Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека

Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека. Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание, протекающее с внутриклеточным (в макрофагах) паразитированием микобактерий [Myrvik Q. N. et al 1984]. Несмотря на самую современную химиотерапию, лечение туберкулеза, как правило, бывает длительным и не всегда эффективным.

Одной из причин безуспешного лечения данной инфекции по общепринятому мнению является недостаточная эффективность защитных механизмов макроорганизма, в значительной мере генетически обусловленных.

Сведения об участии иммунной системы, складывающихся межклеточных взаимодействиях, накопленные за последние десятилетия, изменили (уточнили) представления о патогенезе туберкулеза.

Туберкулез чаще всего развивается в результате заражения МБТ, которые выделяет в окружающую среду больной человек. Респираторный тракт, а так же кишечник являются входными воротами инфекции.

Таким образом, основной путь проникновения патогена - аэрогенный, но возможен и алиментарный.

Определенную роль при аэрогенном заражении играет система мукоцилиарного клиренса, позволяющая вывести попавшие в бронхи частицы пыли, капельки слизи, слюны, мокроты, содержащие микроорганизмы. Аналогичным образом, при алиментарном пути проникновения микобактерий защитную роль играет переваривающая функция желудочно-кишечного тракта. После проникновения патогена в легкие важную роль в защите от инфекции играют альвеолярные макрофаги. Эти клетки непосредственно подавляют рост бактерий, фагоцитируя их, а также они участвуют в реакциях клеточного противотуберкулезного иммунитетах [Авербах М.М. и др 1982; Литвинов В.И. и др 1983; Myrvik Q. N. et al 1984]. Процесс фагоцитоза можно разделить на несколько следующих друг за другом этапов. В первую очередь бактерия прикрепляется к фагоциту, затем следует фаза поглощения микроорганизма, и как следствие ингибиция роста или уничтожение инфекта.

Процесс прикрепления микобактерий к фагоцитам осуществляется посредством рецепторов комплемента, маннозных рецепторов и других рецепторов клеточной поверхности макрофага.

Взаимодействие между маннозными рецепторами и инфектом происходит при помощи гликопротеина клеточной стенки микобактерий, имеющего маннозный остаток на обращенной во внешнюю среду части молекулы [Schlesinger L. S 1996]. Мутации генов, белковые продукты которых вовлечены в механизмы иммунологической защиты, определяют степень резистентности к инфекциям. Маннозо-связывающий белок (МВР) является Са-зависимым белком плазмы крови.

Выявлено, что у человека этот белок осуществляет функцию активатора системы комплемента, кроме того, он действует непосредственно как опсонин, взаимодействуя с рецепторами макрофагов [Hill A.V.S 1998]. Исследовали взаимосвязь полиморфизма гена МВР с чувствительностью к легочному туберкулезу в Индии. Анализ показал, что с туберкулезом ассоциированы три точечных замены в исследуемом гене [Selvaraj P. et al 1999]. Аналогичное исследование, проведенное в Гамбии, выявило связь полиморфных вариантов данного гена с развитием легочной формы туберкулеза [Bellamy R. et al 2000]. Фагоцитирующая клетка выбрасывает окружающие микроорганизм псевдоподии, которые затем сливаются на периферии, образуя окруженную мембраной вакуоль [Ерохин В.В 1974; Leake E.S Myrvik Q.N 1971]. Микобактерии, находящиеся в фагосоме попадают под воздействие целого ряда неблагоприятных факторов, направленных на их уничтожение.

К таким факторам можно отнести слияние фагосомы с лизосомами, содержащими литические ферменты [Jeckett P. S. et al 1978]. Так же макрофаг способен производить реактивные радикалы кислорода и азота, играющие, вероятно, основную роль в уничтожении инфекта внутри макрофага [Nelson N 1999]. Установлено, что "нокаутированные" по гену индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2) мыши не способны противостоять туберкулезной инфекции, у них наблюдался усиленный рост M. tuberculosis в легких, селезенке и печени.

Макрофаги этих мышей не производили NO и инфекция распространялась [Jackett P. S. et al 1978; Walker L Lowrie D. B 1981]. Если макроорганизм не в состоянии устранить внутриклеточно размножающихся микобактерий, то в результате хронического воспаления в месте освобождения антигенов происходит скопление большого числа макрофагов, которые выделяют фиброгенные факторы и стимулируют образование грануляционной ткани и фиброза.

Возникшая гранулома представляет собой попытку организма ограничить распространение персистирующей инфекции.

Однако при интенсивном размножении микобактерий в организме человека и малоэффективном фагоцитозе выделяется большое количество токсичных веществ и индуцируется гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), которая способствует выраженному экссудативному компоненту воспаления с развитием казеозного некроза. В процессе разжижения казеозных масс микобактерии получают возможность бурного внеклеточного размножения, что обусловливает прогрессирование туберкулеза [Ройт А 1991, 2000]. Важную роль в противотуберкулезной защите играет, секретируемый макрофагами и моноцитами цитокин - фактор некроза опухолей (TNF). Он принимает участие в индукции формирования гранулемы, а так же способствует активации Т-клеток, тем самым повышая антибактериальную активность макроорганизма [Kindler V. et al 1989; Mohan V. P. et al 2001]. На модели мышей с "нокаутированным" геном, кодирующим рецептор для TNF, продемонстрировано существенное значение фактора некроза опухолей для выживания в условиях туберкулезной инфекции [Flynn J. L. et al 1995]. В настоящее время известно несколько мутаций гена TNFА, находящегося в локусе главного комплекса гистосовместимости, однако их связь с туберкулезом не выявлена.

Так, в небольшом исследовании, проводившемся в Гамбии, не обнаружили ассоциации полиморфизма 308G/A гена TNFА с клинически подтвержденным туберкулезом.

Такой же результат был получен при поиске взаимосвязи полиморфизма гена TNFА c туберкулезом в Бразилии [Knight J. C Kwiatkowski D 1999]. При поиске конкретных генетических систем, отвечающих за развитие восприимчивости или резистентности к туберкулезу, в первую очередь обращалось внимание на главный комплекс гистосовместимости человека - HLA-систему, в которой расположены гены иммунного ответа. При этом продукты данного комплекса - антигены HLA - выступали в качестве биологических маркеров.

Результаты анализа ассоциаций аллелей HLA-комплекса с туберкулезом показали связь DR-локуса с заболеванием, к тому же выявили высокую рассовую и этническую специфичность.

В русской популяции заболевание ассоциировалось с В5, В14 и В17 антигенами HLA-комплекса [Хоменко А.Г 1996]. Вероятно, гены комплекса HLA оказывают влияние на восприимчивость к туберкулезу, регулируя силу иммунного ответа и обуславливая этнические различия в подверженности ТБ. Также была выявлена ассоциативная взаимосвязь ряда генетических маркеров - фенотипов крови с возникновением туберкулеза и с характером уже возникшего заболевания.

Анализировали распределение фенотипических и генных частот 9 генетических локусов белков крови: ингибитора протеаз, трансферрина, фосфоглюкомутазы 1, кислой эритроцитарной фосфотазы 1, гаптоглобина, витамин-Д-транспортирующего белка, глиоксалазы 1, комплемента и эстеразы Д. При этом выявили существование различий между больными туберкулезом легких и практически здоровыми людьми. Эти различия выражаются в накоплении у больных туберкулезом одних фенотипов и в уменьшении частот других фенотипов.

Следует отметить, что полученный эффект касался в основном одних и тех же 6 белковых локусов, что подтверждает их реальное значение в дифференциации между больными ТБ и здоровыми людьми [Богадельникова И.В 1999]. С целью картирования генов предрасположенности к туберкулезу группа исследователей провели широкомасштабное сканирование генома с использованием 299 высокоинформативных ДНК - маркеров у 173 пар сибсов, полностью конкордантных по развитию туберкулеза [Bellamy R. et al 2000]. При этом выявили 2 локуса предрасположенности - на длинных плечах хромосомы 15 и Х [Cervino A.C.L. et al 2002]. На основании экспериментальных исследований, проведенных А.М. Морозом и В.Г. Торонджадзе (1977), были выявлены две линии мышей, оппозитные по своей чувствительности к туберкулезной инфекции.

У резистентных линий после внутривенного заражения микобактериями туберкулеза наблюдаются длительный латентный период и медленное развитие инфекционного процесса, выражающееся в персистенции микобактерий на фоне незначительных гранулематозно измененных тканей, не приводящих к гибели животных.

В то же время заражение мышей чувствительной линии приводит к быстрому размножению микобактерий в тканях, образованию гранулем в легких, селезенке, печени и быстрой гибели животных [Авербах М.М. и др 1980; Мороз А. М 1984]. На этих линиях исследователи изучили некоторые механизмы естественной резистентности и приобретенного иммунитета и высказали предположение, что устойчивость к инфекциям во многом зависит от способности макрофагов подавлять рост микобактерий в своей цитоплазме. Проведенные позднее эксперименты на 60 мышах двух линий, одна из которых чувствительна, другая устойчива к туберкулезной инфекции, полностью подтвердили данное предположение [Ельшанская М. П. и др 1985]. Важнейший этап патогенеза туберкулеза - персистенция возбудителя в фагосомах макрофагов.

Макрофаги поглощают патоген в очагах воспаления, но часто теряют способность элиминировать его в лизосомах, что в итоге приводит к их массированному внутриклеточному размножению и последующему выходу из погибших клеток.

Получены данные, свидетельствующие о том, что имеются существенные различия в судьбе фагосом, содержащих вирулентные и авирулентные микобактерии, поскольку только первые препятствуют их слиянию с лизосомами [Myrvik Q. et al 1984; Frenkel G. et al 1986]. С точки зрения развития новых подходов к лечению туберкулеза очевидна необходимость контроля прохождения микобактерий по эндосомально-лизосомальному пути: от ранней эндосомы - к поздней, от поздней эндосомы - к лизосоме. 1.3 Физиологические функции белковых продуктов генов-кандидатов подверженности туберкулезу, их роль в патогенезе заболевания Одним из генов предрасполагающих к развитию туберкулеза является NRAMP1 (от англ. Natural-Resistance-Associated Macrophage Protein 1 gene - ген макрофагального протеина 1, ассоциированного с естественной резистентностью). Более того, R. Bellamy и соавт. (1998) отнесли NRAMP1 к основным кандидатным генам туберкулеза у человека. Белковый продукт этого гена имеет вес около 60 кД, он локализован в лизосомальном компартменте покоящегося макрофага, но во время фагоцитоза он работает на мембране фагосомы [Gruenheid S. et al 1997]. Nramp1 участвует в процессах активации макрофагов, являясь ключевым звеном в механизме транспорта нитритов из внутриклеточных компартментов в более кислую среду фаголизосомы, где он способен вступать в химическую реакцию с образованием NO [Blackwell J. M Searle S 1999]. Белок входит в семейство функционально связанных мембранных белков (к этому семейству относят также Nramp2), ответственных за транспорт двухвалентных катионов, таких как Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ [Jabado N. et al 2000; Cellier M. et al 2001]. Известно, что ионы металлов являются жизненно важными элементами, участвующими во многих метаболических реакциях, происходящих в каждой живой клетке. Следовательно, недостаток, избыток или отсутствие данных элементов может привести к развитию какого-либо патологического состояния или даже к гибели клетки.

Постоянство ионов металлов в организме обеспечивается регуляцией их потребления, хранения и выведения.

Для того чтобы поддерживалась необходимая концентрация ионов, каждая клетка обладает определенной системой, обеспечивающей транспорт веществ через мембрану.

Сбой этой системы или ее части может повлечь за собой потерю равновесия между выведением и поступлением веществ, что приведет к изменению внутриклеточной концентрации ионов.

Недостаточный транспорт ионов может оказаться причиной нехватки жизненно важных метаболических элементов, а чрезмерное их накопление может вызвать токсическое воздействие этих же веществ, ведущее к гибели клетки.

Возможно, что антибактериальная функция Nramp1 заключается в создании неблагоприятной для бактерии окружающей среды внутри фагосомы [Gruenheid S. et al 2000; Barton C.H. et al, 1999]. Во время фагоцитоза микроба макрофаг продуцирует активные кислородные метаболиты, которые являются токсичными для бактерии.

Выживание патогена во время кислородозависимой перестройки метаболизма фагоцита обеспечивается микробными ферментами, большинство из которых содержат ионы металлов в своих активных центрах [Cellier M. et al 1994]. В свою очередь истощение запаса ионов металлов в фагосоме, вызванное транспортной деятельностью макрофагального белка ассоциированного с естественной резистентностью, приводит к снижению продукции металлосодержещих ферментов поглощенной бактерией.

Следовательно, дефекты продукции или функции Nramp1 могут приводить к нарушению его транспортной функции и, как следствие, к повышению чувствительности к внутриклеточным патогенам, таким как микобактерии (рис. 1) [Barton C.H. et al 1999]. Рис. 1. Схема антибактериального действия NRAMP1 [по Пальцеву М.А 2002] Опыты, проведенные на инбредных мышах, показали, что уровень естественной резистентности к внутривенному заражению низкими дозами M. bovis (BCG) контролируется одним геном, локализованным в проксимальном регионе мышиной хромосомы 1. Этот локус обозначили как Bcg (также он известен как Lsh или Ity). Два различных фенотипа Bcg были ассоциированны с чувствительностью (Bcg-s) и с резистентностью (Bcg-r) на ранней стадии инфекции, вызванной M. bovis, M. avium, M. lepraemurium, Leishmania donovani, Salmonella typhimurium [Bredley D.J 1977; Forget A. et al 1981]. Экспериментальные исследования показали, что через 3 недели после заражения 10 КОЕ M. bovis (BCG) из селезенки мышей Bcg-s высевается на 3-4 порядка больше микобактерий, чем из селезенки мышей Bcg-r [Gros P. et al 1981].Результаты исследований на моделях мышей позволили утверждать, что высокая чувствительность линий мышей Bcg/Lsh/Ity к заражению внутриклеточными патогенами объясняется дефектом локализованного на 1-ой хромосоме гена в локусе Bcg [Blackwell S.M. et al 1994; Skamene E 1994]. При помощи позиционного клонирования изолировали кандидатный ген и обозначили его как Nramp1 [Vidal S.M. et al 1993]. Позже было подтверждено, что Nramp1 и ген, расположенный в локусе Bcg, идентичны [Govoni G. et al 1996]. У лабораторных мышей ген Nramp1 имеет 2 аллеля Nramp1-s (восприимчивый, рецессивный) и Nramp1-r (резистентный, доминантный) [Malo D. et al 1993]. Секвенирование матричной РНК Nramp1 от восприимчивых и резистентных линий мышей показало, что подверженность к инфекции связана с заменой глицина на аспарагиновую кислоту в позиции 169 (G169D) внутри 4-ого трансмембранного домена белка [Malo D. et al 1994]. Элиминация функции Nramp1 у "нокаутированных" мышей (Nramp1-/-) приводит к повышению восприимчивости к группе бактериальных возбудителей, хорошо адаптированных к выживанию в макрофаге [Govoni G Gros P 1998]. Однако нельзя не учитывать, что в выше перечисленных экспериментах на мышах использовался штамм M. bovis (BCG), а он является авирулентным для человека. Более того, E. Medina и R. North (1998) показали, что в то время как Nramp1 действительно контролирует резистентность мышей к заражению M. bovis, резистентность к заражению M. tuberculosis, вероятно, не связана с мутациями данного локуса.

Мыши с мутантным (чувствительным к заражению M. bovis) фенотипом не отличались по чувствительности к заражению M. tuberculosis от мышей с резистентным (дикого типа) фенотипом. Учитывая полученные результаты, G. Govoni и P. Gros (1998) сделали вывод, что возбудители, не попадающие под контроль Nramp1, либо отличаются своим поведением внутри макрофага, либо не являются внутриклеточными паразитами.

Эти данные свидетельствуют, что Nramp1 играет важную роль в резистентности к микобактериям и некоторым другим возбудителям инфекций у мышей, а его человеческий гомолог, вероятно, связан с подобными инфекциями у людей.

Такой человеческий гомолог гена Nramp1, обозначенный как NRAMP1, клонировали и картировали на человеческой хромосоме 2q 35 [Cellier M. et al 1996]. В данном гене содержится 15 экзонов различной протяженности, разделенных интронами, размер которых также широко варьирует [Marquet S. et al 2000]. Описано 9 полиморфных вариантов гена NRAMP1, которые, вероятно, влияют на функцию гена [Liu J. et al 1995]. С целью изучения функции гена было проведено исследование различных полиморфизмов NRAMP1 у западных африканцев в Гамбии всвязи с туберкулезом в местной популяции.

Четыре полиморфизма гена - 5`(CA)n, INT4, D543N, 3`UTR были ассоциированы с туберкулезом (р=0,03; р=0,009; р=0,008; р<0,001 соответственно). 5`(CA)n 201 п.о. аллель находился в неравновесии по сцеплению с одним из аллелей полиморфизма INT4 (Р<0,001). Полиморфизм D543N также проявил неравновесие по сцеплению с делецией в 3`UTR регионе гена (р<0,001). Аллельные варианты INT4 и 3`UTR гена NRAMP1 были незначительно связаны друг с другом и статистически значимо ассоциированы с туберкулезом [Bellamy R. et al 1998]. Таким образом, при изучении связи NRAMP1 с туберкулезом у африканцев было обнаружено, что изменчивость данного гена связана с вариабельностью восприимчивости к туберкулезу.

Аналогичным образом, было проведено изучение различных полиморфных вариантов гена NRAMP1 в корейской популяции.

Материалом для исследования послужили образцы крови от 192 пациентов с лабораторно подтвержденным туберкулезом легких.

Как показал анализ, в исследуемой этнической группе туберкулез был ассоциирован с полиморфизмом 3`UTR гена NRAMP1 [Ryu S. et al 2000]. По всей видимости, отличия в модели аллельной ассоциации гена с туберкулезом можно объяснить генетической гетерогенностью разных этнических групп. Так, например, анализ японской популяции показал различия в ассоциации гена с туберкулезом в двух группах пациентов: первая - жители города Токио, вторая - жители города Осака. Была обнаружена слабая зависимость между полиморфизмом D543N и туберкулезом в популяции Токио (р=0,045), и, напротив, имелась существенная связь с полиморфизмом (GT)n гена NRAMP1 в обеих популяциях [Gao P.S. et al 2000]. К тому же была показана ассоциация полиморфизма D543N гена NRAMP1 с формированием деструкции при туберкулезе [Abe T. et al 2003]. Для полиморфизмов D543N и 3`UTR найдена ассоциация с туберкулезом (р=0,041, р=0,030 соответственно) в китайской популяции [Liu W. et al 2004].