концентрація вуглекислоти в повітрі не перевищує 0,03% і її надходження в середовище за рахунок дифузії недостатньо для інтенсивного зростання мікроорганізмів. Тому в середовище для культивування автотрофів вносять бікарбонат натрію (NaНСО₃) або карбонати, найчастіше вуглекислий кальцій (СаСО₃). В деяких випадках через середовище продувають повітря, збагачене 1 – 5 % вуглекислоти.

Для розвитку гетеротрофних мікроорганізмів середовище повинна містити органічні сполуки. Залежно від індивідуальних особливостей мікроорганізми-гетеротрофи здатні використовувати різні сполуки вуглецю — кислоти, спирти, вуглеводи, вуглеводні, ароматичні сполуки. При цьому потреби деяких мікроорганізмів, наприклад бактерій з сімейства Pseudomonadaceae, можуть бути задоволені широким набором різних органічних речовин, тоді як для інших мікроорганізмів притаманна висока спеціалізація та здатність використовувати лише вибрані сполуки вуглецю. Так, деякі метанокиснюючи бактерії використовують тільки метан і метанол.

Другим основним компонентом поживного середовища є джерело азоту. Азот входить до складу органічних речовин клітини головним чином у відновленій формі — у вигляді аміно ( –NH₂) або имино ( –NH)-груп, проте потреби мікроорганізмів в дже­релі азоту можуть бути задоволені різними азотвмісними сполуками, в яких азот має різний ступінь відновлення. Для дуже багатьох мікроорганізмів це можуть бути солі амонія. В цьому випадку до середовища вносять NH₄Cl або (NH₄)₂SO₄. Слідує, проте, пам'ятати, що амонійні солі — фізіологічно кислі солі, оскільки у міру використання іона амонія в середовищі накопичується аніон відповідної кислоти, що приводить до помітного зростання кислотності середовища і може негативно вплинути на розвиток мікроорганізмів. Потреби значного числа мікроорганізмів в азоті можуть бути задоволені нітратами. Живильна середовище для культивування таких мікроорганізмів містить KNO₃. або NaNO₃. На відміну від солей амонія нітрати — фізіологічно лужні солі, оскільки при використанні аніона NO₃^– в середовищі накопичуються катіони К⁺ або Na⁺. Нітрити в кислих умовах для багатьох мікроорганізмів токсичні, тому як джерело азоту майже не використовуються.

Поживне середовище для культивування деяких мікроорганізмів повинна включати одну, декілька або повний набір амінокислот. Окремі амінокислоти в L- або DL-формі додають до стерильного середовища в концентрації від 0,1 до 0,05 г на 100 мл безпосередньо перед засівом її мікроорганізмами. Для цього рекомендується використовувати розчини амінокислот, в яких концентрація перевищує вміст амінокислоти в середовищі в 100 разів. Гліцин, аланін, пролін, лізин і орнітин розчиняють у дистильо­ваній воді, фенілаланін і тріптофан – у воді, підлуженій NaOH, решта амінокислот — у воді, яка підкислена НСl. Амінокислоти – цистин і цистеїн, а також аміди – глутамін і аспарагін, нестійкі до нагрівання, тому їх стерилізують фільтруванням. Решту аміно­кислот можна стерилізувати при 0,5 атм протягом 15 хв.

Потреби мікроорганізмів в деяких амінокислотах часто задовольняють, додаючи до середовища гідролізат білка. Для отримання гідролізату використовують білки тваринного (м'ясо, рибу, желатину, казеїн) або рослинного (насіння сої, соняшнику) походження, а також клітини мікроорганізмів (дріжджі, водорості, бактерії). Гідроліз проводять за допомогою протеолітичних ферментів або кип'ятінням з мінеральними кислотами або з лугами. Склад гідролізату неоднаковий і залежить від вихідного субстрата, а також способу гідролізу.

Найбільш вимогливі мікроорганізми культивують на поживному середовищі, що містить білки або продукти їх неповного розщеплювання – пептони, що є суміш–шю поли і олігопептидів, амінокислот, органічних азотних основ, солей і мікроелементів. Пептони отримують в результаті дії протеолітичних ферментів на білки тваринного (м'язовий білок, казеїн) або рослинного (білок соєвої муки) походження. Пептон – це гігроскопічний порошок світло-жовтого кольору, розчинний у воді; 1%-ний| розчин пептону має нейтральну або слабокислу реакцію. У поживне середовища пептон додають від 1 – 2 до 20 г на 1 л. Необхідно мати на увазі, що амінокислоти і пептон мікроорганізми можуть використовувати не лише, як джерело азоту, але і як джерело вуглецю і енергії.

Деякі бактерії здатні використовувати як єдине джерело азоту молекулярний азот N₂. Це азотфиксатори. У середовище для культивування таких мікроорганізмів сполук азоту можна не вносити. Постачання азотфиксаторів газоподібним азотом здійснюється завдяки контакту середовища з повітрям або культивуванню в атмосфері азоту.

Багато мікроорганізмів вимагають наявність в середовищі так званих факторів зростання, до яких відносяться вітаміни, пурини, пиримидини і амінокислоти. Щоб підкреслити потребу мікроорганізмів в чинниках зростання, прийнято використовувати термін «прототрофи» і «ауксотрофи». Прототрофи не потребують чинників зростання, для ауксотрофів абсолютно необхідна наявність в середовищі одного або декількох чинників зростання. Якщо потреби мікроорганізмів в чинниках зростання обмежені одним або декількома вітамінами, то рекомендується вносити їх до культурального середовища, використовуючи наступні концентрації: тіамін (вітамін B₁), пантотенат Са, рибофлавін (вітамін В₂), нікотинова кислота (ніацин), піридоксин, піридоксамін, холін, кобаламін (вітамін B₁₂) — по 1 мкг на 1 мл середовища; фолиєва кислота і п-амінобензойна кислота — по 0,05 мкг на 1 мл середовища; біотин – 0,005 мкг на 1 мл середовища. Вітаміни додають до стерильного середовища безпосередньо перед її засівом. Для цього рекомендується використовувати розчини, в яких концентрація вітаміну перевищує його вміст в поживному середовищі в 100 разів. Розчини готують в стерильному посуді і використовують стерильну дистильовану воду. Отримані розчини стерилізують прогріванням в киплячій водяній лазні 3 хв. Розчин тіаміну рекомендується стерилізувати фільтруванням, оскільки при нагріванні тіамін руйнується.

Прикладами сумішей, що містять різні фактори зросту, можуть служити дріжджовий екстракт, дріжджовий автолізат, кукурудзяний екстракт. Дріжджовий екстракт вносять в середовище для культивування від 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дріжджовий автолізат — в такій кількості, щоб концентрація амінного азоту складала 5 – 30 мг на 100 мл середовища. Дріжджовий автолізат готують таким чином: 40 г свіжих пресованих або 10 г сухих дріжджів заливають водою і перемішують до отримання гомогенної маси, потім додають декілька кристалів тимолу або 1 – 2 мл хлороформу і витримують в термостаті при 50 – 55˚С 3 діб. За цей час клітини дріжджів відмирають, а ферменти залишаються активними і гідролізують білки, а також інші біополімери. Через 3 діб отриманий автолізат після ретельного перемішування кип'ятять на слабком у вогні 20 хв і фільтрують. Дріжджовий автолізат стерилізують при 0,5 атм 15 хв і зберігають в холодильнику. Кукурудзяний екстракт – готовий продукт заводів крахмалопаточной промисловості. Він містить амінокислоти, вітаміни, велику кількість органічних кислот (молочною, оцетову і мурашину) і мінеральні солі. Кукурудзяний екстракт вносять до середовища від 0,2 до 5 %, стерилізують при 0,5 атм.

Окрім джерел вуглецю, азоту і факторів зростання мікроорганізмам для побудови речовин клітини необхідні сірка, фосфор і ін. елементи. Всі вони повинні міститися в поживному середовищі в доступній для мікроорганізмів формі. Потреби різних груп мікроорганізмів в сірці, фосфорі і ін. зольних елементах задовольняються зазвичай за рахунок мінеральних солей. Тому «мінеральний фон» середовища для культивування багатьох мікроорганізмів може бути близьким за складом. Так, потреби значного числа мікроорганізмів в сірці задовольняються сульфатами, хоча в клітині сірка знаходиться в основному у відновленій формі, у вигляді сульфгідрильних груп. Значно рідше зустрічаються мікроорганізми, що вимагають наявність в середовищі відновленої сірки. В цьому випадку в середовище вносять сульфіди, частіше всього Na₂S, або органічні сполуки, що містять сульфгідрильні групи, наприклад цистеїн.

Солі фосфорної кислоти задовольняють потреби мікроорганізмів у фосфорі. Всі необхідні метали – К, Na, Са, Mg, Fe, Mn, Со, Cu – і інші елементи мікроорганізми отримують у формі катіонів або аніонів неорганічних солей. Наприклад, джерелом магнію служить MgSO_4, джерелом натрію і хлора — NaCl, кальцію — CaCO₃ або СаСl_2. Залізо додають до середовища у вигляді хлориду, сульфату або цитрату.

Щоб уникнути випадання осаду внаслідок утворення нерозчинних комплексів фосфатів з деякими катіонами, особливо із залізом і кальцієм, до середовища рекомендується додавати від 0,001 до 1 г/л етилендиамінтетраацетату (ЕДТА) або гексаметафосфату натрію в концентрації 4 г/л. Комплекси, які утворюють ці сполуки з катіонами, служать резервом, із якого в результаті дисоціації в розчин надходять вільні катіони.

Калій, магній, кальцій і залізо потрібні у відносно великих кількостях, тому їх солі, як правило, включають до складу живильного середовища. Потреби мікроорганізмів у марганці, молібдені, цинку, міді, кобальті дуже малі. Ці елементи, часто звані мікроеле­ментами, вносять до середовища від 1 мг до 1 мкг на 1 л; вищі концентрації можуть бути токсичні. Поживні середовища з пептоном, грунтовою витяжкою, дріжджовим екстрактом, гідролізатом казеїну містять необхідні мікроелементи, до складу синтетичного середовища, яке готується на дистильованій воді, їх слід вносити. Про оптимальні концентрації мікроелементів для різних мікроорганізмів відомо мало, тому запропо­новані різні по складу суміші мікроелементів. Розчини мікроелементів рекомендується стерилізувати окремо і вносити до середовища безпосередньо перед її засівом.

Поживне середовище для культивування мікроорганізмів крім сполук, необхідних для процесів біосинтезу, повинні включати і енергетичний матеріал. За способом отримання енергії всі мікроорганізми прийнято ділити на дві основні групи: хемотрофи і фототрофи. Хемотрофи використовують енергію окислення різних сполук. Залежно від окислюваного субстрата (донора водню) серед хемотрофних організмів виділяють хемолитотрофи і хемоорганотрофи. Перші окислюють неорганічні сполуки, для других енерегетичним субстратом служать органічні речовини, які зазвичай грають двояку роль – вони є одночасно і джерелом вуглецю і джерелом енергії Проте є мікроорганізми, які для конструктивних і енергетичних проце­сів потребують різних сполук. Наприклад, гомоферментативні молочнокислі бактерії одержують енергію при зброджуванні вуглеводів, але майже не використовують їх в процесах біосинтезу. Для конструктивних цілей їм необхідні готові амінокислоти, пуринові та пиримідинові основи, вітаміни. Фототрофи використовують енергію світла. Щоб задовольнити потреби цих бактерій в енергії, їх культивують при природному або штучному освітленні.

За складом прийнято виділяти природні, або натуральні, середовища та синте­тичні середовища. Натуральними називають середовища, до складу якої входять продукти тваринного або рослинного походження. До такого середовища відносяться овочеві або фруктові соки, тваринні тканини, розведена кров, молоко, води морів, озер і мінеральних джерел, відвари або екстракти, отримані з природних субстратів, таких як м'ясо, грунт, гній, різні частини рослин, клітини мікро­організмів. На натуральному середовищі добре ростуть багато мікроорганізмів, оскільки таку середовище містять всі компоненти, необхідні для зростання і розвитку. Проте ці середовища мають складний, непостійний хімічний склад і мало придатні для вивчення обміну речовин мікроорганізмів, оскільки в них важко врахувати споживання компонентів і утворення продуктів метаболізму. Натуральні середови­ща використовуються головним чином для підтримки культур мікроорганізмів, накопичення біомаси і для діагностичних цілей. До натуральних середовищ, широко вживаних в лабораторній практиці, відносяться м’ясо-пептонний бульйон, пивне сусло, дріжджове і картопляне середовище, грунтовий екстракт.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Основою для його приготування служить м'ясна вода, яку готують наступним чином: 500 г м'яса, звільненого від кісток, жиру і сухожиль, дрібно нарізують або пропускають через м'ясорубку, заливають 1 л водогінної води і залишають при кімнатній температурі на 12 г або в термостаті при 30˚С на 6 г, а при 37˚С – на 2 г. За цей час з м'яса екстрагуються різні речовини, у тому числі водорозчинні вітаміни. Потім м'ясо віджимають через марлю, а отриманий настій кип'ятять 30 хв. При цьому згортаються білки. Захололу масу фільтрують через ватяний фільтр і доливають водою до первинного об'єму. До м'ясної води додають 1% пептону і 0,5% NaCl. МПБ – багате поживне середовище, але воне майже не містить вуглеводів. У разі потреби їх додають до МПБ частіше всього в кількості 1 – 2 г на 100 мл МПБ.

Для отримання накопичувальних культур мікроорганізмів різних таксономічних груп як універсальне поживне середовище може бути використаний гідролізат риб­ної муки (ГРМ-бульон).Він є гігроскопічним мелкодисперсним порошком світло-жовтого кольору.

Солодове (пивне неохмілене) сусло– хороше середовище для деяких молочно­кислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, міцеліальних грибів і інших пред­ставників гетеротрофних мікроорганізмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи (до 90% від маси сухого залишку) і азотвмісні сполуки (до 6 – 7% від маси сухого залишку). З вуглеводів в найбільшій кількості містяться мальтоза і декстрин. До складу сусла входять вітаміни, переважно групи В, органічні кислоти і мінеральні солі. Сусло готують таким чином, 250 г розмолотого солоду заливають 1 л водогінної води, нагрівають до 48–50˚С і утримують цю температуру протягом півгодини, безперервно помішуючи суміш, щоб уникнути утворення грудок. У подальші півгодини температуру піднімають до 55 – 58˚С і підтримують на цьому рівні до повного зцукрення крохмалю, тобто до тих пір, поки реакція захололої су­міші з йодом буде негативною. При вказаному режимі відбувається також гідролиз білків до амінокислот і пептидів. Отриманий екстракт фільтрують. У фільтраті ви­значають концентрацію цукру. До потрібної концентрації сусло доводять водою. Для культивування мікроскопічних грибів найчастіше використовують 3–4% сусло, для дріжджів — 6–8 %, а для найбільш вимогливих молочнокислих бактерій — 8–12% сусло.

Дріжджове середовищевикористовується для культивування гетеротрофних мікроорганізмів. Основа дріжджової среди— дріжджова вода. Для її приготування 70–100 г свіжих пресованих або 7–10 г сухих дріжджів кип'ятять в 1 л води і після осадження кліток дріжджів рідину декантують або фільтрують через вату. До фільтрату додають 1 л води, ще раз 30 мін кип'ятять і знов фільтрують. До 100 мл отриманої дріжджової води додають 1–2 г вуглеводів і мінеральні солі, частіше всього К₂НРО₄ (0,1 г) і NaCl (0,5 г). Доводять рН середовища до 6,8 – 7,2.

Картопляне середовищевикористовується в основному для культивування спо­роутворюючих бактерій. Для приготування цього середовища 200 г ретельно вими­тої і очищеної картоплі нарізують дрібними скибочками, заливають 1 л водогінної води і кип'ятять 20–30 хв. Відвар фільтрують через вату, доводять об'єм фільтрату до 1 л і розливають в судини для культивування.

Грунтовий екстрактвикористовують головним чином для культивування різноманітних представників грунтових мікроорганізмів. Для його приготування 500 г родючого грунту заливають 1,5 л водогінної води і автоклавують при 1 атм 30 хв. Отриманий екстракт фільтрують через паперовий фільтр, додають до гарячого фільтрату 0,5 г СаСО₃, ретельно перемішують і через 5–7 хв фільтрують знов. До екстракту, як правило, додають 0,2 г К₂НРО₄.

Синтетичне середовище– це середовище, в яку входять лише сполуки певного хі­мічного складу, узяті в точно вказаних кількостях. Синтетичне середовище широко використовується при дослідженні обміну речовин, фізіології і біохімії мікроорганізмів. Для розробки складу синтетичного середовища, що забезпечує зростання мікроорганізмів або посилений біосинтез якого-небудь продукту життєдіяльності, необхідно знати особливості обміну речовин даного організму і потреби його в джерелах живлення. У розпорядженні мікробіологів є достатня кількість синтетичних середовищ. Синтетичне середовище може мати дуже великий набір компонентів, але можуть бути і досить простими по складу.

Разом з натуральним і синтетичним середовищем виділяють так зване напівсинтетичне середовище. Головними компонентами напівсинтетичного середовища є сполуки відомого хімічного складу — вуглеводи, солі амонія або нітрати, фосфати і так далі Проте в їх склад завжди включаються речовини невизначеного складу, такі як дріжджовий автолізат, грунтовий екстракт або гідролізат казеїну. Ці середовища знаходять широке застосування в промисловій мікробіології для отримання амінокислот, вітамінів, антибіотиків і інших важливих продуктів життєдіяльності мікроорганізмів.

Слід мати на увазі, що середовище, що забезпечує задовільний розвиток мікроорганізмів, не завжди підходить для вирішення інших дослідницьких, і практичних завдань, оскільки далеко не у всіх випадках накопичення якого-небудь продукту життєдіяльності – ферменту, вітаміну, антибіотика і так далі – йде паралельно накопиченню біомаси. Нерідко при рясному зростанні мікроорганізмів бажаний продукт метаболізму майже не утворюється або утворюється в недостатній кількості. Щоб забезпечити утворення необхідної сполуки в максимально можливих кількостях, застосовують спеціальне середовище.

Електівні середовищазабезпечують переважний розвиток одного виду або групи мікроорганізмів і менш придатні (або зовсім не придатні) для розвитку інших.

Диференціально-діагностичні (індикаторні) середовища дають можливість швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших або виявити деякі їх особливості. Прикладом індикаторного середовища для виявлення бактерій з групи кишкової палички в природних субстратах може служити агаризоване середовище Ендо наступного складу, г: пептон – 10; лактоза – 10; К₂НРО₄ – 3,5; NaHSO₃ – 2,5; агар – 150; вода дистильована – 1000 мл; рН 7,4. До середовища додається 4 мл 10%-ного спиртового розчину основного фуксину. Бактерії з роду Escherichia на цьому середовищі утворюють малинові колонії з металевим блиском. При визначенні видової приналежності бактерій використовують рН-індикаторні середовища, до складу яких входить один з індикаторів: нейтральний червоний (0,0005%), феноловий червоний (0,005%) або бромтимоловий синій (0,0005%). Якщо розвиток мікроорганізмів супроводжується утворенням кислоти або лугу, колір індикатора змінюється. Диференціально-діагностичні середовища особливо широко застосовуються в санітарній і медичній мікробіології для швидкої ідентифікації певних груп мікроорганізмів.

За фізичним станом розрізняють рідкі, сипкі та тверді середовища.

Рідкі середовищашироко застосовуються для накопичення біомаси або продуктів обміну, для дослідження фізіології і біохімії мікроорганізмів, а також для підтримки і збереження в колекції культур мікроорганізмів.

Сипкі середовищазастосовуються головним чином в промисловій мікробіології для культивування деяких продуцентів фізіологічно активних сполук, а також в колекціях для збереження культур мікроорганізмів. До таких середовищ відносяться, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцевий пісок, просочені поживним розчином.

Тверді середовищавикористовують для виділення чистих культур, в діагнос­тичних цілях, для визначення кількості мікроорганізмів, їх антибіотичної актив­ності, для зберігання культур в колекціях і у ряді інших випадків. Для приготування таких середовищ застосовують агар або желатину. Основою для загущення можуть служити пластинки силікагеля, які просочують живильною середою.

Агарвикористовують для загущення середовища найчастіше. Це складний полісахарид, до складу якого входять агароза і агаропектин. Крім того, агар включає невелику кількість асимільованих речовин і різні солі. Агар отримують з деяких морських водоростей і випускають у вигляді пластин, стеблинок або порошку. Агар зручний тим, що більшість мікроорганізмів не використовують його як субстрат для зростання. У воді він утворює гель, який плавиться примірно при 100˚С і твердне при температурі 40˚С. Тому на агаризованних середовищах можна культивувати значну частину відомих мікроорганізмів. Найчастіше агар додають до середовища в кількості 1,5%. Якщо необхідно отримати вологіше середовище, вносять 1,0%, а твердіше та сухіше – 2 – 3% агару. Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розтоплення. Якщо планують вирощувати мікроорганізми на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більше ніж на 1/3. Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з середовищем розташовують для застигання з нахилом (рис. 11). Скошене агаризоване середовище не повинно доходити до ватяної пробки на 4–6 см.

Рис. 11. Приготування скошеного агаризованого середовища.

Середовище, призначене для культивування бактерій в чашках Петрі, розливають по 20–25 мл в пробірки більшого об'єму, чим для скошеного агаризованого середовища, або стерилізують в колбах.

Агар має слаболужну реакцію, тому його додавання може привести до незначного підвищення рН середовища. У слабокислому, нейтральному або слаболужному середовищі агар зберігає здатність утворювати гель після декількох циклів плавлення і твердіння і навіть після повторної стерилізації. Проте необхідно пам'ятати, що при рН середовища нижче 5,5 агар при стерилізації частково гідролізується і тому втрачає здатність утворювати гель, тобто не застигає. В цьому випадку його стерилізують окремо від середовища в певному об'ємі води, розплавляють на водяній бані та доливають при постійному перемішуванні до стерильного, заздалегідь підігрітого середовища.

Желатина— це екстракт, який отримують з субстратів, багатих колагеном – кісток, хрящів, сухожиль. Утворюваний желатиною гель плавиться при температурі 25 ˚С. Ця температура нижче за звичайну температуру інкубації багатьох мікроорганізмів (30–37 ˚С). Крім того, желатина розріджується під дією протеолітичних ферментів, що їх багато мікроорганізмів виділяють в середовище. Ці властивості желатини обмежують її застосування як засіба для загущення поживних середовищ. Желатину використовують головним чином в діагностичних цілях — для виявлення протеолітичної активності мікроорганізмів, а також для отримання великих колоній дріжджів. У першому випадку використовують м’ясо-пептонну, в іншому — сусло-желатину. До рідкого середовища додають10–20% желатини, залишають для набухання на5–10 хв і нагрівають на водяній бані до розчинення. Доводять рН середовища до 6,8–7,0. Желатина має кислу реакцію і велику буферність, тому на її нейтралізацію йде більше луга, чим, наприклад, на нейтралізацію MПA. Желатинове середовище стерилізують при 0,5 атм 15 хв або дрібно –3 рази по 20 хв в кип'ятильнику Коха. Повторна стерилізація желатинового середовища, особливо при рН середовища нижче 6,0 або вище 7,3 не рекомендується, оскільки желатина частково гідролізується і втрачає властивость утворювати гель.

Кремнекислий гель (силікагель) використовують інколи як тверду основу для синтетичного середовища. Гель готують таким чином: до соляної кислоти (густиною 1,1) додають при перемішуванні рівний об'єм розчину рідкого скла (Na₂SiO₃ або К₂SiO₃) тієї ж густини. Суміш розливають в чашки Петрі по 20–30 мл в кожну і залишають чашки на горизонтальній поверхні на декілька годин до утворення кремнекислого гелю. Коли гель затвердіє, відкриті чашки поміщають в скляну або емальовану судину, промивають 2–3 діб проточною водою для видалення хлоридів, а потім кілька разів гарячою дистильованою водою. Про відсутність хлоридів судять за якісною пробою промивних вод з 1–5%-ним розчином азотнокислого срібла. За наявності хлоридів утворюється білий осад. Відмиті від хлора пластинки просочують 2–3 мл концентрованого середовища, вміст компонентів в якому в 5– 10 разів вище, ніж у відповідному середовищі. Потім чашки з пластинками гелів поміщають відкритими в сушильну шафу і підсушують при 50–60 ˚С (стежать за тим, щоб гель не розтріскався і його поверхня залишилася вологою). Якщо необхідно, чашки загортають в папір і, не перевертаючи, стерилізують в автоклаві при 0,5 атм 15 хв. Чашки з силікагелевими пластинками до вживання зберігають під водою.

Режими стерилізації поживних середовищзалежать перш за все від їх складу. Найнадійнішим методом термічної стерилізації поживних середовищ є стерилізація паром під тиском у автоклаві. Але для різних середовищ необхідно використовувати відповідні режими стерилізації. Субстрати, які містять речовини, що не витримують нагрівання до 120˚С, стерилізують при 0,5 атм. Молоко, дріжджовий автолізат, дріжджову воду і середовища з желатиною стерилізують при 0,5 атм протягом 15 хв. Середовища, які містять вуглеводи і вітаміни, наприклад, пивне сусло, соки, стерилізують при 0,5 атм 20–30 хв. М’ясо-пептонний бульйон і мясо-пептонний агар автоклавірують при 1 атм 20–30 хв, картопляне середовище і грунтовий витяг, при 1,5 атм 30 хв.

Вибираючи режим стерилізації, необхідно враховувати рН середовища. В разі кислої реакції середовища при автоклавуванні можуть піддатися гідролізу полімери, що входять до складу середовища. Так, якщо рН середовища нижче 6,5–6,0, то відбувається пептонізація желатини, і середовище після стерилізації не застигає. При рН нижче 5,0 частково гідролізується і втрачає здатність утворювати гель агар-агар.

Якщо середовище лужне, то при стерилізації випадають в осад солі заліза, карамелізуються і стають недоступними для мікроорганізмів вуглеводи. Щоб уникнути цього, середовище, призначене для культивування ацидофільних або алкалофильних мікроорганізмів, стерилізують при нейтральному значенні рН і лише після автоклавування підкисляють або підлужують. Крім того, розчини деяких компонентів середовища часто стерилізують окремо при такому рН і в тому режимі, при яких вони не змінюються, а вже потім додають ці компоненти до середовища в потрібній кількості.

Для стерилізації поживних середовищ і розчинів, які псуються за температур вище 100 °С використовують метод тиндалізації. Якщо і температура 100 °С зависока для компонентів поживного середовища, використовують метод дробної пастерізації. А в тих випадках, коли взагалі не можна використовувати термічні методи, вдаються до методів фізичної стерилізації (УФ-випромінювання, ультразвук) та стерилізації фільтруванням.

 

► ХІД РОБОТИ: ◄

1. Приготувати МПА. Для цього 2 г сухого бульйону і 1г пептону суспендують в 80 мл води і кип'ятять 5 хв, при необхідності бульйон фільтрують. У отри­маному МПБ розчиняють при нагріванні 2 г агару. Встановлюють слаболуж­ну реакцію середовища 20 % розчином Na₂CO₃. Гаряче середовище фільт­рують, розливають в три пробірки. Першу пробірку заповнюють на 1/4 – 1/3 об'єму; другу пробірку – на 1/3 – 1/2 об'єму, третю – на 2/3. На пробірках необхідно написати назву поживного середовища.

2. Приготувати сусло-агар. Для цього 10 г солоду змішують з 80 мл води. Суміш підігрівають до 55–58 °С до зникнення реакції на крохмаль (синього забарв­лення з йодом), потім фільтрують. До сусла додають 2 г агару, кип'ятять до розчинення. Гаряче середовище фільтрують, розливають в три пробірки. Першу пробірку заповнюють на 1/4 – 1/3 об'єму; другу пробірку – на 1/3 – 1/2 об'єму, третю – на 2/3. Пробірки підписують.

3. Приготувати дріжджове середовище. Для цього 10 г пресованих дріжджів розводять в 80 мл дистильованої води, кип'ятять 20 хв, фільтрують. Додають 1 г сахарози, 0, 1 г К₂НРО₄, 0,05 г NaCl і 1 г агару, Доводять рН середовища до нейтрального значення. Середовище кип'ятять і фільтрують гарячим, розливають в три пробірки. Першу пробірку заповнюють на 1/4 – 1/3 об'єму; другу пробірку – на 1/3 – 1/2 об'єму, третю – на 2/3. Пробірки підписують.

4. Пробірки закрити ватяними пробками і ковпачками.

5. Простерилізувати приготовані середовища.

6. Приготувати пробірки зі скошеним середовищем.

 

► КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ: ◄

1. Назвіть основні компоненти поживного середовища для автотрофних мікроорганізмів.

2. Назвіть основні компоненти поживного середовища для гетеротрофних мікроорганізмів.

3. Поясніть зміст термінів «прототрофи» і «ауксотрофи».

4. Натуральні середовищі, їх використання, приклади натуральних середовищ.

5. Які поживні середовища називаються синтетичним? Де їх використовують?

6. Особливості складу і застосування індикаторних середовищ.

7. Класифікація поживних середовищ за фізичним станом.

8. Основні загусники, використовувані для отримання твердих поживних середовищ.

9. Способи стерилізації поживних середовищ.

 

Лабораторна робота № 5.