Правила забора материала на исследование. В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения 535 от 22.04.1985 г. и 8 от 19.01.1995 г. задачи по совершенствованию и унификации диагностической базы возлагаются прежде всего на лабораторию клинической микробиологии.
Поэтому микробиологические аспекты деятельности больничного эпидемиолога на практике сводится к организации и контролю правильного взятия, хранения и транспортировки материала для микробиологического исследования. Биологический материала микробиологических методов исследования следует брать в максимально стерильных условиях, тщательно соблюдая правила асептики и по возможности избегая контаминации образцов микроорганизмами из окружающей среды.
Образцы для посевов необходимо брать до начала лечения антибактериальными препаратами или в интервалах между примом антибиотиков не менее 12 часов. Отобранный материал должен быть маркирован и как можно быстрее доставлен в микробиологическую лабораторию. При необходимости образцы помещают в транспортную среду. Некоторые образцы требуют хранения при t 37, другие при пониженной холодильнике. 5. В микробиологических исследованиях применяются следующие питательные среды 1. Для определение общего микробного числа микроорганизмов используется чаще всего 1 пептонную воду или мясопептонный бульон МПБ. 2. Для обнаружение стафилококков используется - молочно-солевой агар к 1 л мясопептонного бульона добавляют 65 г хлорида натрия и 20 г сухого агар-агар. Разливают по колбам и стерилизуют при 120гС 20 мин. Перед посевом к расплавленному и охлажденному до 45С агару добавляют 10 стерильного молока, равномерно смешивают и разливают в чашки Петри желточно-солевой агар Чистоковича. 100 мл желточной эмульсии один желток, размешанный в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия вливают в 300 мл расплавленного и охлажденного до 50С мясопептонного и разливают в стерильные чашки Петри молочно-желточно-солевой агар. В 1 л дистиллированной воды растворяют при нагревании сухой питательный агар в количестве, указанном на этикетке банки, и 90 г хлорида натрия разливают в колбы, стерилизуют при 120С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и остуженный до 50С агар добавляют 60мл стерильного молока, один желток тщательно разбитый стеклянными бусами с 50 мл изотонического раствора хлорида натрия, полимиксин М 300 000 ЕД. Среду перемешивают и разливают в чашки по 20-25 мл для использование при подращивании стафилококков на мебрананных фильтрах и по 12-15 мл тонким слоем для прямого посева. 3. Для обнаружение бактерий группы кишечных палочек - используется глюкозопептонную воду ГПС, среда Эйкмана.
Концентрированная среда в 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия, 50 г глюкоза, нагревают смесь до кипения, фильтруют, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 мл в колбы емкостью по 100-250 мл с поплавками и по 1 мл в пробирки с поплавками. В среду можно добавить индикатор Аедреде кислый фуксин, обесцвеченный щелочью или бромтимоловый синий.
Разведенную среду глюкозопептонной воды готовят так же, как концентрированную, но количество ингредиенов в 10 раз меньше на 1 л воды. Лактозо-пептонную среду готовят так же как ГПС, с заменой глюкозы на лактозу.
Среды стерилизуют при 112С 12 мин среду Эндо. Среду готовят из сухого порошка по прописи, указанной на этикетке банки. Состав порошка сухой мясо-пептонный агар, лактоза, основной фуксин, сульфит натрия.
Среду готовят в день ее использования.
Горячую среду различают в стерильные чашки Петри и оставляют до застывания на поверхности стола. Хранить чашки со средой можно не более 3 дней в темном месте или в холодильнике среду Эндо с молоком по Г. П. Калине.
Среду готовят из сухого порошка, но воды берется меньше к 90 мл среды добавляют 10 мл стерильного молока, 0,2 мл 10 спиртового раствора основного фуксина, 0,2 мл 5 спиртового раствора розоловой кислоты, тщательно перемешают зоны просветления при выпадении в осадок параказена желточно-лактозный бульон с бриллиантовым зеленым. К 700 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 10 г лактозы, 200 мл желчи, 13,3 мл 1 водного раствора бриллиантового зеленого и доливают по 5 мл в пробирки с поплавками, стерилизуют при 112С 12 мин среду ФКП-1. Среду готовят так же, как желточнолактозный бульон, но только лактозы берут 1 г и добовляют 1 г триптофана среду Хейфеца.
В 1 л воды растворяют при нагревании 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. Устанавливают рН 7,4-7,6, фильтруют и добавляют 10 мл 5 спиртового раствора розоловой кислоты, 23 мл 0,1 влного раствора метиленового синего. Стерилизуют при 100С текучим паром 20 мин. Зазливают в стерильные пробирки и скашивает со столбиком.
Цвет среды краснофиолетовый среду Кесслера. К 1 л воды добавляют 10 г пептонна, 50 мл желчи, кипятят 20-30 мин, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем до 1 л, устанавливают рН 7,8-8,2 и добавляют 4 мл 1 водного раствора генциального фиолетового. Среди разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 15 мин. Среда фиолетового цвета. Среда применяется при исследовании почвы лактозный бульон с борной кислотой 4. Для обнаружение энтерококков используется - щелочно-полимиксиновая среда.
Приготавливают три раствора по следущим рециптам ИнгредиентыОбычная концентрацияУдвоенная концетрацияРаствор 1 - мясопептонный бульон40 мл70 мл- хлорид натрия0,5 г1 г- глюкоза1 г1 г- дрожжевой экстракт жидкий или сухой2 мл 0,2 г4 мл 0,4 гРаствор 2 - вода дистилли-рованная25 мл12,5- карбонат натрия0,53 г1,1 гРаствор 3 - бикарбонат натрия0,25 г0,5- вода дистилли-рованная25 мл12,5 мл- полимиксин20000 ЕДмл40000 ЕДмл- 1,6 спиртовый раствор бромтимоло-вого синего0,5 мл1 мл Раздельно стерилизуют растворы 1, 2 и 3 при 112С 12 мин. Растворы смешивается, устанавливают рН 10,0-10,2, добавляют полимиксин, бромтимоловый синий, разливают по 10, 50 и 100 мл во флаконаы удвоенной концентрации молочно-ингибиторная среда Калины.
К 85 мл стерильного питательного агара добавляют 15 мл стерильного молока, 1,25 мл 0,01 водного раствора кристаллического фиолетового. Перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри желчная среда, среда Турчинского.
К 600 мл дистиллированной воды добавляют 400 мл желчи, 35-40 г сухого питательного агара, по 5 г фосфата калия однозамещенного си двузамещенного, 5 г натрий-аммония фосфата. Расплавляют при нагревании, разливают по флакон и стерилизуют при 120С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный остуженный агар добавляют на каждые 100 мл среды 0,5 г глюкозы, 1 мл 1 водного раствора TTX, 0,6 мл 1 водного раствора синего, 20000 ЕД полимиксина М, 1-2 мл 0,1 спиртового раствора фурацилина.
Разливают по 20 мл в чашки Петри толстым слоем азидная среда Сланеца-Бкртли. В 1 л дистиллированной воды растворяют при нагревании 30-40 г скхого питательного агара, 4 г фосфата калия однозамещенного, устанавливают рН 7,0 стерилизуют при 120С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар на каждые 100 мл среды добавляют 2 мл дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 0,04 г азида натрия, 1 мл 1 водного раствора TTX. Смешивают и быстро разливают в чашки Петри по 2 мл. 5. Для обнаружение патогенных энтеробактерий спользуется - селенитовый бульон.
Бульон готовят из сухой среды Луйфсона по прописи на этикетке. При необходимости ее можно приготовить следующим образом. Основной раствол в 1 л воды растворяют 7 г фосфата натрия двуузамещенного безводного, 3 г фосфата натрия однозамещенного, 5 г пептона и 4 г лактозы. Устанавливают рН не выше 7,0. Стерилизуют при 112С 30 мин. Перед началом работы 2 мл 10 раствора стерильного кислого селенистокислого натрия.
Готовую среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл тетратионатный бульон Мюллера. К 90 мл стерильного мясопептонного бульона добавляют 4,5 г стерильного мела, 2 мл раствора Люголя, 10 мл гипосульфата натрия. При приготовлении раствора Люголя к 20 мл дистиллированной воды добавить йодида калия 20 г, йода 25 г, а за тем долить до 100 мл воды. Среда предназначена для накопления в материале сальмонелл тетратионатная среда с бриллиантовым зеленым среда Кауфмана. К 500 мл тетратионатной среды добавляют 25мл стерильрой жклчи и 5 мл 0,1раствора бриллиантого зеленого.
Среда служит для накопления сальмонелл трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому. Среда является дифференциально-диагностической. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 2,5 г сухого питательного агара, 1 г лактозы, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 соли Мола, 0,03 г тиосульфата натрия, 0,4 мл 0,4 водного раствора фенолового красного. Все тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,2-7,4, разливают по пробиркам, стерилизуют текучим паром по 20 мин 3 дня подряд.
Среду скашивают, оставляя столбик высотой 5 см. Среда после стерилизации бледно-розового цвета среда Ресселя. К 100 мл 1,5 мясопептонного агара добавляют 1 лактозы, 0,1 глюкозы и 1 мл индикатора Андреде кислый фуксин, обесцвеченный едким натром или смесь водного голубого и розоловой кислоты. Устанавливают рН 7,2. Среду разливают в пробирки, стерилизуют при 112С 20 мин и скашивают, оставляя столбик агара высотой 2-3 см. 6. Для обнаружение иерсиний используется - буферная среда обогащения.
Предварительно готовят растворы солей 3 мл 115 М гидрофосфата натрия в 100 мл дистиллированной воды и 7 мл 115 М дигидрофосфата натрия, также в 100 мл. Затем добавляют 8,5 г хлорида натрия, доводят общий объем воды до 1 л, фильтруют, устанавливают рН 7,2, разливают в пробирки по 5-6 мл и стерилизуют текучим паром 30 мин. 7. Среды для контроля стерильности - сахарный бульон Хоттингера. К мясному перевару Хоттингера 140-160 мг амминного азота добавляют 0,5 хлорида натрия, подщелачивают до рН 8-8,2 с помощью 10 раствора едкого натра, кипятят 10 мин и фильтруют через ватный фильтр.
Затем в среду вносят 1 глюкозы, устанавливают рН 7,3-7,5, с помощью 5 хлористоводородной кислоты, фильтруют через бумажный фильтр и разливают в стерильные колбы или пробирки. Стерилизация при 120 С 30 мин бульон Сабуро. В 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, кипятят 10 мин и фильтруют через бумажный фильт. Затем добавляют 4 глюкозы или мальтозы, устанавливают рН 5,7 разливают в стерильные колбы и пробирки. стерилизация при 112 С 30 мин тиогликолевая среда.
К 1 л дистиллированной воды добавляют 15 г гидролизата казеина, 5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г хлорида натрия, 0,75 г цистина, 0,75 г агар-агара. Цистина предварительно растворяют в небольшом количества воды с помощью едкого натра. Устанавливают рН смеси всех компонентов до 8-8,2, кипятят 5-10 мин до полного расплавления агара. Затем добавляют 5 г глюкозы и 0,3 мл тиогликолевой кислоты.
Среду фильтруют, устанавливают рН 7,2-7,3 вносят 1 мл раствора резазурина натрия 11000, перемешивают и разливают в стерильные пробирки. стерилизация при 120 С 20 мин.