Количественная интерпретация хроматограмм является одним из наиболее ответственных заключительных этапов хроматографического анализа.
Задачами количественной интерпретации хроматограмм в зависимости от целей и задач конкретного применения этого метода могут выступать:
1) количественное определение одного компонента или небольшого числа компонентов сложного многокомпонентного анализируемого продукта;
2) определение содержания одного или нескольких компонентов анализируемого многокомпонентного продукта и общего содержания остальных веществ;
3) определение полного количественного состава многокомпонентного вещества.
Использование хроматографии для контроля качества продукции в большинстве случаев представляет собой варианты решения аналитических задач I и II типа. В этих случаях, как правило, на подготовительной стадии определяемые компоненты анализируемого продукта выделяются из него каким-либо подходящим методом, чаще всего, методами экстракционного извлечения соответствующим экстрагентом, затем полученный экстракт подвергается очистке от мешающих разделению компонентов, ряду других операций, например, выделению из экстракта и растворению в подходящем растворителе, а затем хроматографической качественной идентификации, в основе которой лежит использование характеристик удерживания, и количественному определению, основанному на измерении площадей или высот соответствующих хроматографических пиков.
При проведении такого рода количественного анализа необходимо учитывать важность подбора оптимальных условий предварительной подготовки хроматографируемой пробы. Очень важно подобрать такой экстрагент, использование которого обеспечивало бы максимальную степень извлечения искомого(ых) компонента(ов) из многокомпонентного продукта, его высокую селективность по отношению к нему (ним), легкость удаления экстрагента и др.
Задачи количественного хроматографического анализа, относящиеся к III типу, решаются обычно при проведении комплексных научных исследований.
Точность результатов количественного хроматографического анализа может колебаться от десятых долей до нескольких десятков процентов и определяется поставленной задачей, выбором аппаратуры и условий проведения анализа, выбором определяющего параметра хроматограммы и точностью его измерения, выбором метода расчета хроматограммы и точностью использованных калибровочных коэффициентов. Важное значение имеет также качество самой хроматограммы, которое зависит от многих факторов, в частности:
- от количества вводимой пробы и правильности ее введения. Для получения качественной хроматограммы проба перед началом элюирования должна находиться в колонке в виде узкой полосы, что обеспечивается, во-первых, оптимальным объемом вводимой пробы, который для предотвращения перегрузки колонки не должен превышать определенного значения, пропорционального корню квадратному из ее длины, и, во-вторых, надежностью дозирующего устройства;
- правильности выбора колонки и режима ее работы. Должна быть подобрана такая колонка, которая обеспечивает не только полное разделение всех определяемых компонентов, но и достижение требуемой точности количественных результатов. Особое значение имеет стабильный температурный режим колонки;
- чувствительности детектора;
- оптимальности работы системы регистрации хроматограммы, которая должна обеспечивать равномерность движения диаграммной ленты в самописце. При этом если обсчет хроматограмм ведут по высоте пиков, скорость диаграммной ленты существенного значения не имеет, но когда обсчет ведется по площади пика, необходимо подобрать оптимальную скорость.
При количественном определении содержания какого-то компанента хроматографическим методом на хроматограмме анализируемой пробы по времени удерживания или удерживаемому объему методами, описанными в предыдущем разделе, идентифицируют пик определяемого компонента.
11.1. ПАРАМЕТРЫ ПИКА КАК ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛИЧЕСТВА ВЕЩЕСТВА
Параметром хроматографического пика называется величина, функционально связанная с количеством соответствующего данному пику вещества.
Эта величина может быть определена:
· путем измерений на полученной хроматограмме;
· путем непосредственной обработки выходного сигнала детектора.
На практике используют три основных параметра хроматографического пика:
1) высота пика h;
2) произведение высоты пика h на время удерживания t или пропорциональное ему расстояние на хроматограмме от момента ввода пробы до регистрации максимума пика l, т.е. h t или h l;
3) площадь пика А или величины, приближенно характеризующие ее значение.
Установлено, что для хроматограммы, полученной в идеальных условиях, применение любого из указанных параметров для количественных определений должно давать одинаковые результаты. Поскольку реальные хроматограммы получаются в условиях более или менее далеких от идеальных, то в зависимости от конкретных условий анализа и применяемого оборудования ценность того или иного параметра пика может оказаться различной.
Основные критерии, которые определяют ценность параметра в конкретных условиях, можно сформулировать следующим образом:
· Простота и точность измерения величины параметра. Так, например, полная площадь пика в большинстве случаев является приемлемым параметром. Однако измерение площади на реальных хроматограммах обычно сопряжено с большими затратами труда и времени либо требует применения специального оборудования, стоимость которого соизмерима со стоимостью хроматографа. Поэтому такой параметр стараются заменить другим.
· Линейность связи значения параметра с количеством соответствующего ему вещества (линейность параметра). Связь значения параметра с количеством компонента в пробе должна быть максимально близка к линейной, по крайней мере, в пределах изменения концентрации определяемого вещества в смесях, для которых методика предназначена.
Разумеется, можно работать и с нелинейным калибровочным графиком. Однако при этом следует установить, не окажутся ли затраты труда, связанные с систематической проверкой нелинейного графика по нескольким точкам настолько большими, что экономия времени на измерении параметра не будет иметь существенного значения.
Например, использование в качестве параметра высоты пика часто приводит к необходимости использовать нелинейный калибровочный график, в то время как использование параметра hb дает линейный график. Бывают случаи, когда вследствие асимметрии пика оба эти параметра дают нелинейную связь с количеством вещества. В таком случае используют тот параметр, который проще измерить.
· Устойчивость к изменению условий анализа.
Численное значение параметра пика определяется не только количеством вещества, которому этот пик соответствует, но и условиями анализа, в которых он получен. Чем меньше влияют условия анализа на параметры пика, тем он более устойчив. При этом особенно важны те условия анализа, которые влияют одновременно и на работу хроматографической колонки и на работу детектора.
Так, скорость потока газа-носителя в большинстве случаев одновременно влияет и на работу колонки и на работу детектора. Температура колонки связана с температурой детектора, если последний размещается в термостате колонок. Если же детектор размещен в отдельном термостате, то температура в термостате колонок на него практически не влияет. Ток моста детектора теплопроводности или расход вспомогательных газов детектора ионизации в пламени – факторы, которые можно считать независимыми от условий работы колонки.
Во всех этих случаях речь идет о сравнительно небольших отклонениях от подобранных для конкретной методики и прибора условий.
При рассмотрении вопросов устойчивости параметров следует иметь в виду возможность использования для расчетов как его абсолютных, так и относительных значений. Относительные значения параметров получаются путем деления значения параметра каждого пика данной хроматограммы на значение такого же параметра одного из пиков, значение которого принимается равным единице. Относительные значения параметров пиков более устойчивы, чем абсолютные, однако их получение требует больших затрат времени.