Микробиологическая диагностика

Клинический диагноз респираторных заболеваний не составляет трудностей. Однако для проведения антимикробной терапии и эпидемиологических целей необходимо знание этиологического агента и его свойств, что может быть установлено только с помощью микробиологического исследования.

Микробиологический диагноз специфических респираторных инфекций устанавливают с помощью специальных методов.

Этиологическая диагностика оппортунистических инфекций основана на применении микроскопического, бактериологического и серологического методов.

Микроскопический метод применяют в качестве ориентировочной экспресс-диагностики, а также для выбора основного направления бактериологического исследования. Чувствительность и специфичность этого метода повышается при использовании реакций иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа.

Серологический метод используют чаще при затяжных и хронических формах. В связи с полиэтиологичностью заболеваний и выраженной мозаичностью возбудителей в качестве диагностикума используют количественно доминирующие аутокультуры. Поскольку последние нередко являются представителями нормальной микрофлоры, к которым в организме обычно имеются антитела, реакции ставят в динамике. Результаты серологического метода в меньшей степени зависят от этиотропной терапии по сравнению с другими методами. К недостаткам метода относят ретроспективность результатов и сложность получения диагностических препаратов при изучении антителогенеза.

Ведущим методом диагностики считают культуральный, так как он позволяет более точно установить возбудителя (-лей), а также определить антибиотики и антисептики, к которым чувствителен возбудитель. Метод используется при острых и хронических процессах. Главной особенностью применения метода в современных условиях является определение количества присутствующих в материале микробов. Чувствительность, специфичность и достоверность метода также зависят от срока и строгого соблюдения правил забора и доставки материала, широты спектра использованных сред, достаточной выборки идентифицируемых культур, использования современных тестов для идентификации выделенных культур.

Материалом служит мокрота, промывные воды бронхов (ПВБ), бронхиальный секрет, взятый при бронхоскопии (БС), плевральный экссудат, пунктат инфильтрата или абсцесса легкого, кровь. Мокрота является наиболее доступным материалом, но ценность ее как материала для исследования снижается тем, что она обильно обсеменена микрофлорой полостей рта и глотки, часто возникают сложности с ее получением, особенно у детей, микробы в ней распределены неравномерно.

ПВБ - более стандартный материал, получаемый в любое время у разных категорий больных. Рекомендуют брать при отсутствии мокроты или же параллельно с нею.

Бронхиальный секрет ценен тем, что не содержит посторонних микроорганизмов, однако его ценность снижается в связи с ограниченным участком исследования и тяжестью процедуры для больного. Пунктаты закрытых процессов, как правило, дают достоверные результаты.

Чаще всего берут мокроту или ПВБ.

Мокроту необходимо забирать на раннем этапе болезни, утром, натощак. Если мокроты выделяется мало, секрецию ее можно усилить ингаляцией теплого гипертонического или щелочного раствора, назначением бронхолитиков. С целью снижения контаминации мокроты микрофлорой глотки и полости рта больной чистит зубы порошком, многократно прополаскивает рот и глотку стерильной водой или физиологическим раствором (без антисептиков!), после чего больной откашливает мокроту в стерильную широкогорлую банку и сразу же закрывает ее стерильной крышкой. Чтобы не допустить попадания больничной микрофлоры в мокроту, желательно ее забор проводить в процедурном кабинете.

ПВБ забирают специально или в сочетании с лечебными процедурами. Больной тщательно прополаскивает глотку и полость рта стерильной водой или физиологическим раствором. Под контролем гортанного зеркала в дыхательные пути вводят 4 мл стерильного физиологического раствора. Откашливаемое содержимое собирают в стерильные широкогорлые банки. Обрабатывают, как мокроту.

БС отсасывают через бронхоскоп или катетер. При вязкой консистенции секрета делают смыв из бронхов физиологическим раствором. Пунктат получают при трансторакальной пункции из очага.

Полученный материал отмывают от неспецифической микрофлоры и гомогенизируют. Слизисто-гнойные комочки отмывают в питательном бульоне трижды с помощью пипетки или на центрифуге.

Гомогенизацию материала проводит с помощью муколитиков, ферментов (трипсином или др.) или механическими способами (в тканевом измельчителе, стеклянными бусами, на магнитной мешалке).

Обработка и посев материала должны проводится не позднее 1-2 часов (до 3 часов при 4-8 ⁰С) после забора материала, так как более длительное пребывание его в условиях комнатной температуры приводит к гибели чувствительных к влиянию внешней среды микробов (пневмококков, пиогенных стрептококков, инфлюэнца-бактерии) и размножению устойчивых.

Из материала готовят мазок, высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму, иногда другими методами (при подозрении на капсульные микробы - по Гинсу-Бурри, на грибы - раствором Люголя и т.д.). При микроскопии обращают внимание на морфологию, тинкториальные свойства, количество микрофлоры, ее расположение (рядом с клетками!), наличие и число гранулоцитов, характерных для воспалительных процессов нижних дыхательных путей. Их отсутствие, а также большое число эпителиальных клеток свидетельствует о неправильном взятии материала (с примесью слюны). Соотношение количества микрофлоры и клеток иногда позволяет ориентировочно судить об этиологической значимости микроба, а иногда - и тяжести или стадии развития заболевания. Например, обнаружение более 10 пар пневмококков в 10 полях зрения считают этиологически значимым. Однако чаще всего метод не позволяет точно решить вопрос об этиологической роли обнаруживаемой микрофлоры, а лишь ориентировочно предположить возбудителя. Так, обнаружение большого количества грамположительных ланцетовидных диплококков, окруженных капсулой, позволяет предположить пневмококковую природу заболевания. При выявлении мелких грамотрицательных кокковидных или нитевидных палочек - гемофильную природу и т.д.

Для посева используют следующие питательные среды: 5% кровяной агар (лучше с кровью животных или отмытые эритроциты человека) или среду ВНИИП (кровяной агар на основе перевара Хоттингера с дрожжевым гидролизатом) - для выделения стрептококков, желточно-солевой агар - для стафилококков, агар с прогретой кровью - для гемофильных бактерий (для сокращения исследования с целью выделения гемофилов на кровяной агар можно накладывать сапонин-бацитрациновые диски. Сапонин вызывает гемолиз - освобождает гемин, бацитрацин угнетает некоторые грамположительные бактерии), среду Левина (Эндо) - для энтеробактерий, среду Сабуро - для грибов. Пунктаты из абсцессов, плевральный экссудат исследуют на наличие анаэробов (посев в среду Китт-Тароцци, среду для контроля стерильности или кровяной агар с культивированием в анаэростате).

Выделение возбудителей проводят двумя методами.

I. Качественный анализ с полуколичественной оценкой численности микрофлоры. Этот метод более простой и быстрый, но недостаточно точный. Из материала забирают 2-3 слизисто-гнойных комочка, трехкратно отмывают в чашках со стерильным физиологическим раствором (для удаления посторонней микрофлоры), после чего равномерно засевают шпателем по поверхности каждой из сред. Точно так же можно засевать 0,1 мл материала (1:10) после отмывки и гомогенизации. Через 18-24 часа культивирования проводят полуколичественную оценку выросших колоний: до 10 колоний - единичные (I степень), от 10 до 25 - скудный рост (П), 50 сосчитываемых колоний - обильный рост (III), сплошной рост - IV. Как этиологически значимые оценивается Ш и IV степень. Далее проводят идентификацию микрофлоры, оценку этиологической значимости, определение чувствительности к антибиотикам.

2. Количественный метод. Готовят серийные десятикратные разведения гомогенизированного материала в питательном бульоне от 10^-1 до 10^-7. Исходный бронхиальный секрет условно считают разведением 10-1. Разведения мокроты или ПВБ 10^-1, 10^-3, 10^-5 засевают шпателем по 0,1 мл на разные чашки c кровяным и шоколадным агаром (или же 10^-2, 10^-4 по 0,05 мл на сектора одной чашки). На остальные среды засевают разведения 10^-1 и 10^-3. Среды инкубируют при 37°С 1-2 суток; среду Сабуро - до 5 суток при 30°С. Посевы на кровяном агаре культивируют в условиях насыщения СО₂. После инкубации изучают характер роста и определяют КОЕ/мл материала. Из 3-5 колоний, взятых из высоких разведений, готовят мазки, окрашивают по Граму. В случае однородности колоний их идентифицируют по схемам для соответствующих возбудителей. При необходимости определяют факторы патогенности (капсулу, ферменты патогенные, токсины и др.).

Результаты оценивают исходя из критериев для условно-патогенных бактерий. Главным критерием является количественный. Этиологически значимым считают такое количество условно-патогенных бактерий (диагностический титр или "критическое число"), которое не встречается у здоровых людей в данном биотопе и которое способно вызвать заболевание. Для мокроты и ПВБ это число составляет следующие величины: для стрептококка пневмонии – 10⁶ и больше, для стафилококка - 10⁵ и больше, для знтеробактерий - 10⁴ и больше, для кандид - 10³ и больше КОЕ/мл материала. Количества на порядок меньшие в случаях доминирования в ассоциации или отсутствия других видов в материале должны быть оценены как возможно патологически значимые.

Кроме количества, для установления этиологической роли выделенных культур в развитии бронхита или другого респираторного заболевания имеет значение повторное (через сутки или несколько часов) выделение аналогичной культуры, обнаружение факторов патогенности у выделенной культуры, нарастание титра антител в процессе болезни к аутокультуре. У этиологически значимых культур определяют чувствительность к антибиотикам и по эпидемиологическим показаниям - эпидемиологические метки (фаго-, серо-, резистено- и колициновары).

В заключении (ответе) указывают вид (виды) и вариант (варианты) возбудителя, их чувствительность к антибиотикам (ориентируясь на наиболее высокие уровни и широкие спектры членов популяции).

Поскольку в процессе болезни часто наблюдается смена видового и вариантного состава возбудителей, через 5-7 дней бактериологическое исследование повторяют по описанной выше методике.