Материалы и методика исследований

Материалы и методика исследований. Все исследования по данной работе проводились в лаборатории трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Харьковского биотехнологического центра Украинской академии аграрных наук и на пункте трансплантации эмбрионов опытного хозяйства Кутузовка. Работа выполнялась в период с июля 2000 года по август 2001 года. Пункт трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, построенный по типовому проекту, имеет манеж для санитарной обработки животных перед операцией, операционную, поисковую и стерильный бокс для первичной обработки эмбрионов, помещение для замораживания и хранения эмбрионов, моечную и др. В манеже и операционной расположены специальные фиксационные станки.

Операционная, поисковая и стерильный бокс оборудованы бактерицидными лампами.

Пункт оснащен необходимым лабораторным, технологическим оборудованием и лабораторной посудой.

Предметом исследования были коровы и телки черно-пестрой породы и полученные от них эмбрионы. В опытном хозяйстве Кутузовка беспривязная система содержания на глубокой несменяемой подстилке. Кормление животных проводили по общепринятым нормам. Рационы были сбалансированы по общей питательности, белку, фосфору, кальцию и витаминным добавкам.

Животные регулярно подвергались ветеринарно-профилактическим и санитарным обработкам, клинико-гинекологическим обследованиям, постоянно находились под ветеринарно-зоотехническим наблюдением. Исследования проводили на коровах-донорах и телках-реципиентах с нормальным состоянием половых органов и цикличностью воспроизводительной функции. Опытная группа состояла из коров в возрасте 3-8 лет, с живой массой 500-600 кг и телок в возрасте 16-18 месяца, с живой массой 350-380 кг. В контрольную группу отбирали коров и телок методом пар-аналогов.

В экспериментах использовано 25 коров-доноров и 60 телок - реципиентов. Для вызывания суперовуляции применяли препараты ФСГ. Животные обрабатывались по 4-х дневной схеме ФСГп производства фирм Schering Corp или Burns Biotec США и ФСГ-супер Россия в общей дозе 50 мг Табл. 1 . Таблица 1. Схема гормональной обработки коров-доноров препаратом ФСГп 50 мг производства США День эстрального цикла Название препарата Доза мг Общая доза утро вечер 10-12 ФСГп 7 7 14 11-13 ФСГп 6,5 6,5 13 12-14 ФСГп 6 6 12 Простогландин 250 250 500 мкг 13-15 ФСГп 5,5 5,5 11 14-16 Охота и осеменение 21-23 Нехирургическое извлечение эмбрионов Синхронизация полового цикла доноров и реципиентов осуществлялась инъекцией экстрофана. Осеменение коров-доноров проводилось двукратно двойной дозой замороженно-оттаянной спермы с содержанием не менее 25 млн. активных спермиев рис.1 . Из спермодозы готовили мазки для определения патологических форм спермиев.

Мазки высушивали, фиксировали и окрашивали гематоксилином Караччи.

Сперму, содержащую 18 и более патологических спермиев, выбраковывали, так как высокий процент патологических спермиев снижает оплодотворяющую способность спермы. Рис.1. Нормальные спермии быка Рис.2. Патологические формы спермиев Рис.3. Патологические формы спермиев Рис.4. Патологические формы спермиев Для бактериологических исследований использовали мясо-пептонный агар МПА и мясо-пептонный бульон МПБ , среду Китт-Тароцци, Сабуро и Булира, агар Эндо. МПА и МПБ использовали для культивирования различных микроорганизмов неопределенного состава.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали среду Китт-Тароцци МППБ . Среду Булира и агар Эндо применяли для культивирования кишечной палочки. Для выращивания грибов использовали среду Сабуро. Все среды перед бактериологическим исследованием разливали в пробирки по 5 мл. Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали автоклавированием при температуре 120 С в течение 15-30 минут.

МПА после стерилизации скашивали, установив пробирки в наклонном положении до застывания среды. Среду, предназначенную для культивирования бактерий на чашках разливали по 20-25 мл и оставляли на несколько минут до застывания агара. Когда требовалось вырастить микроорганизмы на агарезированной среде в виде изолированных колоний, чашки после засева помещали в термостат дном вверх. Отбор проб для бактериологических исследований проводили на всех этапах подготовки эмбрионов к трансплантации. 2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионамиВ помещениях лаборатории, где подготавливали инструменты, оборудование, посуду, среды для получения, пересадки и криоконсервации эмбрионов, ежедневно проводили влажную уборку.

Все оборудование бокса, его стены, пол не реже одного раза в неделю мыли моющими средствами и протирали дезинфицирующими растворами. Для дезинфекции использовали 2 -й раствор хлорамина Б . Перед работой бокс и другие помещения лаборатории облучали в течение 40-60 минут ультрафиолетовыми лучами из расчета 2-3 вт м. В боксе в день работы с эмбрионами проводили дополнительную обработку столов и оборудования 96 этанолом.

Все сотрудники лаборатории работали в стерильных халатах и сменной обуви. Спецодежду халаты, косынки, шапочки, марлевые повязки стирали не реже одного раза в неделю с обязательным кипячением и проглаживанием утюгом. Обувь регулярно по окончании работы мыли и обеззараживали 2 -м раствором хлорамина.

Употребляемые для работы с эмбрионами инструменты, посуду стерилизовали различными способами в зависимости от материала, из которого они изготовлены. Стеклянную посуду флаконы, колбы, пипетки, цилиндры и пр а также инструменты для пересадки эмбрионов закрывали пергаментной бумагой и стерилизовали автоклавированием при 1,5 атм. в течение 30мин. Затем сушили при температуре 80 С в течение 60 минут. Шприцы, иглы, пинцеты, ножницы, влагалищные зеркала и системы для вымывания эмбрионов стерилизовали кипячением в течение 30 минут.

Перед стерилизацией новую стеклянную посуду мыли водопроводной водой с мылом или порошком, с помощью щеток и ершей, ополаскивали и погружали в раствор соляной кислоты 1 ст. ложка соляной кислоты на 3 литра дистиллированной воды и выдерживали в нем 24 часа. После чего посуду отмывали в проточной воде, а затем многократно в би- и тридистиллированной воде и высушивали. Бывшую в употреблении стеклянную посуду мыли в горячем 2-3 растворе двууглекислой соды, затем тщательноополаскивали водопроводной водой, после чего би- и тридистиллированной водой и высушивали.

Бывшие в употреблении металлические предметы также мыли в вышеуказанном растворе соды, ополаскивали водопроводной, би- и тридистиллированной водой и высушивали. Одноразовые полимерные инструменты ампулы, чехлы, пипетки и др. стерилизовали в боксе путем их облучения бактерицидными лампами БУФ30 или ПРК2 в течение 20мин. с обеих сторон на расстоянии 20см от источника облучения.

Резиновые инструменты катетер для вымывания обрабатывали 70 С спиртом-ректификатом. Наружную поверхность стерилизовали, облучая лампами БУФ30 в течение 20мин. на расстоянии 20см от источника ультрафиолетовых лучей, перед работой ополаскивали 2-3 раза средой Дюльбекко. 4.2.2