Критические величины для подвижных фаз в СФХ

Флюид Температура Тс, оС Давление рс, Па Плотность dc, г/см3
СО2 31,3 7,39 0,468
N2О 36,5 7,27 0,457
NH3 132,5 11,40 0,235
Метанол 239,4 8,10 0,272
н-Бутан 152,0 3,80 0,228
Дифтордихлорметан 111,8 4,12 0,558
Диэтиловый эфир 195,6 3,64 0,265

Наиболее часто в качестве подвижной фазы в СФХ используют диоксид углерода, поскольку это достаточно дешевый, нетоксичный, не имеющий запаха, удобный в обращении реагент, не поглощающий УФ-излучение вплоть до 190 нм. Критические параметры диоксида углерода таковы, что температура и давление могут варьироваться в достаточно широких пределах. При его применении в качестве подвижной фазы оптимизация разделения компонентов смеси может быть достигнута введением органического модификатора, например метанола или диоксана.

Неподвижные фазы в СФХ могут находиться в набивных или капиллярных колонках. Набивные колонки заполняются адсорбентами с диаметром частиц 3–10 мкм, в капиллярных колонках из плавленого кварца в качестве неподвижных фаз используют жидкие или химически привитые на внутренних стенках силоксаны. Толщина слоя неподвижной фазы в капилляре составляет 0,05–1 мкм.

Следует обратить внимание на важную роль точной установки температуры и давления при проведении СФХ. Температура может поддерживаться с помощью обычных для ГХ колоночных термостатов. Давление в колонке необходимо точно контролировать, поскольку плотность сверхкритического флюида зависит от давления и изменения давления приводят к изменению коэффициентов емкости. Более высокое давление обеспечивает большую плотность флюида. Это повышает элюирующую силу подвижной фазы и снижает время удерживания компонентов разделяемой смеси. Например, увеличение давления диоксида углерода с 7 до 9 Мпа сокращает время удерживания компонентов некоторых смесей примерно в 5 раз. Благодаря этому в СФХ используют градиентное программирование давления, по достигаемому эффекту аналогичное программированию температурв в газовой хроматографии и градиентному элюированию в жидкостной.

Благодаря тому, что СФХ объединила преимущества газовой и жидкостной хроматографии, она особенно полезна при установлениии соединений, которые не могут быть определены ни ГХ, ни ЖХ. Это, с одной стороны, нелетучие вещества, которые не могут испаряться без разложения, и, с другой стороны, вещества, не содержащие функциональных групп и, следовательно, не дающие сигнал при использовании обычных для жидкостной хроматографии спектроскопических или электрохимических детекторов.

Примеров применения СФХ для определения нелетучих веществ с относительно высокой молекулярной массой достаточно много уже в настоящее время. С ее помощью эффективно анализируются многие природные продукты, лекарства, пищевые продукты, поверхностно-активные вещества, полимеры, сырая нефть и продукты ее переработки и многие другие объекты.

 

Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) — вид элюентной хроматографии, в которой в качестве основного компонента подвижной фазы используется вещество в сверхкритическом или околокритическом состоянии. Впервые возможность использования растворителя при температурах выше критической в качестве элюента в хроматографии была показана в работе Клеспера 1962 года [1], однако долгое время этот метод не находил серьезного применения ввиду недостаточного развития приборной базы. Настоящее становление данной техники пришлось на 80—90-е годы, в немалой степени благодаря обострившемуся вниманию общества к проблемам природопользования и ресурсосбережения. В ходе поиска альтернативных, более экологически приемлемых и экономически выгодных лабораторных и промышленных технологий сверхкритические флюидные технологии, и в частности СФХ, стали пропагандироваться и использоваться не только в среде исследователей-энтузиастов. Так, например, газета Нью-Йорк Таймс 19 мая 1987 года писала: «Выше определенной температуры и давления вещество может быть переведено в некое особое состояние, называемое сверх­критическим флюидом... которое нельзя встретить на Земле в обычных условиях». В 1990—2000-е годы пристальное внимание было сконцентрировано на методах раз­деления энантиомеров с использованием сверхкритической хроматографии, поскольку именно в этой области экономические преимущества препаративной СФХ над ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) дают особо заметный эффект. Однако в последнее время осваивается все больше новых сфер применения этого метода, ранее казавшихся недостижимыми для сверхкритической хроматографии. Ниже будет разобрано несколько примеров такого рода.

 

2. СВОЙСТВА СВЕРХКРИТИЧЕСКИХ ФЛЮИДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ

В СФХ

Как известно, некоторые свойства сверхкритических флюидов могут быть описаны как промежуточные между свойствами газов и жидкостей. Важными для использования в хроматографии являются следующие из них:

— коэффициенты диффузии в сверхкритических средах больше коэффициентов диффузии в жидкостях;

— вязкость сверхкритических флюидов меньше вязкости жидкостей;

— растворяющая способность сверхкритических флюидов выше растворяющей способности газов.

Применительно к хроматографии это означает, что:

—возможно достижение значительно более коротких времен анализа;

—оптимальное значение линейной скорости потока в СФХ выше, чем в ВЭЖХ;

—спад давления на колонке гораздо меньше, чем в ВЭЖХ;

—возможно использование колонок большей длины;

—возможно использование гораздо более низких температур, чем в ГХ, без потери эффективности;

—возможно проведение разделений веществ с гораздо большими молекулярными массами, чем в ГХ.

Кроме вышеперечисленного, подвижная фаза в СФХ, состоящая в основном из вещества, в нормальных условиях являющегося газом, более сжимаема, чем в ВЭЖХ. Сравним, например, коэффициенты: изотермического сжатия С02 и ацетонитрила:

(С02, 25 °С) = 7,3 • 10 -4 мл/атм;

(С02, 10 °С) = 4,5 • 10 -4 мл/атм;

(СН3СN, 25 °С) = 4,5 • 10 -5 мл/атм.

Было показано [2], что поток мобильной фазы в СФХ не подвержен турбулентности в отличие от подвижной фазы в ВЭЖХ, что увеличивает эффективность разделения в СФХ. Это особенно существенно в препаративной хроматографии, поскольку позволяет использовать в приборах соединительные трубки большей длины без дополнительных потерь эффективности и уширения пиков за счет турбулентных явлений.

В 60—90-е годы было изучено множество «претендентов» на роль основного компонента подвижной фазы в СФХ. Вначале рассматривались вещества, являю­щиеся как жидкостями, так и газами в нормальных условиях. Позднее было показано, что, несмотря на хорошие растворяющие способности у полярных жидкостей, жидкости не могут дать серьезных преимуществ по сравнению с ВЭЖХ, поскольку требуемые величины вязкости и коэффициентов диффузии достигаются в слишком жестких условиях ввиду высоких критических параметров этих веществ. Наибольшее внимание было уделено воде и аммиаку как потенциальным раство­рителям СФХ, однако в данном случае, помимо жестких условий эксплуатации, возникает также проблема чрезвычайно высокой коррозионной активности подвижной фазы. Среди газов в качестве компонентов подвижной фазы иссле­довались такие вещества как N2O, SO2, Xe, SF6, ряд алканов и некоторые другие. К настоящему моменту все они были отброшены по тем или иным причинам. Так, N2O и SO2, хоть и обладают сравнительно высокой полярностью, но обладают также и заметной токсичностью, что фактически исключает их использование в препаративных системах, где невозможна реализация полной герметичности хроматографического пути и гарантированного отсутствия контакта человека с веществом-элюентом. К тому же было показано, что закись азота способна образовывать взрывоопасные вещества при продолжительном контакте с металлом под давлением [3]. Xe — предпочтителен с точки зрения минимизации шумов при УФ-детектировании, но обладает слишком малой растворяющей способностью. Алканы — пожароопасные вещества. Меры предосторожности, которые необходимо предпринимать при наличии опасности их выброса в атмосферу и самовоспламенения, сводят на нет потенциальные выгоды от их использования при разделении неполярных восков, триглицеридов и т. п. В настоящее время 100 % приложений сверхкритической хроматографии реализуются с использованием диоксида углерода в качестве основного компонента элюента.

В 1968 году в работе [4] было предположено, что сжатый СО2 по своей растворяющей способности должен быть сравним с изопропанолом. Это утверждение на долгое время сбило исследователей и производителей оборудования для СФХ с верного пути. Впоследствии, когда стало окончательно ясно, что данное предположение не подтверждается экспериментальными данными, восторжествовало представление о схожести сверхкритического диоксида углерода с гексаном, в основном ввиду неполярности обеих молекул. Однако и этот постулат также не вполне отвечает реальности. Хотя дипольный момент СО2 равен нулю, но эта молекула обладает значительным квадрупольным моментом, и обе связи С=О полярны [5]. Это выражается в способности СО2 проявлять свои полярные свойства на микроуровне в межмолекулярных взаимодействиях. В некоторых случаях вступать во взаимодействие в качестве слабой кислоты Льюиса, в некоторых — в качестве слабого основания Льюиса, а в некоторых — одновременно в обеих этих функциях [5]. На основании значительной экспериментальной базы данных сейчас можно однозначно утверждать, что СО2 не является аналогом гексана по растворяющей способности и что нормально-фазовая хроматография (НФ) с использованием гексана в качестве основного компонента подвижной фазы не эквивалентна СФХ в отношении круга решаемых задач. Особенно ярко это проявляется при разделении перфторированных углеводородов и соединений, содержащих большое количество сложноэфирных групп.

И тем не менее, возможности использования СФХ с чистым СО2 в качестве элюента весьма ограничены ввиду его невысокой растворяющей способности для полярных веществ. Поэтому подавляющее большинство современных методик разделения с помощью сверхкритической хроматографии с насадочными колонками реализовано с использованием сорастворителей, также называемых модификаторами или энтрейнерами. Чаще всего в этом качестве используются низшие спирты как доноры водородных связей — метанол, этанол, изопропанол, 1- и 2-бутанол — и ацетонитрил как акцептор водородных связей. Кроме того, для ряда приложений применяется толуол как компонент, позволяющий увеличить роль ароматических π—π взаимодействий анализируемых веществ (аналита) с подвижной фазой, а также некоторые углеводороды — в тех случаях, когда необходимо понизить полярность растворителя. В большинстве приложений содержание сорастворителя в мобильной фазе невелико — 10~20 объемных процентов, однако иногда эта величина доходит до 55 %. Роль сорастворителя в разделении весьма многогранна и не сводится только к увеличению общей полярности подвижной фазы. Молекулы модификатора сорбируются на активных центрах неподвижной фазы, меняя тем самым взаимодействие аналита с сорбентом и сорбента с растворителем. Модификатор меняет плотность растворителя, что приводит к смещению оптимума линейной скорости и к изменению спада давления по колонке. Наиболее распространенным сорастворителем в СФХ является метанол. Его использование приводит к уменьшению времен удерживания и влияет на селективность разделения. Полярный модификатор выполняет функцию, аналогичную роли силь­ного растворителя в обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.

Строго говоря, в сверхкритической хроматографии не играют большой роли физико-химические свойства, присущие собственно сверхкритическому состоянию. Ни отсутствие поверхностного натяжения, ни особые механизмы передачи тепла не оказывают решающего влияния на хроматографические параметры. Единственная характеристика сверхкритического состояния, которую можно назвать необходимой в СФХ, — это наличие гомогенной однофазной системы. Использование значительных количеств сорастворителя при низком давлении либо высокой температуре может привести к расслоению растворителя и возникновению двухфазного режима, что чрезвычайно негативно сказывается на эффективности разделения и уровне шума детекторов (см. рис. 1). Так, критическая точка смеси 86 % С02 : 14 % MeOH — 105 бар/55 °С. Поскольку содержание модификатора в подвижной фазе — параметр, наиболее сильно влияющий на разделение, то при оптимизации условий хроматографисту может понадобиться проводить сканирование его значений в широком диапазоне. При этом следует опираться на фазовые диаграммы двухкомпонентных смесей, чтобы быть уверенным в том, что при изменении состава элюента нет возможности «выпасть» из однофазного режима.

 

В остальном же подвижная фаза в СФХ не обязательно должна существовать именно в сверхкритическом состоянии. В ранних работах предполагалось, что смена сверхкритических условий на субкритические должна вызывать значительные эффекты в хроматографии, например, в ходе градиентного элюирования с изменением состава мобильной фазы ввиду резких изменений вязкости и коэффициентов диффузии. По мере становления СФХ было показано, что это совсем не так, и при постоянстве плотности элюента, которого можно достичь, удерживая давление не ниже определенной величины, переход, например, через критическую температуру не приводит к серьезным изменениям этих величин. В ряде фармацевтических приложений СФХ с насадочными колонками даже используются специальные колоночные криотермостаты, позволяющие охлаждать колонки и проводить элюирование при отрицательных температурах [6].

В связи с вышеизложенным встает проблема точного наименования обсуждаемой хроматографической техники. По сути, называя СФХ сверхкритической хроматографией, мы поступаем не совсем корректно, поскольку отличительной особенностью данного метода от ГХ (газовой хроматографии) и ВЭЖХ является не использование подвижной фазы в сверхкритическом состоянии, а использование смесей сжатого диоксида углерода и органических сорастворителей в этом качестве. При этом в области низких давлений, высоких температур и малых количеств энтрейнеров хроматографическая система с таким элюентом ведет себя близко к ГХ, при использовании же высоких давлений, относительно низких температур и значительных количеств энтрейнеров — ближе в ВЭЖХ. Разными исследователями предлагались различные наименования для отдельных интервалов диапазона между ГХ и ВЭЖХ — Solvating Gas Chromatography, Hyperbaric Chromatography, Enchanced Fluidity Chromatography, Pressurized Fluid Chromatography и т.п. В работах Честера и Парчера [7] была предложена концепция унифицированной хроматографии как единого метода, вбирающего в себя все промежуточные стадии между классической газовой и классической жидкостной хроматографией. СФХ занимает срединное положение во внутреннем разделении методов, при этом очевидно, что никакие жесткие рамки, разграничивающие пункты такого деления между собой, не могут быть установлены и не имеют никакого практического значения, оставаясь лишь вопросом предпочтительной терминологии. Таким образом, в современной литературе под термином СФХ понимается не столько термодинамическое состояние подвижной фазы, сколько приборное оформление проводимых экспериментов, позволяющее осуществлять поддержание достаточно высокого давления на всем протяжении хроматографического тракта.

 

Одна из основных отличительных особенностей СФХ — возможность использования больших линейных скоростей потока. Зависимость эффективности разделения от линейной скорости подвижной фазы в хроматографии определяется уравнением Ван-Деемтера

 


Ввиду небольших значений вязкости подвижной фазы в СФХ коэффициент С в уравнении (1) мал в сравнении с ВЭЖХ-системами, и угол наклона восходящей ветви кривой Ван-Деемтера (см. рис. 3), пропорциональный величине 8dp/100Dm, где dp — диаметр пор в насадочной колонке, а Dm — коэффициент диффузии, оказывается достаточно пологим, чтобы, во-первых, оптимум кривой находился в области более высоких значений |х, чем в ВЭЖХ, а во-вторых, чтобы увеличение скорости потока флюида не приводило к резкому падению эффективности. На рис. 4 приведена зависимость количества теоретических тарелок от скорости потока при разделении энантиомеров оксида транс-стильбена с использованием одного и того же хирального сорбента в ВЭЖХ и СФХ. Как видно, приемлемой эффективности в СФХ можно добиваться при гораздо более высоких скоростях потока подвижной фазы. Этот фактор становится особенно важным при необходимости проведения большого количества однотипных рутинных анализов либо препаративной очистке больших количеств вещества, так как даже небольшая экономия времени может дать значимый суммарный выигрыш. На рис. 5 [8] приведен еще один эксперимент этого рода, из которого можно заключить, сколь велика может быть экономия времени, тратящегося на разделение, при использовании высоких скоростей потока в СФХ

Помимо возможности сохранения эффективности при увеличении скорости потока, низкая вязкость обусловливает также малый перепад давления по колонке в ходе элюирования в СФХ по сравнению с ВЭЖХ. Зависимость перепада давления от вязкости определяется уравнением Пуазейля

 

гдгде с — коэффициент пропорциональности; L — длина хроматографической колонки; µ — линейная скорость потока; ɛт — коэффициент пористости колонки; η — динамическая вязкость; dp — диаметр пор упаковки сорбента.

Вязкость диоксида углерода в типичных для насадочной СФХ условиях примерно в 10 раз меньше вязкости воды. При смешении воды со спиртами вязкость образующейся системы даже увеличивается вследствие сильного водородного взаимодействия между ними, что негативно сказывается на перепаде давления в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом состава. СО2 слабо взаимодействует со спиртами, и вязкость подвижной фазы в СФХ полого монотонно растет при градиенте состава с ростом содержания сорастворителя. Типичное значение АР на стандартной колонке 250 х 4,6, заполненной 5-микронным сорбентом, при 25 °С и скорости потока 1,5—2,0 мл/мин — 150 бар для ВЭЖХ и 20 бар для СФХ. Серийно производимое оборудование, как правило, рассчитано на максимальное давление на насосах в 400 бар. Соответственно, объемная скорость потока выше 3 мл/мин в ВЭЖХ используется чрезвычайно редко, большинство же аналитических приложений реализовано на скорости 1—2 мл/мин. В СФХ возможно элюирование через аналитическую колонку 100-5 250 х 4,6 со скоростью до 10 мл/мин при сохранении достаточной эффективности разделения.

Названные факторы вместе с высокими коэффициентами диффузии и высокими коэффициентами сжимаемости обусловливают не только высокую скорость разделения и более высокую эффективность при сравнимой селективности, но и несравнимо более быстрое установление равновесного режима после смены экспериментальных условий. Последнее свойство также становится весомым при необходимости проведения большого количества рутинных экспериментов либо при скрининге сорбентов и сорастворителей с целью поиска оптимальной мето­дики разделения. Этот же комплекс свойств позволяет применять более длинные колонки или последовательное соединение нескольких колонок для достижения более эффективного разделения в случаях отсутствия иных неэкстенсивных путей оптимизации методики.

 

4. ПРИБОРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ

Современная сверхкритическая флюидная хроматография с насадочными колонками — ближайшая родственница ВЭЖХ как в отношении химических и технических приемов, используемых для достижения желаемых результатов, так и в плане приборного оформления. СКФ-хроматограф состоит из насосного блока, колоночного термостата, автосамплера, одного или нескольких детекторов, регулятора давления (back-pressure regulator, BPR, БПР) и системы сбора фракций. Двумя принципиальными техническими отличиями СФХ-систем от ВЭЖХ являются: 1) необходимость контроля давления на всем протяжении пути от насосов до выхода из детектора, осуществляемая регулятором давления БПР, и 2) необходимость охлаждения головок насоса СО2 для предотвращения перехода диоксида углерода в газовую фазу. Первое требование обычно удовлетворяется установкой охлаждающей системы, в которую включается блок предварительного охлаждения жидкого диоксида углерода после выхода из источника перед попаданием в поршневые камеры насоса и охлаждение самих камер. Это может осуществляться либо с использованием охлаждающего циркуляционного термостата с антифризом, либо с помощью элемента Пельтье. Второе требование выполняется встраиванием в контур автоматического регулятора давления на выходе потока из детектора. Существует много различных вариаций БПР. Наибольшее распространение получили системы, базирующиеся на линейных игольчатых клапанах тонкой регулировки, управляемые с помощью мотора. Ряд дополнительных технических особенностей приборов для СФХ — наличие возможности ввода пробы в поток модификатора до смешения его с диоксидом углерода в случае препаративного разделения веществ высокой полярности; необходимость установки УФ-детекто-ров, снабженных смотровой ячейкой высокого давления; наличие камеры смешения потоков флюида и сорастворителя, выполняющей также функцию демпфера пульсаций потока, — не являются непривычными для производителей хромато-графического оборудования, поскольку схожие задачи приходится решать и при конструировании иных типов приборов.

Меры предосторожности при работе с СФХ также во многом схожи с ВЭЖХ. Использование нетипичных, химически агрессивных либо чересчур вязких сора-створителей может привести к повреждению насосов. При температурах существенно выше комнатной (>60 °C) могут пострадать колонки. Единственной отличительной особенностью техники безопасности СФХ по сравнению с иными хроматографическими методами является обращение с эффлюентом. После БПР СО2, теряя давление, адиабатически расширяется примерно в соотношении 1 : 500, что приводит к формированию сильного потока газа с каплями сорастворителя и аналита в нем, а также резко охлаждается благодаря эффекту Джоуля—Томсона.

Поэтому поток эффлюента в СФХ сначала пропускают через газо-жидкостный сепаратор либо уловитель жидкости, в случае препаративной хроматографии нагревают и только после этого направляют на систему сбора фракций. В противном случае вести количественный сбор очищенного продукта становится весьма затруднительно вследствие выпадения большой части выделенного продукта на охлаж­даемом благодаря адиабатической декомпрессии участке пути и формирования аэрозоля в сборнике ввиду высокой скорости потока газообразного диоксида углерода.

Насадочная СФХ обычно считается нормально-фазовой техникой, поскольку в ней используется неполярная подвижная фаза и полярные сорбенты. И действительно, большинство приложений, для которых используется эта техника, ранее решались с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ. СФХ фактически послужила основой для возрождения нормально-фазовой хроматографии, так как до масштабного внедрения СФХ в лабораторную практику нормально-фазовая ВЭЖХ постепенно теряла популярность и вытеснялась более популярной обращенно-фазовой хроматографией. Это вызвано целым рядом причин, среди которых:

—губительное воздействие на разделение даже небольших количеств воды в системе;

—очень большие времена установления равновесных условий;

—трудности с осуществлением градиентных методик;

—генерация большого количества токсичных и взрывоопасных жидких отхо­дов при проведении препаративных разделений;

—невысокие растворяющие способности доступных элюентов.

Как следует из изложенного выше, насадочная СФХ полностью свободна от всех этих сложностей, поэтому нормально-фазовая хроматография вновь вернулась в активную производственную практику с появлением СФХ. Произошедший в 90-е годы переход от насосов, контролирующих рабочее давление в системе, и пассивных рестрикторов к насосам, контролирующим скорость потока флюида, и автоматическим БПР позволил реализовать градиентное элюирование с вариацией содержания сорастворителя в подвижной фазе. При этом рост вязкости по мере роста процента сорастворителя компенсируется падением линейной скорос­ти потока при сохранении эффективности разделения в ходе градиентного элю-ирования. 0днако сверхкритическая хроматография не ограничена этой областью. 0дним из замечательных проявлений двойственной природы полярности диок­сида углерода является тот факт, что перевод между НФ и 0Ф режимами осуще­ствляется простой сменой колонки при сохранении подвижной фазы. На рис. 6 приведен пример использования СФХ в обращенно-фазовом режиме для разделения смеси олигомеров полиэтилена массами вплоть до С84, достигнутого всего за 7 минут [9]. При этом в СФХ наибольшее влияние на удерживание разделяемых компонентов в обоих режимах оказывает природа подвижной фазы, поскольку в ней отсутствует вода, практически не смешивающаяся с СК-С02. Вода нивелирует слабые межмолекулярные взаимодействия, при наличии ее в элюенте механизмы удерживания преимущественно определяются способностью к участию в водородных связях. В СФХ больший вклад в удерживание дают более слабые диполь-дипольные, к—к, поляризационные и иные типы взаимодействий. 0тчасти поэтому на настоящий момент количество сорбентов, применяемых в СФХ, значительно превышает таковое в ВЭЖХ и разрыв продолжает расти, так как поиск механизмов удерживания и разделения, равно как и способов их реализации в хроматографии, продолжается [10].

 

 

5. СОВРЕМЕННЫЕ ЗАДАЧИ СФХ С НАСАДОЧНЫМИ КОЛОНКАМИ

Долгое время с помощью сверхкритической флюидной хроматографии решались преимущественно задачи разделения энантиомерных смесей слабо- и среднеполярных органических соединений в нормально-фазовом режиме. Но по мере выявления хроматографистами инструментальных преимуществ, возникающих при переходе на СФХ, сформировался тренд на расширение областей ее применения. Выгоды, связанные с экономией дорогих органических элюентов, отсутствием необходимости иметь дело с большими количествами отработанных жидкостей, 3—5-кратным увеличением скорости элюирования, дают столь заметный эффект, что желание применять его при решении как можно большего числа задач абсолютно естественно. Основным ограничением здесь является низкая растворимость полярных субстанций в сверхкритическом диоксиде углерода. Подходы к решению этой проблемы сводятся к четырем базовым приемам:

—использование более полярного флюида;

—использование более полярных сорастворителей;

—деактивация неподвижной фазы;

—использование полярных динамических модификаторов.

Первый прием, как уже обсуждалось, в настоящее время не рассматривается как магистральная траектория развития СФХ. Сочетание физико-химических, экономических и экологических характеристик СО2-СФХ таково, что альтернативы в обозримом будущем не предвидится. Возможности второго пути в значительной степени отработаны, так как наиболее полярным растворителем, способным неограниченно смешиваться с СК-СО2, является метанол, и большая часть того, что может быть сделано с использованием этой смеси, уже реализовано. Деактивация неподвижной фазы также не работает в данном случае. Поскольку при разделении полярных субстанций в СФХ реализуется нормально-фазовый механизм разделения, то уменьшение полярности колонок не позволит добиться приемлемых величин эффективности. Напротив, использование четвертого приема приводит к весьма впечатляющим результатам и сулит большие перспективы в отношении расширения сфер применимости сверхкритической хроматографии.

Динамическая модификация — хроматографический прием, заключающийся во введении малого количества (доли процента) активного вещества, которое прочно адсорбируется на неподвижной фазе и изменяет механизмы взаимодействия аналита с сорбентом, аналита с элюентом и элюента с сорбентом. Это вещество называется динамическим модификатором (ДМ). Данный подход, как и многое другое, пришел в СФХ из практики ВЭЖХ. Как правило, динамическими модификаторами в распределительной хроматографии являются кислоты и основания средней силы, но бывают и иные субстанции, используемые в качестве ДМ. Роль ДМ в СФХ, как и роль сорастворителей, сложна и не сводится к кэппированию остаточных силанольных групп на колонках или к подавлению кислотного либо основного сольволиза аналита в мобильной фазе. 0ни также способны изменять растворяющую способность флюида по отношению к анализируемым объектам, модифицировать преимущественный тип удерживания веществ на колонке, формировать ионные пары с ионными аналитами, альтернировать энантиоселек-тивность и пр. Наиболее распространенные группы ныне используемых динамических модификаторов:

• основания — триэтиламин, диэтиламин, изопропиламин;

• кислоты — трифторуксусная, алкилсульфоновые, лимонная;

• соли — ацетат аммония, алкилсульфонат натрия.

Динамическая модификация, проходящая непосредственно в ходе эксперимента, обратима в отличие от химической, которая проводится предварительно. Тщательная промывка сорбента после элюирования подвижной фазой, свободной от модификатора, как правило, позволяет полностью восстановить первоначальные характеристики колонки. Ниже мы кратко обсудим ряд групп профессора Тейлора в Virginia Tech последних достижений в области применения динамической модификации в СФХ для разделения полярных субстанций.

 

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СФХ — мощный хроматографический инструмент, находящий все более широкое применение как в препаративной практике, так и в аналитической. Его преимущества перед высокоэффективной жидкостной хроматографией базируются на свойствах диоксида углерода в конденсированном состоянии, которые в случае возможности элюирования рассматриваемого аналита в условиях СФХ делают эту технику предпочтительным выбором хроматографиста. Долгое время рассматривавшаяся как нормально-фазовая хроматография для разделения исключительно слабополярных энантиомерных смесей, в последнее время СФХ получила мощный импульс к развитию благодаря всестороннему внедрению различных методов динамического модифицирования, которые позволили расширить область ее применимости на целый круг задач, ранее казавшихся недоступными для метода со столь неполярной подвижной фазой. Дальнейшее развитие метода в этом направлении в сочетании c работой по увеличению чувствительности детектирования в СФХ способно привести к существенному вытеснению позиций ВЭЖХ не только в сфере препаративного разделения, но и в области тонкого химического анализа.

 

 


1.8.3. Хроматографические колонки.

 

 

В практической жидкостной хроматографии применяют обычные аналитические колонки диаметром 3–5 мм и длиной 5–25 см и микроколонки диаметром 0,5-1 мм и длиной от 5 до 10 см. Большинство стандартных колонок длиной 25-30 см заполнены сорбентом с размером частиц 5-10 мкм, число теоретических тарелок в них может достигать (5-10) × 103 по неудерживаемому компоненту.

Колонку заполняют и закрывают с обеих сторон металлокерамическими фильтрами (фриттами) для предотвращения высыпания сорбента. Один из вариантов заполнения колонок заключается в создании суспензии подходящего сорбента. Чтобы полностью удалить суспендирующую жидкость и уплотнить насадку, колонку некоторое время промывают элюентом при повышенном давлении. Этот метод получил название метода сбалансированной плотности. Особенно сложен процесс создания обращенно-фазных колонок, и главная опасность при этом заключается в неоднородности упаковки. При заполнении колонок такими сорбентами возникает большой электрокинетический потенциал, а так как привитые сорбенты являются диэлектриками, то на их поверхности скапливается избыточный заряд, «расталкивающий» частицы. Для снятия заряда в суспензию добавляется электролит (ацетат натрия).

Между дозатором и жидкостной аналитической колонкой помещается предколонка, заполненная тем же сорбентом, что и основная, и предохраняющая основную колонку от влаги и сильносорбирующихся примесей (это особенно важно при анализе биологических объектов).

Поскольку разделение компонентов анализируемой пробы в газовом хроматографе в абсолютном большинстве проводится при повышенных температурах, газовые хроматографические колонки помещаются в камеру термостатирования, в которой заданная температура колонки должна поддерживаться с точностью ±0,1-0,5оС, а иногда и точнее.

Хроматографические колонки для жидкостной хроматографии рассчитаны, в основном, на комнатную температуру. Однако в ряде случаев, например при анализе полимерных систем, необходимо работать при повышенных температурах (для увеличения растворимости полимеров в подвижной фазе). Максимальная рабочая температура для силикагелевых колонок составляет 120°С, а для модифицированных сорбентов на основе силикагеля - 80°С. В последнее время успешно развивается метод высокотемпературной жидкостной хроматографии (от 100 до 200°С), налажен выпуск соответствующей аппаратуры.

Выход колонки соединен с детектором. Особенностью жидкостной хроматографии является то обстоятельство, что она почти всегда сочетает разделение с препаративным выделением разделенных фракций. Поэтому выход колонки во многих случаях соединяется также и с коллектором фракций.

Коллектор фракций включает узел распределения, блок перемещения пробирок, кассету с пробирками и систему автоматизации всего процесса сбора фракций. При выполнении анализа через заданные временные интервалы происходит перемещение пробирок для сбора фракций. Число пробирок в различных коллекторах фракций составляет 100-200.

 

Устройство колонок

В связи с вышеперечисленными методами колонки для жидкостной хроматографии (КЖХ) выполняются из высокопрочных устойчивых к действию агресивных сред металлов (легированной стали, титана и т.д.) или из кварцевого стекла с полированными внутренними стенками. Реже выпускают колонки изготовленные из химически стойких пластиков. Как уже отмечалось, существует множество типов колонок: для хроматографии низкого и высокого давления; для аналитической, препаративной или промышленной хроматографии; для радиальной или аксиальной хроматографии. Также колонки подразделяют на неразборные (упакованные в заводских условиях) и разборные с подвижными и не подвижными адапторами. Каждый тип колонки имеет свои конструкционные особенности. Ниже будут описаны основные составные части КЖХ и, по возможности, конструкционные отличия основных типов.
Конструкционно КЖХ состоит из обязательных частей: трубки и адапторов, и не обязательных частей: рубашки термостата, гидравлической системы для упаковки колонки и т.д.

Неразборные колонки

Данный тип колонок в основном используется в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии, так как данный метод в основном используется для качественного и количественного анализа, при котором особенно важна воспроизводимость результатов. Наилучшим способом достижения данного результата является использование масштабного фабричного поризводства унитарных колонок со строго соблюдаемыми параметрами всех комплектующих. На рынке представлено огромное количество колонок данного типа различных производителей очень высокого качества, различающимися, главным образом, используемыми в них сорбентами. Не смотря на то, что многие фирмы предлагают примерно одинаковый спектр КЖХ как по физическим размерам колонок, так и по заявленному составу неподвижной фазы, тем не менее именно новшества, привносимые каждой фирмой в производство своих сорбентов иногда приводят к очень значительным различиям по селективности, долговечности и воспроизводимости на конкретных смесях.
Поэтому при подборе ЖКХ для анализа конкретной смеси необходимо:
1) определиться с типом будущего хроматографического анализа (нормальнофазная или обращеннофазная. или ионообменная и т.д.);
2) провести сравнительные тесты колонок различных производителей с выбранным типом сорбента.
Конструктивно данные колонки представляют собой трубки из не подверженных коррозии сплавов (Рис. 1) или пластика в которые запрессован сорбент. С двух сторон колонки имеют резьбовые отверстия с коническим углублением для фитингов. Внутренний диаметр от 1 до 10 мм, длина 10-400 мм.

Рис. 1. Аналитические колонки для ВЭЖХ.


К данному типу КЖХ также можно отнести колонки (картриджи) для проведения двердофазной экстракции и схожие с ними по принципу картриджи для выделения нуклеиновых килот. Принципиальным отличием данных колонок от применяемых в аналитических хроматогрофах является черезвычайно малое количество (от десятков до сотен миллиграмм) адсорбционного материала, размещенного в ячейке с большим соотношением диаметр/длина. Смыв аналитов с адсорбента осуществляется сравнительно небольшим объемом растворителя (в пределах десяти миллилитров), что дает возможность сильно сконцентрировать аналит, но не позволяет провести полноценную хроматографию.

Разборные колонки

Как ясно из названия колонки данного типа разбираются на составные части: на трубку и адапторы. Это свойство позволяет самостоятельно заполнять колонки необходимым сорбентом. Практически все колонки для хроматографии низкого давления производятся именно в таком исполнении, как аналитические, так и препаративные. В ВЭЖХ данный вид колонок применяется в высокопроизводительных хроматографах (препаративных и промышленных). Адапторы бывают подвижные и не подвижные, и колонки, в зависимости от исполнения бывают с двумя неподвижными адапторами, с одним подвижным и одним неподвижным адапторам (самая распространенная комплектация) и с двумя подвижными адапторами.

Адапторы

Для удержания сорбента, поддержания постоянного внутреннего объема и создания равномерного и ламинарного потока ПФ через все поперечное сечение колонки используются адапторы.

Подвижные адапторы используются для регулирования внутреннего объема колонки. Принципиальная конструкция подвижного адаптора для аксиальных колонок представлена на риунке 2.

 

Рис. 2. Конструкция адаптера. 1 — корпус; 2 — фильтр (мембрана); 3 — прижим; 4 — уплотнительное кольцо; 5уплотнение трубки; 6 — гайка при­жима; 7— трубка для поступления (выхода) ПФ.

Материалы колонки

Материалы из которых выполнены составные части адаптора различаться могут сильно различаться в зависимости от цели и условий хроматографии. Так при ВЭЖХ практически все части как адапторов (даже мембрана), так и колонки выполняются из металла. При хроматографии низкого давления колонка зачастую выполняется из стекла, а детали адаптора из химически стойкой пластмассы (полиэтилена, тефлона и т.д.).

Набивка колонки

Набивка колонки - очень ответственный процесс, от качества выполнения которого практически полностью зависит успех дальнейшего эксперимента. Основной опасностью при набивке являются неоднородности, которые могут образоваться по разным причинам и привести к размыванию пиков и, в конечном итоге, к неудовлетварительному результату хроматографии. Неоднородности могут образовываться от:

1) неравномерного заполнения колонки в результате слишком быстрого осаждения сорбента или неравномерности осаждающего потока;

2) посторонних включений в сорбент (пузырьки воздуха, грязь, колонии микроорганизмов и т.д.);

3) неоднородности размеров гранул сорбента.

Для недопущения неравномерного заполнения колонки необходимо заполнять колонку однородной, свежеприготовленной суспензией постепенно добавляя новые порции суспензии до заполнения сорбентом требуемого объема колонки, после этого следует установить верхний адаптор не допуская образования пузырьков воздуха и пустить поток подвижной фазы для окончательного осаждения сорбента. Следует отметить, что для достижения нужного результата обязательным условием является чистота мембран и одинаковая проницаемость по всей площади.

Посторонние включения такие как грязь и колонии микроорганизмов образуются в результате неправильных условий хранения или неправильной регенерации сорбента и предупреждаются только полным соблюдением регламента или заменой сорбента. Пузырьки воздуха могут образовываться в двух случаях: при слишком интенсивном суспензировании или при неаккуратном вливании суспензии в колонку. В обоих случаях происходит расплескивание суспензии и таким образом происходит захват трудноотделимых пузырьков. Зачастую, в данном случае необходимо перенабивать колонку.

Неоднородноти размеров гранул встречаются при использовании сорбентов старых марок, экспериментальных сорбентов или использованных ранее сорбентов, в которых присутствует мелкодисперсная фракция разрушенных гранул. При всех приведенных случаях необходимо производить отмучивание (декантацию) суспензии. Для этого разбавленную суспензию набухшего, промытого и переведенного в нужный буфер (см. ниже) сорбента заливают до­верху в мерный цилиндр, объем которого в 5—6 раз больше, чем объем упакованного влажного сорбента, и дают ему осесть до того момента, когда между слоем сорбента и мутной жидкостью над ним обозначится резкая граница. Гранулы смолы или сефадексов оседают относительно быстро — за несколько минут (в зависимости от их среднего размера), а целлюлоза — медленнее (за 10—30 мин). Жид­кость над осадком вместе со взвешенными в ней мелкими частицами отсасывают и отбрасывают. Снова дополняют цилиндр буфером, осторожно палочкой взмучивают осадок по всему объему цилиндра и повторяют описанную операцию до тех пор (3—5 раз), пока жид­кость над только что образовавшимся осадком не будет совершенно прозрачной. Затем выжидают еще некоторое время (до полного осе­дания слоя сорбента), измеряют его высоту линейкой и отсасывают буфер — на этот раз не полностью, а до такого уровня, чтобы слой жидкости составлял половину высоты осадка. Такое соотношение при взмучивании позволяет получить кашицу («slurry»), консистен­ция которой наиболее удобна для заливки в колонку.

В преперативной хроматографии (особенно ВЭЖХ) для забивки колонки используют гидравлические системы, позволяющие равномерно уплотнять сорбент и удерживать его в заданном объеме во время хроматографии. В этом случае, для достижения оптимального результата необходимо строго придерживаться руководства производителя по используемому при упаковке давлению на сорбент. В случае отклонений от заданных условий упаковки может произойти или пережатие сорбента (при превышении давления), или образовываться полотсти (при меньшем давлении).

 

 

1.8.6. Детекторы, используемые в жидкостных хроматографах.

Основные типы детекторов для ЖХ

Фотометрические детекторы

Ультрафиолетовый детектор

Рефрактометрический детектор

Интерферометрический детектор

Флуориметрический детектор

 

Электрохимические детекторы

Вольтамперометрический детектор

Потенциометрический детектор

Полярографический детектор

Кулонометрический детектор

 

Детектор радиоактивности

 

Детектор по светорассеиванию


В ходе развития ЖХ было предложено большое количество методов детектирования. Существует уже более 20 типов детекторов для ЖХ. Классификация показывает, что основную массу предложенных детекторов можно разложить на следующие классы: оптические, электрические, электрохимические и детекторы для измерения радиоактивных веществ.

К оптическим детекторам относятся ультрафиолетовый (УФД), инфракрасный (ИКД), рефрактометрический (РМД) и флуорометрический (ФМД), а также все детекторы, в которых в той или иной мере используется лазерное излучение, такие как детектор светового рассеяния (СРД), фотоакустический (ФАД), фотокалориметрический (ФКД), фотоионизационный (ФИД) и поляризационный (ПОД) детекторы.

К электрическим детекторам обычно относят детектор по диэлектрической постоянной (ДПД), акустический (АД), емкостный (ЕМД), детектор тока потока (ТПД) и некоторые другие.

Отдельно рассматривается использование в качестве детекторов для ЖХ различных приборов физико-химического анализа, таких как масс-спектрометр (МС), атомноабсорбционный спектрометр (ААС), поляриметр (ПОД), УФ-, ВИД- и ИК-спектрофотометры и газохроматографических детекторов, таких как ДЭЗ, ДПИ, ДПФ, ДТИ и др.

Тип Предел детектирования, г/мл
ЭХД 10-12
ФМД 10-11
УФД 10-10
СПФ 10-9
МС
ЭПД 10-7
РМД

Наиболее распространенными детекторами в ЖХ являются оптические детекторы, которые можно разделить на следующие классы:

абсорбционные, работающие в УФ-области спектра (190 ... 380 нм), — УФД.

абсорбционные для видимой области спектра (380 ... 800 мм) -ВИД;

ИК-детекторы (800 ... 5000 нм) — ИКД;

рефрактометрические различных типов — РМД;

эмиссионные, флуориметрические различных конструкций — ФМД;

хемилюминесцентные — ХЛД.

 

Фотометрические детекторы

Наиболее часто в ЖХ применяются фотометрические детек торы, основанные на измерении поглощения (абсорбции) света в УФ- или видимой областях спектра. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно ин тенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200 ... 800 нм. Наличие подходящих растворителей, прозрачных в этом диапазоне длин волн, делает фотометрические методы наиболее подходящими для градиентного элюирования.

Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность для поглощающих УФ- и видимый свет веществ, высокий динамический диапазон линейности (до 106), малый рабочий объем ячеек (<1 мкл), небольшое экстраколоночное расширение пиков и высокую воспроизводимость показаний. Они являются недеструктивными и относительно нечувствительными к колебаниям потока подвижной фазы и изменениям температуры, достаточно удобны в работе и обеспечивают возможность выбора длин волн.

Ультрафиолетовый детектор

Чувствительность современных УФД может доходить до 0,001 е. о. п. на всю шкалу при 1 % шума и зависит от природы анализируемого соединения и длины волны детектирования этого соединения. При такой высокой чувствительности могут быть зафиксированы малые количества (до нескольких нанограммов) слабо абсорбирующих УФ-свет веществ. Широкая линейная область УФД позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты на одной хроматограмме.

Фотометрические детекторы в свою очередь подразделяются на детекторы с фиксированной длиной волны (УФД), детекторы со сменной (с помощью фильтров) длиной волны, или фильтровые фотометры (ФУФД), и спектрофотометрические детекторы с детектированием в определенной области длин волн (СПФ).

Наиболее простые и дешевые УФД широко применяются в высокоэффективных жидкостных хроматографах, особенно в при борах, предназначенных для массовых рутинных анализов.

При использовании Hg-лампы низкого давления, обладающей высокой стабильностью и долгим временем жизни (более 5000 ч), детектирование проводится на длине волны 254 нм, которой соответствует 90% энергии излучения. На длине волны254 нм высоким поглощением обладают многие органические соединения, такие как ароматические, гетероциклические, кетоны и т.п.

Наиболее часто для УФД применяются ячейки следующих размеров: длина оптического пути 10 мм, диаметр светового канала около 1 мм, рабочий объем ячейки около 8 мкл. Такие ячейки подходят главным образом для аналитических колонн внутренним диаметром 4 ... 6 мм, заполненных сорбентом с частицами около 5 мкм. Рабочий объем ячейки — это один из важнейших ее параметров. Например, использование ячейки объемом 8 ... 10 мкл может привести к дополнительному размыванию пика на 30 ... 50 мкл и может оказаться неприемлемым для пиков шириной менее 100 мкл. Уменьшение объема ячейки может быть достигнуто двумя путями: сокращением длины оптического пути, что приводит к падению чувствительности детектора, и уменьшением диаметра канала ячейки, которое приводит к снижению интенсивности проходящего через нее света и увеличению шума. Оба эти эффекта увеличивают предел детектирования. Для сверхкритической флюидной хроматографии (СКФХ) необходимы проточные ячейки высокого давления. Оптические детекторы в целях компенсации фона чаще всего имеют две ячейки: рабочую и сравнительную. Для двухканального детектирования используются следующие методы, подключения сравнительных ячеек:

статический при заполнении сравнительной ячейки чистым растворителем;

динамический путем разделения потока от насоса на две части и пропускания одного из них через рабочую, а другого — через сравнительную колонку и сравнительную ячейку;

динамический с использованием дополнительного насоса низкого давления для прокачивания ячейки тем же растворителем;

динамический путем включения сравнительной ячейки между сосудом с растворителем и насосом в зоне всасывания, а рабочей ячейки — после разделительной колонки.

Спектральный диапазон и степень его разделения на поддиапазоны зависит от спектральной характеристики источника из лучения и от способа выделения необходимой спектральной полосы, осуществляемого или до измерительной ячейки или после нее. Некоторые источники излучения имеют линейчатый спектр (например, ртутная лампа — 254; 303; 313; 365; 464; 436; 516 нм и т.д.), другие — непрерывный спектр (например, дейтериевая лампа — 190 ... 600 нм). Интенсивности их излучения в пределах рабочего диапазона приблизительно одинаковы. Необходимая спектральная полоса выделяется двумя различными способами: с помощью дифракционных решеток, имеющих 1000 ... 3000 штрихов на 1 мм, и интерференционных фильтров с заданной шириной спектральной полосы. В обоих случаях может быть получена спектральная полуширина от 1 ... 2 нм до 10 ... 20 нм.

Способ дискретизации спектрального диапазона в фотометрических детекторах определяет различие между спектрофотометрами и фильтровыми фотометрами для ЖХ.

Следует иметь в виду, что СПФ, обеспечивающие возможность многоволнового детектирования, очень дороги. Для дешевых приборов массового анализа необходимо сочетать возможность работы на нескольких длинах волн с низкой стоимостью детектора, что обеспечивается применением фильтрового фотометра.

Характерной особенностью многих фильтровых УФД является использование в них источников линейчатого спектра. Кроме ртутной применяются кадмиевая и цинковая лампы с линиями на 229 и 214 нм соответственно. Используются также преобразователи излучения с длиной волны λ = 254 нм в излучение с λ = 280 ... 290 нм и в другие длины волн, отсутствующими в спектре ртути.

Особый интерес представляют разработанные в последнее время фильтровые фотометры с дейтериевой лампой в качестве источника излучения. В них используется принцип выделения в УФ-области спектра достаточно широких полос (около 10 нм) из непрерывного спектра источника с помощью широкополосных интерференционных фильтров. Этот принцип применяется также в флуориметрии и спектроскопии в видимой области. Характеристики таких фотометров достаточно высоки. Выводы о более высоком уровне шумов при использовании фильтровых УФД по сравнению с шумами приборов с источниками линейчатых спектров справедливы в случае узкополосных интерференционных фильтров, так как доля энергии,-приходящаяся на узкую (1 ... 2нм) полосу непрерывного спектра, значительно ниже энергии наиболее интенсивных полос, например, ртутной лампы.

Применение широкополосных фильтров позволяет получить примерно на порядок более интенсивный световой поток. Уровень шумов значительно снижается. Достигается перекрытие достаточно широкого диапазона длин волн с помощью всего 4 ... 6 интерференционных фильтров. При этом наблюдается некоторое снижение селективности детектирования по сравнению с селективностью СПФ, но, учитывая большую ширину полос (30 ... 40 нм), характерную для электронных спектров поглощения молекул, этот эффект можно не учитывать.

При сравнении фильтровых фотометров с СПФ низкого разрешения предпочтение также отдается первым вследствие простоты их оптической схемы без множества отражающих поверхностей, существенно ослабляющих световой поток в СПФ.

В настоящее время наблюдается тенденция использования фильтровых фотометров для многоволновой записи хроматограмм — метода, который ранее считался областью применения только дорогостоящих сканирующих спектрофотометров.

Учитывая изложенное выше, можно заключить, что применение УФД с дейтериевой лампой в качестве источника света и набором широкополосных фильтров с целью создания относительно дешевого двух-, трех- и четрехволнового УФД с выбором длин волн в диапазоне 200 ... 300 нм является самым распространенном.

 

Рис. 1. Оптическая схема двухканального УФД с фотодиодной матрицей:

1 — источник света; 2 — щелевая линза; 3 — проточная ячейка; 4 — щель; 5 — решетка; 6 — зеркало; 7 — фотодиодная матрица; 8 — селектор длин волн; 9 — дифференциальный усилитель; 10 — самопишущий прибор.

Другим перспективным направлением является применение фотодиодных матриц для регистрации всего спектра (Рис. 1). В СПФ с фотодиодной матрицей непрерывное излучение источника света проходит через проточную ячейку 3 и попадает на дифракционную решетку 5. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости фотодиодной матрицы 7, состоящей из 200...500 элементарных фотодиодов, которая выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин волн с дискретностью 2...5 нм. Постоянная времени системы с 200 фотодиодными элементами должна быть не более 40 нс. В связи с тем, что при регистрации спектра в диапазоне длин волн 200...600нм создается массив информации около 1000 К для аналитической хроматографии и около 5000 К для микроколоночной ВЭЖХ при ширине пика на половине высоты менее 1 с, обработка и запись спектров проводится с помощью быстродействующих компьютера и регистратора.

Совместное использование детекторов нескольких типов в единой системе, например УФД с инфракрасным (ИКД) и рефрактометрическим (РМД) детекторами, значительно увеличивает информативность анализа в результате одного разделения, особенно при идентификации таких соединений, как насыщенные, ненасыщенные, разветвленные и ароматические углеводороды. Примером может также служить применение управляемого компьютером градиентного жидкостного хроматографа с УФД, ФМД и когерентным рамановским спектрометром в качестве детектора, объединенными в единую систему около одной ЭВМ.

К фотометрическим детекторам относится также детектор, основанный на поглощении света в ИК-области спектра (ИКД). Некоторые функциональные группы органических соединений имеют характеристические частоты в ИК-спектрах этих соединений. Поэтому ИКД может служить для идентификации природы органических соединений. Одним из основных условий работы ИКД является прозрачность применяемых растворителей в ИК-области спектра. Наиболее подходящими, однако редко применяемыми в хроматографической практике, растворителями являются ССl4, СНСl3 и CS2.

Абсорбция ИК-света может быть использована как для селективного, так и неселективного детектирования. Если ранее детекторы этого типа применялись главным образом в эксклюзионной хроматографии с колонками большого диаметра, то в настоящее время их все шире используют в ВЭЖХ.

Ко всем соединениям, имеющим одинаковые функциональные группы, ИКД дает примерно одинаковые показания.

В связи с независимостью показаний ИКД от молекулярной массы анализируемых соединений он имеет значительные преимущества по сравнению, например, с РМД. Молярные показания ИКД практически постоянны.

Детектор достаточно стабильно работает при повышенных температурах (~ 150 °С) ячейки. В оптимальных условиях детектор может чувствовать около 1 мкг вещества с молекулярной массой 300, содержащего функциональную группу С—Н на длине волны 3,4 мкм. Более сильно абсорбирующие ИК-излучение функциональные группы обеспечивают более высокую чувствительность, которая, однако, в среднем не превышает чувствительность РМД.

Для детектирования в микроколоночной обращенно-фазной ВЭЖХ с использованием колонок из фторопласта с внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 10 см ИКД можно устанавливать непосредственно на конце колонки. Колонка на длине 5 мм расплющивается, и образуется проточная ИК-ячейка с длиной светового пути около 30 мкм.

В специальной литературе описано несколько систем, объединяющих жидкостный хроматограф с ИК-спектрометром, основанным на использовании преобразования Фурье. Такая система позволяет, например, производить одновременную запись нескольких хроматограмм на выбранных оператором полосах ИК-спектра. Система позволяет анализировать органические вещества на уровне массы в 1 мкг и служит для идентификации компонентов пробы, причем неполностью разделенные хроматографические пики могут быть разрешены с помощью вычислительной техники.

Как видно из приведенных выше данных, фотометрические детекторы в настоящее время прочно занимают лидирующее положение среди ВЭЖХ детекторов, и они продолжают интенсивно развиваться. Ведется поиск новых источников излучения, конструкций проточных ячеек, методов регистрации и обработки сигналов. Эти исследования, несомненно, приведут к применению фотометических детекторов в новых областях науки и техники.

 

Рефрактометрический детектор

В отличие от детекторов фотометрического типа, реагирующих только на вещества, поглощающие свет в УФ-, видимой и ИК-областях спектра, рефрактометрический детектор (РМД) является универсальным детектором в ЖХ.

Принцип действия РМД основан иа дифференциальном измерении показателя преломления чистого растворителя и раствора анализируемого вещества в этом растворителе. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества, причем растворитель также является детектируемым веществом, так как имеет определенный показатель преломления.

Схема дифференциального рефрактометрического детектора представлена на рис. 2.

Рисунок 2. Дифференциальный рефрактометрический детектор.

Детектор содержит измерительную 4 и сравнительную 3 проточные камеры, через которые проходит луч света, излучаемый монохроматическим источником 1 через диафрагму 2. Объем измерительной камеры детектора не превышает 10 мкл. При протекании через измерительную и сравнительную камеры детектора чистого носителя фотоэлементы 7 равномерно освещены и регистратор 8 фиксирует нулевую линию. Появление в измерительной камере анализируемого вещества вызывает изменение угла преломления луча света, и на выходе призмы 5 два луча света по-разному освещают фотоэлементы. В детекторе с непосредственным отсчетом измерение угла преломления луча осуществляется по степени засветки одного из двух фотоэлементов. В компенсационным детекторе возникший разбаланс усиливается усилителем 9 и при помощи реверсивного двигателя 6 поворачивает компенсационную призму до тех пор, пока освещенность фотоэлементов не станет одинаковой. В состоянии равновесия угол поворота призмы пропорционален разности показателей преломления анализируемого газа и газа-носителя.

Принципиальная схема детектора, в котором реализуется компенсационный метод измерения, аналогична схеме, представленной на рис. 2.

Рисунок 3. Рефрактометрический детектор, основанный на измерении отраженного луча.

Рефрактометрический детектор, основанный на измерении отраженного луча, представлен на рис. 3. Детектор представляет собой призму 5, которая служит одной из стенок проточной камеры, расположенной в плате 8. Луч света от лампы 1, пройдя через диафрагму 2, светофильтр 3 и линзу 4, падает на поверхность призмы 5, контактирующей с анализируемой жидкостью. При изменении показателя преломления вещества, протекающего через камеру, изменится интенсивность отраженного и прошедшего через линзу 6 луча, измеряемая фоторезистором 7. Объем измерительной камеры детектора 5 мкл.

В связи с указанным выше РМД обладает средней чувствительностью, а его показания в сильной степени зависят от влияющих на состав подвижной фазы колебаний параметров, таких как: давление, температура и концентрация анализируемого вещества. Поэтому РМД практически неприменим в градиентной хромато графии.

В некоторых случаях могут быть выбраны пары растворителей, имеющие близкие показатели преломления n, например, н-гептан (п = 1,3855) и н-пропанол (n = 1,3854); н-гексан (n = 1,3754) и изопропанол (n = 1,3776); н-пропиловый эфир (n = 1.3807) и метилэтилкетон (n = 1,3807). При этом становится возможным градиентное элюирование в определенных пределах концентрации смеси растворителей.

Чувствительность РМД к изменениям температуры составляет для разных растворителей 5*10-4...5* 10-6 единиц показателя преломления (е. п. п.) или единиц рефракции (е. р.) на 1 °С, а к изменениям давления (1...5) 10-6 е. р./МПа.

Чувствительность РМД к температуре требует специальных мер по стабилизации температуры самого детектора и подвижной фазы при входе в детектор. В этом случае применение длинных соединительных трубок (теплообменников) на входе в детектор приводит к высокому экстраколоночному расширению пиков и снижает достигнутую в колонке эффективность разделения.

В хроматографах с РМД для обеспечения стабилизации потока элюента и сорбируемости примесей в колонке желательно применять ее термостатирование. Для реализации минимальной чувствительности РМД на уровне 10-8 е. р. погрешность термостатирования колонки не должна превышать ±0,01 °С.
При хорошем термостатировании РМД относительно не чувствителен к изменениям расхода подвижной фазы. Детектор достаточно прост, удобен в работе, недеструктивен и отличается высокой воспроизгодимостью показаний.

Единственным крупным недостатком РМД является его нечувствительность к веществам, имеющим одинаковый показатель преломления с растворителем.

РМД может детектировать любые вещества независимо от температуры их кипения, структуры, молекулярной массы и других физико-химических свойств. Предел обнаружения для лучших РМД достигает 10-8 е. р. Шум РМД в 100 раз выше шума УФ-детектора. Детектор хорошо применим в тех случаях, когда нет необходимости в высокой чувствительности, например в препаративной хроматографии.

РМД достаточно широко применяется в эксклюзионной хроматографии, причем применение метода регистрации дифференциала удельного показателя преломления при анализе синтетических полимеров позволило повысить параметры РМД по сравнению с параметрами его аналогов. Погрешность метода 1...2%. Одной из основных задач в области РМД является снижение уровня шумов. Путем применения нечувствительных к вибрациям двухлучевых систем удается снизить шумы до 5*10-8 е. р., а высокоточное термостатирование совместно с улучшением оптической системы позволяет уменьшить шумы до 1*10-8 е. р.

Основными проблемами в развитии РМД являются увеличение линейности, уменьшение постоянной времени и экстраколоночн