Окраска по Граму.
I этап - приготовление мазка.
Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.
2 этап - высушивание.
Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.
3 этап - фиксация.
Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.
4 этап - окраска.
Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных -окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.
Дифференцирующий метод Грама.
После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+), другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.
Гр+ бактерии кокки | Гр- бактерии кокки |
стафилококки, стрептококки; палочки (спорообразующие): бациллы, клостридии; палочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты | нейссерии, вейллонеллы; палочки (неспорообразующие): энтеробактерии, вибрионы; извитые: спириллы, спирохеты, кампилобактерии. |
Схема окраски бактерий по Граму:
Гр+бактерии | Гр-бактерии | |
1. фиолетовый цвет | 1. фиолетовый цвет | 1.Генцианвиолет (2 минуты) |
2. фиолетовый цвет | 2. фиолетовый цвет | 2.Р-р Люголя (1 мин.); закрепляет окраску. |
3. фиолетовый цвет | 3. обесцвечивание | 3.Этанол+йод (30 сек.); избирательное обесцвечивание Гр-бактерий. |
промывание водой | ||
4. фиолетовый цвет | 4. бордовый цвет | 4.Фуксин (1 мин.); докрашивание Гр-бактерий. |
промывание водой |
После высушивания мазки готовы для микроскопии.
Основные формы бактерий
Шаровидные | Палочковидные | Извитые |
микрококки (одиночные) диплококки (пары) стрептококки (цепочки) тетракокки (4 клетки) сарцины (тюки, пакеты) стафилококки (гроздья) | собственно бактерии спорообразующие (бациллы, клостридии) изогнутые палочки (вибрионы) | спириллы спирохеты кампилобактеры |