Методы дифференцировки видов гемоглобина. Для разграничения отдельных типов человеческого гемоглобина пользуются электрофорезом на блоке крахмала, на крахмальном геле, на геле агара, на целлюлозно-ацетатных листах, на акриламидном геле, на карбоксиметилцеллюлозном геле, электрофорезом при высоком напряжении тока. 2. Вторым по значению методом, которым пользуются в настоящее время для дифференциации отдельных видов гемоглобина, является хроматография 0. Особенно хорошие результаты получается при употреблении в качестве адсорбирующего вещества ионообменной смолы амберлита и ионообменный декстрановый гель. На рис. 17 даны характеристики различных типов гемоглобина, полученных при применении амберлита при рН6,0. 3. Для разграничения некоторых видов гемоглобина пользуются также их растворимостью в некоторых растворителях 0. Наиболее известным тестом этой группы является проба Итано для доказательства наличия HbS. При этой пробе нам служит то обстоятельство, что редуцированный HbS осаждается в 2,24 m буфере, в противоположность другим типам гемоглобина рис. 18. Проба эта имеет значение в особенности для дифференцирования HbS и HbD, потому что, как видно из рис. 18, HbS и HbD обладают одинаковой электрофоретической и хроматографической подвижностью. 4. Для отличия HbA от HbF пользуются, как было подчеркнуто выше, устойчивостью при денатурации растворами натриевой щелочи.
Это известный в истории метод, которым Кербер в 1886 году дифференцировал HbA и HbF. 5. Гемоглобины группы F HbF, Hb Феллас, Hb Александра и Hb Бартс отличается от других гемоглобиновых типов и по своей характерной триптофановой полосе при 289,8 нм ультрафиолетового спектра.
Гемоглобины, обладающие группой М, не имеют абсорбционной полосы при длине волны 630 нм, но зато показывают увеличенную абсорбцию при 600 нм. 6. Отпечатковый метод 0 .Дело касается важнейшего метода установления первичной структуры гемоглобина при различных гемоглобиновых типах.
Исследуемый гемоглобин гидролизуют трипсином, при чем полипептидные цепи глобиновой молекулы распадаются на большое число пептидов.
Пептидную смесь подвергают электрохроматографии на бумаге, т.е. в одном направлении проводится электрофоретическое, в другом хроматографическое разделение.
Получаются характерные для отдельных типов гемоглобинов электрохроматограммы, по которым их можно точно различить рис. 19. Определение аминокислотного состава отдельных пептидов дает возможность первичную структуру глобина соответствующего гемоглобинового типа. Делая аналогию с соответствующей по сложности и точности криминалистической техникой для изучения отпечатков пальцев рук, он был назван пальцеотпечатковым fingerprint методом. 7. Для определения состава полипептидных цепей в каком-нибудь гемоглобиновом типе можно воспользоваться и так называемым 2рекомбинационным 0 или 2гибридизационным 0 методом.
Если смешать известный и неизвестный гемоглобин при рН 4,3, они диссоциируют полумолекулами, состоящими из соответствующих пар полипептидных цепей. После нейтрализации раствора полипептидные пары снова комбинируются в целые гемоглобиновые молекулы, при чем могут получится и новые гибридные гемоглобиновые молекулы.
Их идентифицирование электрофоретическим способом или хроматографией позволит сделать заключение о полипептидной структуре неизвестного гемоглобинового типа. Этот метод предназначен также преимущественно для научных исследовательских целей. 8. 2 Иммунологические методы. 9. Кроме вышеуказанных методов при дифференциации отдельных типов гемоглобина пользуются также 2различиями в 2кристаллическом строении, изоэлектрической точке и т.д. 10. Разработаны также методы 2цитологического определения типа гемоглобина в эритроцитах на мазке крови.
Так наличие HbF в эритроцитах можно доказать путем обработки кровяного мазка лимоннокислой буферной смесью с рН 3,2-3,6. При этих условиях HbA извлекается и эритроциты, в которых он преобладал, остаются только в виде эритроцитных теней, тогда как HbF сохраняется и эритроциты, содержащие преимущественно этот тип гемоглобина, сохраняют свое содержание.8