Диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота.
Установление диагноза на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота включает:
- изучение клинических признаков;
- изучение эпизоотологической ситуации;
- проведение патогистологических исследований;
- проведение электронно-микроскопического исследования;
- проведение иммунохимических исследований (иммуноблотинг);
- проведение биопробы на лабораторных животных.
Для диагностических исследований в специализированную лабораторию по изучению губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота посылают:
-мозг крупного рогатого скота после исследования на бешенство и другие вирусные инфекции после неподтверждения диагноза;
-мозг крупного рогатого скота из мясокомбинатов (0,01% от забитых животных старше 3-х лет).
Порядок отбора проб мозга для диагностических исследований. Диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота проводится только после гибели или вынужденного убоя животных. В этой связи важным условием является правильный отбор проб, их фиксация, транспортировка и хранение.
Патологический материал (головной мозг) берут от животных с клиническими признаками поражения центральной нервной системы). При этом мозг для гистологических, электронно-микроскопических и иммунохимических исследований необходимо брать у животных сразу после их убоя или гибели до наступления лизиса тканей или размножения другой сопутствующей микрофлоры.
Животных с клиническими признаками губкообразной энцефалопатии умерщвляют различными способами: введением избыточной дозы барбитурата – 2-3 г барбамила (в растворе), внутримышечным введением 1-2 г гемоспоридина (в растворе), 20-30 мл 25% раствора сернокислой магнезии транстаракально в области сердца.
Голову отделяют от шеи по атланто-затылочному сочленению. Труп животного сбрасывают в забетонированную яму Беккари глубиной не менее 3-х метров и засыпают хлорной известью. Наиболее эффективным способом утилизации трупов является их сжигание. Отделенную от трупа голову упаковывают в металлическую пленку, помещают в металлический контейнер, желательно со льдом, транспортируют при температуре +2 +15оС в ветеринарную лабораторию или специализированную лабораторию по изучению губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота. Работу выполняют с соблюдением Санитарных правил 1.2.011 от 04.05.1994 г. РФ “Безопасность работы с микроорганизмами 1 и 2 групп патогенности”. При проведении работ по отделению, упаковке и транспортировке головы, а также при закапывании или сжигании трупа животного необходимо исключить травмирование рук и попадание брызг крови на кожу. Чтобы избежать этого, надевают халат, прорезиненный фартук, анатомические перчатки из плотной резины, резиновые сапоги, водонепроницаемый капюшон и защитную маску из оргстекла, закрывающую лицо от брызг крови. По окончании работ инструменты, которыми проводили отделение головы, укладываются стерилизатор с 2% раствором гипохлорита натрия не менее чем на 1 час (инструменты должны быть погружены в раствор полностью). Сапоги, фартук, капюшон, маску и перчатки также обрабатывают с 2% раствором гипохлорита натрия. Халаты обрабатывают автоклавированием при 134-138оС в течение 20-30 минут. Горючие отходы сжигают.
Голова должна быть доставлена в исследовательскую лабораторию в течение 12-36 часов, поскольку в результате размножения микроорганизмов в тканях мозга или автолиза мозг становится непригодным для гистологического исследования. Замороженный при транспортировке или при хранении в холодильнике мозг также непригоден для проведения анализа, т.к. в результате замораживания возникают артефакты, мешающие диагностике. При длительной транспортировке или в жаркую погоду целесообразно в контейнер положить лед.
Сразу после доставки в исследовательскую лабораторию с дорсальной части головы крупного рогатого скота удаляют кожу. Имеется два способа извлечения головного мозга из черепной коробки (Рис.1). При первом способе голову зажимают в тиски, а при втором – проводят ручную фиксацию на столе на листе бумаги, который ложится для предотвращения скольжения. После фиксации осторожно, чтобы не повредить мозг, распиливают лобную кость с помощью анатомической пилы. Затем производят надрезы лобной кости с каждой стороны от точек, находящихся на оси глазных ям, продлевая их каудально до наружных слуховых проходов. Продлевают эти разрезы каудально до большого затылочного отверстия также осторожно, чтобы исключить повреждение мозга. Делают сагитальный разрез посредине лобной и затылочной костей до большого затылочного отверстия. Затем разделяют и удаляют распиленные левую и правую части черепной коробки. Рассекают и снимают твердую мозговую оболочку. Затем необходимо перевернуть голову, чтобы под действием силы тяжести мозг отделился от основания черепа. Продолжить работу, продвигаясь от каудального надреза вперед; для перерезания нервов вентральной стороны черепа использовать скальпель. После извлечения мозга его целиком необходимо поместить в фиксирующий раствор или путем фиксации несплошных разрезов мозга на пластины (Рис.2,3).
Рисунок 1. Схема распилов черепа крупного рогатого скота
Рисунок 2. Схема участков головного мозга животных
Рисунок 3. Схема разрезов головного мозга
Примечание:
Ромбовидный мозг:
I – срез продолговатого мозга на уровне верхнего отдела;
II – срез стволовой части на границе продолговатого мозга и варолиевого моста;
III – срез варолиевого моста на кровне начала верхних ножек мозжечка.
Средний мозг:
IV – срез четверохолмия на уровне появления красных ядер.
Промежуточный мозг:
V – срез в области эпиталамуса на уровне раскрытия сильвиева водопровода в III желудочек мозга;
VI – срез в области таламуса на уровне эпителиальных бугров и залегающих в них ядер;
VII – срез в области гипоталамуса на уровневые воронки.
Концевой мозг:
VIII – срез бокового желудочка на уровне головки хвостатого ядра;
IX , Х– срезы полушарий большого мозга в области моторных полей туловища, грудных и тазовых конечностей.
Для фиксации мозга целиком готовят фиксирующий раствор по следующей прописи:
| №№ п/п | Наименование компонентов | Химическая формула | Количество |
| Однозамещенный фосфат натрия, моногидрат | NaH2PO4 .H2O | 4,0 | |
| Двузамещенный фосфат натрия, безводный | Na2HPO4 | 6,5 | |
| Формалин | 40% НСНО | 100,0 | |
| Дистиллированная вода | 900,0 |
Растворить соли в воде, добавить формалин и размешать, При этом рН раствора должен быть нейтральным, около 7,0.
Фиксация мозга путем использования несплошных поперечных разрезов.
Учитывая особенность проявления губкообразной энцефалопатии (отечность и расплавление нейроглии), фиксация мозга должна быть экстренная и жесткая, позволяющая исключить артрефакты и обеспечить максимально достоверную диагностику.
Для достижения этого на извлеченном головном мозге необходимо сделать несплошные поперечные разрезы в виде пластин толщиной 5-8 мм. Более толстые пластины делать нельзя, т.к. формалин проникает и фиксирует ткани только на толщину не более 8 мм. Между пластинами ткани проложить гигроскопический материал (вату, марлю, фильтровальную бумагу)
Для фиксации головного мозга, разрезанного на прордольные полосы рекомендуется использовать 15-20% раствор нейтрального формалина (150-200 мл формалина и 800 – 850 мл воды, параформа – соответсвенно в 2,5 раза меньше. Срок фиксации – 3-4 суток.
Зафиксированный мозг помещают в ударопрочную емкость, при этом объем фиксирующего раствора должен быть в 10 раз больше объема мозга. В таком виде материал должен храниться не менее 2 недель, после чего его необходимо доставить в диагностическую лабораторию.
Патогномоничными для губкоообразной энцефалопатии крупного рогатого скота являются следующие критерии (рис.4-7):
- диффузная вакуолизация и расплавление нейроглии (в виде множественных разной формы и величины сот) (рис.4, 5):
- каогуляция цитоплазмы в нейронах, проявляющаяся в виде плотного сгустка с повышенной оксифильностью (красного цвета);
- наличие пикноза, рексиса и частичного лизиса ядер нейронов, иногда криброза цитоплазмы (множественные мелкие вакуоли)(рис.6);
- гипертрофия эндотелия кровеносных сосудов я вялениями кариопикноза и репсиса);
- наличие периваскулярных круглоклеточных астроцитных и макрофагальных элементов типа негнойного энцефалита (напоминающие “висна” у овец);
- явления вакуолизации нейронов (перстневидные клетки) встречаются редко и слабо выражены, тогда как у “скрепи” овец это более выражено;
- наличие вокруг нейронов явлений отека и вакуолизации.
