Методы лабораторной диагностики ящура варьируют в зависимости от того, требуются ли обнаружение и типовая (вариантная) идентификация вируса (ранняя диагностика) или обнаружение противоящурных антител у животных-реконвалесцентов (ретроспективная диагностика).
Взятие и подготовка материала. Для исследования берут стенки афт в количестве не менее 5—10 г от 2—3 больных животных. У крупного рогатого скота исследуют стенки созревших непрорвавшихся афт с языка, у свиней — с «пятачка», у мелкого рогатого скота — с беззубого края верхней челюсти, с кожи межкопытной щели или венчика. Стенки афт должны быть свежие, плотной консистенции. При отсутствии афт берут кровь в момент повышения температуры. От трупов молодняка всех видов животных исследуют лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу и мышцу сердца. Для исследования на вирусоносительство берут специальным зондом соскобы слизистой оболочки глотки или пищевода.
Собранный материал помещают в консервирующую жидкость (глицерин) в специальную посуду (стерильные пробирки) и материал в термосе со льдом отправляется в лабораторию и обрабатывается.
Полученный материал тщательно растирается в стерильной ступке. Взвешиваем количество материала, заливаем фосфатным буфером, добавляем антибиотики и центрифугируем 15 минут при 6 тыс. оборотах. Надосадочную жидкость используют для заражения животных, культур тканей.
Для проведения лабораторных исследований с ящурным материалом необходимо располагать условиями, исключающими вынос вируса за пределы диагностической лаборатории. Всю работу по подготовке вируса для исследования и постановку РСК проводят в боксах. Перед работой меняют верхнюю одежду и обувь на специальную.
Обнаружение вируса в исследуемом материале. Электронную и световую микроскопию, а также обнаружение специфических телец-включений не проводят.
Вирусный антиген выявляют с помощью серологических реакций.
Для определения типа и вариантной принадлежности эпизоотического вируса ящура из доставленного в лабораторию патматериала чаще всего используют реакцию связывания комплемента (РСК) и реакцию длительного связывания комплемента (РДСК). Однако, когда доставленное количество вирусного материала недостаточно для исследования или РСК дает отрицательный результат или неспецифическую задержку гемолиза, ставят биопробу на крупном рогатом скоте (не менее 2 голов) в возрасте 10—18 месяцев. С этой целью вводят суспензию полученного материала по 0,1 мл в слизистую оболочку языка в нескольких точках и в мякиши конечностей. Общая доза 2—3 мл. Появление на месте введения материала с последующим подтверждением в РСК свидетельствует о наличии вируса ящура. Однако данный метод дорог и связан с опасностью выноса вируса за пределы учреждения. Поэтому в диагностической практике его применяют очень редко. Чаще всего для постановки биопробы используют мышат-сосунков 4—6-дневного возраста, морских свинок массой не менее 500 г и первичную культуру клеток почек телят, поросят, ягнят, щитовидной железы крупного рогатого скота и перевиваемые ВНК-21, УВ-RS2.
Биопроба на мышатах удобна и экономична. ID50 испытуемого штамма на мышатах-сосунах и крупном рогатом скоте одинаковы. Мышата-сосуны более чувствительны к вирусу ящура, чем морские свинки. В положительных случаях мышата заболевают с явлениями парезов и параличей и обычно погибают на 2—5-й день после инокуляции материала. Трупы мышат замораживают до использования в серологических реакциях или для следующего пассажа на мышах. Из мышц тушек погибших мышат готовят антиген для PCК при томже режиме, что и афтозный вирус.
Морские свинки легко заражаются при интрадермальном введении вируссодержащего материала в плантарную поверхность задних лапок методом туннелирования в дозе 0,2 - 0,5 мл. Заражают не менее 5 гол. Первичные поражения обычно появляются через 24—48 ч после инокуляции. Созревшие афты собирают на 2—5-й день (по мере созревания) и сразу же замораживают или помещают в консервирующую жидкость до исследования в РСК. При заражении морских свинок следует иметь в виду, что часто для адаптации полевых штаммов вируса приходится проводить несколько пассажей, прежде чем появляются хорошо развитые афты и генерализованный процесс.
Выделение вируса из исследуемого материала. Выделение вируса на естественно-восприимчивых и лабораторных животных (см. выше — биопроба). Выделение вируса на куриных эмбрионах не проводят. Для выделения вируса с помошью культуры клеток чаще используют однослойную культуру первично трипсинизированных клеток почек свиней или телят. Специфическая дегенерация клеток при подтверждении ее специфичности в РСК свидетельствует о наличии вируса ящура в испытуемом материале.
Идентификация вируса с помощью серологических реакций. Чаще всего для этого используют РСК, а также РДП, РН, РНГА и иммуноферментный метод (ELISA). Метод ELISA высокоэффективен для выявления как 140 S, так и 12 S компонентов вируса ящура. Этот метод в 500 раз более чувствителен, чем РСК, при исследовании проб афтозного эпителия. Установлена высокая степень специфичности и чувствительности для идентификации и типирования вируса ящура всех 7 серотипов в эпителиальных тканях.
Вариантная идентификация с помощью моноклональных антител нашла практическое применение при дифференциации штаммов вируса ящура. Если по лабораторным тестам обнаруживают новый тип вируса ящура, ранее не встречающийся в стране, то определяют его методом перекрестного иммунитета на крупном рогатом скоте.
Для определения типа вируса ящура методом перекрестного иммунитета на морских свинках последних заражают интраплантарно адаптированным к морским свинкам испытуемым штаммом вируса ящура. После выздоровления от генерализованного процесса их разбивают на группы и реинфицируют эталонными типами вируса по 10000 ID50. На каждый эталонный штамм берут минимум по шесть переболевших морских свинок.
Серологический метод диагностики используют для исследования (точнее идентификации) антител в реакциях: подавления связывания комплемента, диффузионной преципитации и радиальной иммунодиффузии, непрямой реакции иммунофлуоресценции, серозащиты на мышатах и реакции нейтрализации в культуре клеток, РНГА.
Выявление, идентификацию и количественное определение антител к вирусу ящура РРИД, РНГА. РПСК и НРИФ проводят в условиях обычных ветеринарно-диагностических лабораторий.
5). Дифференциальная диагностика. При дифференциальной диагностике ящура необходимо исключить другие заболевания домашних животных с везикулярным синдромом, такие, как везикулярный стоматит, везикулярную болезнь свиней, везикулярную экзантему свиней, катаральную лихорадку овец (табл. 37).
Для дифференциальной диагностики в лабораториях используют диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью, для ящура и везикулярной болезни свиней.
Специфическая профилактика. В нашей стране для специфической профилактики животных применяют:
1. лапинизированную гидроокисьалюминиевую вакцину, которую готовят из вируса, репродуцированного в организме новорожденных крольчат,
2. гидроокисьалюминиевую вакцину из вируса, культивируемого в переживающей ткани слизистой оболочки языка не иммунного к ящуру крупного рогатого скота (метод Френкеля),
3. а также вакцину из вируса, полученного в суспензионной культуре клеток ВНК-21/13.
Вакцины содержат инактивированный формалином вирус и сообщают иммунитет взрослым животным по 4 мес. В настоящее время с целью повышения иммуногепных свойств лапинизирования ГОА-вакцина в качестве адьюванта содержит сапонин и выпускается в концентрированном виде.
Для свиней используют противоящурную эмульгированную вакцину из лапинизированного вируса Аг22. В экспериментальных условиях она предохраняет 70—80% свиней после контрольного заражения вирусом ящура.
Молодняк, родившийся от иммунных животных, получает пассивно антитела с молозивом. Молодняк, полученный от многократно вакцинированных коров, имеет достаточно напряженный иммунитет в течение 4 мес.
Живые вакцины для профилактики ящура не применяются.
В СССР был создан противоящурный институт под Москвой в г.Владимире. Сейчас он носит название ВНИИ защиты животных.
Иммунитет. Продолжительность иммунитета у животных, переболевших ящуром, составляет 8—12 мес (КРС), у свиней — 10—12 мес, у овец—около 18 мес. Отдельные животные-реконвалесценты приобретают некоторую устойчивость против гетерологических типов вируса. Молодняк, родившийся от иммунных матерей, получает пассивный иммунитет, через молозиво – колостральный. При ящуре возникает тканевый и гуморальный иммунитет. Местный иммунитет формируется раньше, чем гуморальный, но он короче. Поэтому при реинфекции через 4—7 мес на месте введения вируса образуются афты, но генерализации процесса не происходит. Установлено, что при ящуре комплекс защитных реакций организма начинает действовать с момента контакта возбудителя со слизистыми оболочками организма животного, обусловливая определенную закономерность в развитии специфического местного иммунитета. При парентеральной вакцинации крупного рогатого скота противоящурной вакциной уровень местного иммунитета в большей степени, чем гуморального, зависит от концентрации иммунизирующего антигена вируса и количества адъюванта в прививной дозе. Ревакцинация животных даже меньшим, чем прививаемая доза, объемом вакцины способствует усилению местного иммунитета, в то время как уровень вируснейтрализующих антител в сыворотке крови остается неизменным. Это, видимо, указывает на относительную автономность местного иммунитета у крупного рогатого скота при профилактической вакцинации.