Работа 13. Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу b-глицерофосфата (метод Боданского), УИРС.
Работа 13. Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу b-глицерофосфата (метод Боданского), УИРС. - раздел Биотехнологии, ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Активность Щелочной Фосфатазы В Норме Равна 0,5-1,3 Ммоль/ч×л, А Кислой...
Активность щелочной фосфатазы в норме равна 0,5-1,3 ммоль/ч×л, а кислой фосфатазы – 0,06-0,13 ммоль/ч×л. Принцип определения активности фосфатаз основан на способности ферментов отщеплять неорганический фосфат от b-глицерофосфата. Для определения активности щелочной фосфатазы используют щелочной раствор b-глицерофосфата, для кислой – кислый раствор b-глицерофосфата.
Реактивы и исследуемый материал
1. Щелочной раствор b-глицерофосфата, 5 г/л, рН 8,6. 2. Кислый раствор b-глицерофосфата, 5 г/л, рН 5,0. 3. Раствор молибденовокислого аммония, 25 г/л (в 2,5 н растворе серной кислоты). 4. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л. 5. Рабочий стандартный раствор фосфора (содержит 0,01 мг фосфора в 1 мл). 6. Раствор аскорбиновой кислоты, 10 г/л (в 0,1 н растворе HCI).
Ход работы
В центрифужную пробирку с надписью Пщ внести 1 мл щелочного раствора, в пробирку с надписью Пк - 1 мл кислого раствора b-глицерофосфата и поместить их на 5 мин в термостат при 37 °С для прогревания субстратов. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки внести по 0,1 мл сыворотки крови и полученную фермент-субстратную смесь инкубировать в течение 1 ч при 37 °С. Время термостатирования опытных проб использовать для определения содержания неорганического фосфата в контрольных пробах. Для этого в центрифужные пробирки с надписью Кщ и Кк внести соответственно по 1 мл щелочного или кислого раствора b-глицерофосфата, прилить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавить по 0,1 мл той же сыворотки крови, пробы перемешать и через 5 мин центрифугировать в течение 10 мин при 3000 об/мин. Затем отобрать по 1,5 мл центрифугата и перенести в обычные пробирки с соответствующей маркировкой (Кщ и Кк), прибавить по 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, перемешать. Пробы выдерживают 10 мин при комнатной температуре, после чего их колориметрируют при красном светофильтре в кюветах шириной 5 мм. В качестве пробы сравнения используют дистиллированную воду. К опытным пробам после инкубации в термостате добавить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешать и далее обработать и колориметрировать, как контрольные пробы. Активность щелочной и кислой фосфатаз рассчитывают, используя калибровочный график. Для построения калибровочной кривой готовят следующие растворы.
Реактивы
Номера пробирок
Рабочий раствор Рн, мл
0,6
1,2
2,4
3,6
4,8
6,0
ТХУ, мл
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
Вода, мл
5,9
5,3
4,1
2,9
1,7
0,5
Перемешать
Отобрать в другие пробирки
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
Молибденовый раствор, мл
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Аскорбиновая кислота
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Содержание Рн (мг) в пробах
0,001
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
Через 10 мин после прибавления аскорбиновой кислоты пробы колориметрировать при красном светофильтре в кювете шириной 5 мм против дистиллированной воды. При построении калибровочной кривой на оси абсцисс откладывать содержание Рн в пробах, а на оси ординат – величины оптической плотности. В качестве единицы масштаба взять 10 мм на 0,001 мг фосфора.
По калибровочной кривой рассчитать число мг Рн в опытных и контрольных пробах.
где (Пщ-Кщ) или (Пк-Кк) – количество Рн, которое освободилось при действии фосфатазы; 1,47×105 – коэффициент пересчета с 0,068 мл на 1 л сыворотки; 31 – масса 1 ммоля Рн (мг).
Чиркин А.А.
Введение в биотехнологию.
Учебно-методический комплекс для студентов биологического факультета / А.А.Чиркин. – Витебск: Издательство УО «ВГУ им. П.М.Машерова», 2009. – 146 с.
&nbs
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Для специальности 1-31 01 01 – Биология рекомендуется учебная программа № ТД-G.005/тип., составленная доктором медицинских наук профессором Ю.К.Фомичевым, доктором биологических наук профессором В.
Практикум
Работа № 1. Знакомство с питательными среды для культивирования изолированных клеток и тканей растений.
Основные компоненты питательных сред:
- макроэлементы (азот, фосфор, калий,
Работа 5. Колоночная гель-фильтрация.
Для гель-фильтрации используются так называемые молекулярные сита - инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают на основе декстрана (сефаде
Работа 14. Качественные реакции на витамин А.
Витамин А при взаимодействии с серной кислотой окрашивается в красно-фиолетовый или красно-бурый цвет, при взаимодействии с хлорным железом - в желто-зеленый цвет.
Реактивы, исследуемый ма
Работа 15. Количественное определение витамина А в рыбьем жире.
Принцип метода. Метод основан на реакции витамина А с треххлористой сурьмой в присутствии уксусного ангидрида, в результате чего развивается синяя окраска. Интенсивность окраски, прямо пропо
Работа 16. Качественные реакции на витамин Д.
Витамин Д при взаимодействии с анилиновым реактивом при нагревании окрашивается в красный цвет, при взаимодействии с раствором брома в хлороформе приобретает зеленовато-голубую окраску.
Ре
Работа 17. Обнаружение эргостерола в дрожжах.
Эргостерол по строению близок к холестерину и поэтому дают характерную для него реакцию с уксусным ангидридом и серной кислотой (синее или зеленое окрашивание).
Реактивы, исследуемый матер
Работа 19. Количественное определение витамина Е.
Ход работы
В две пробирки наливают по 2,5 мл 0,1% спиртового раствора витамина Е; добавляют по 0,5 мл 70% раствора азотной кислоты и выдерживают в кипящей водяной бане 3 мин. Пробирки охла
Новости и инфо для студентов