Медичні аспекти генно-інженерної біотехнології

Останні досягнення загальної, медичної і, особливо, молекулярної генетики дають нове розуміння етіології та патогенезу хвороб, яке починається від молекули, що кодує ознаки. Все частіше вживається термін моле­кулярна медицина. Сучасні наукові знання і можли­вості молекулярної діагностики на рівні гена, або його продукту, зумовлюють необхідність застосування мо­лекулярної терапії хвороби. У світі існують фірми, які промисловим-шляхом виробляють та продають спеці­альні діагностичні молекули: специфічні ферменти (ДНК-рестриктази, лігази, ревертази та ін.), котрі пра­цюють у певних ділянках нуклеїнових кислот, синте­зують ДНК на ДНК, ДНК на РНК, розрізають моле­кули ДНК у точно визначених місцях_; утворюючи фрагменти потрібної довжини. На цій основі ґрунтуєть­ся молекулярно-діагностичний метод визначення полі­морфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ), за допомогою якого встановлюється носійство мутації, зчепленої з конкретними фрагментами ДНК. Цей ме­тод був розроблений у кінці 70-х на початку 80-х років і зараз широко використовується як для картування генів, так і для молекулярної діагностики спадкових хвороб.

На кінець 80-х — початок 90-х років нашого сторіччя картовано більше 300 000 генів людини. Найбільш успішно провадять роботи щодо виконання програми «Геном людини» вчені США (картовано 50% генів), на другому місці —• Англія (15% генів). Цю ж програму опановують і російські вчені: С.А. Лімборська — роз-

шифрувала декілька послідовностей f Х-хромосомі, В.А. Євграфов — картує ген, який відповідає за хворо­бу Фридрейха, Е.К. Гінтер — ген кератину, що відпо­відає за долонепідошвений кератоз, Д.В. Залєтаєв — картував ген трихоринофалангеального синдрому, тип II (Лангера —Гідіона).

В Україні такі дослідження ставляться науковцями Інституту молекулярної біології та генетики НАН Укра­їни, серед яких у першу чергу треба згадати В.М. Кавсана (картування генів, що експресуються).

Методики картування генів та ДНК-діагностики мутацій принципово не відрізняються і складаються з тих самих етапів: клонування заданих послідовностей ДНК, виділення ДНК з клітин певної людини, рест­рикція цієї ДНК і гібридизація.

Можливість синтезувати in vitro полінуклеотиди, комплементарні до певної ділянки ДНК, -лежить в ос­нові іншого методу — полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що дозволяє виявити конкретну мутацію в гап-лотипі, встановити діагноз гомозиготного чи гетерози­готного носійства патології на будь-якій стадії онтоге­незу та в будь-яких клітинах організму.

ПЛР — це ДНК-технологія, що має велику прак­тичну цінність. Вона дає можливість вибірково збільши­ти в міліард разів кількість певної ділянки ДНК дов­жиною від 1 до 20 000 пар основ. Для того, щоб вибра­ти сегмент, необхідні проби ДНК довжиною 15 — 20 нуклеотидів, що є комплементарними до ділянок, роз­ташованих на кінцях сегмента, який цікавить лікаря. До ДНК пацієнта треба додати такі проби та фермент — термостійку ДНК-полімеразу. В умовах прогріван­ня ДНК пацієнта розділяється на 2 нитки, а на момент наступного охолоджування проби — вони комплемен­тарно приєднуються до кінців фрагмента, що шукаєть­ся, і ДНК-полімераза будує між ними додаткову мо­лекулу. Потім знову суміш прогрівається, нова подвійна спіраль розділяється, суміш охолоджується і 2 нитки

працюють як матриці для нового синтезу тощо. Тобто сегмент ДНК, який в цілому геномі неможливо навіть помітити, ампліфікується під час тридцяти циклів син­тезу до кількості ДНК, яку вже можна вивчити, навіть сіквенувати (тобто читати запис нуклеотидів).

З допомогою ПЛР у генотипі можна: 1) визначити інтегровані вірусні послідовності (вірус папіломи, вірус імунодефіциту людини, вірус гепатиту, цитомегалові-рус); 2) ідентифікувати онкогени; 3) визначити на­явність мутацій, що призводять до спадкової патології у гомозиготі (муковісцидоз, фенілкетонурія, серповид-ноклітинна анемія та ін.), гетерозиготі (хвороба Генті-нгтона, нейрофіброматоз та ін.), гемізиготі (зчеплені з Х-хромосомою м'язова-дистрофія Дюшенна, Беккера, ге­мофілія та ін.), або зумовлюють схильність до атероск­лерозу та ішемічної хвороби серця. Цей метод дозво­ляє ставити діагноз в пренатальному періоді, до клінічного прояву хвороби, розширюючи тим можли­вості профілактичного лікування, створення адаптив­ного середовища, індивідуального підходу до терапії хвороби у конкретного пацієнта.

Діагностичні молекули мають назви: праймери, про­би, зонди та інші, виробляються за допомогою методів генно-інженерної біотехнології як комерційні діагнос-тикуми, на які існують цінники, бланки замовлень, їх застосування у широкій медичній практиці лімітуєть­ся тільки їх дорожнечею.

Діагноз хвороби на рівні молекули повністю змінює підхід до лікування хворих. Відомості про те, що зах­ворювання, викликане мутацією певного гена, зумовлює терапію повноцінними продуктами нормального гена (непряма генна терапія), або навіть введенням в кліти­ни самого нормального гена (пряма генна терапія чи, як її інколи називають, генна хірургія).

У той час як молекулярна діагностика та генно-інже­нерна біотехнологія діагностичних молекул не викли­кають моральних застережень, генна терапія, побудова-

на на принципах втручання в генетичну інформацію та створення нових організмів, породжує нові серйозні деонтологічні проблеми.

Найбільше значення серед терапевтичних молекул мають гормони — сигнальні речовини з загальною регуляторною функцією. Саме вони керують багатьма процесами в організмі, регулюють злагоджену роботу генетичної програми. Дефіцит або дефект гормонів, вик­ликаний певною мутацією, спричинює тяжкі ендокринні захворювання, які, як і всі спадкові хвороби, вимагають молекулярної терапії протягом усього життя. Інсулін, життєво необхідний для лікування цукрового діабету — найпоширенішої ендокринної хвороби (до 25,5% на­селення різних популяцій), з 1922 р. одержували з підшлункової залози великої рогатої худоби та сви­ней. Для одержання 100 г кристалічного інсуліну, необ­хідно використати підшлункові залози 4 000 корів. Хімічний синтез інсуліну складається з 170 хімічних реакцій, і його важко було впровадити в промислове виробництво. З 1979 р. розпочався синтез інсуліну загенно-інженерною біотехнологією, яка виявилася напро­чуд продуктивна: у Великобританії за допомогою тако­го генного синтезу одержують 100 г інсуліну з 1 000 л культуральної рідини, замість 800 кг підшлункової за­лози, які треба забрати у 4 000 корів.

Генетично зумовлена недостатність соматотропіну 'є причиною гіпофізарної карликовості, що зустрічається 1:5 000 дітей. Цей гормон видоспецифічний, тому для лікування хворих необхідним є соматотропін людсь­кий, який до початку ери синтезу одержували з гіпо­фізів людських трупів, і його вистачало для лікування лише третини хворих. Тому ні в кого не виникає сумнівів щодо переваг генно-інженерної біотехнології одержання людського соматотропіну з бактерій, яким в геном перенесено ген гормону росту людини. За да­ними шведської фірми «Кабі вітрум», виробника продукту, з 1 л певного бактеріального середовища че-

рез 7 год виділяється кількість соматотропіну, аналогіч­на результату з гіпофізів 60 людських трупів.

Генно-інженерна біотехнологія допомагає одержати трансгенні бактерії, що несуть в своєму геномі гени гормонів тимуса (залоза загруднинна), бета-ендорфінів мозку, рилізинг-фактора соматотропіну (СТТ-РФ), ри-лізинг-фактора тиреотропного гормону (ТТГ-РФ) гіпо­таламуса (ділянка підзоровогорбова).

З великим успіхом використовується генно-інженер­на біотехнологія для виробництва інтерферону, інтер-лейкінів та інших модуляторів імунопоезу.

Генетичні програми живих організмів у нашій біо-системі написані однією мовою за єдиними законами, тому можливості створення гібридних геномів та гено­типів практично не обмежені. Гени людини можна пе­реносити до геномів не тільки бактерій, але й еукарі-отів: дріжджів, рослин, комах, тварин. Вчені працюють над створенням трансгенних рослин, які б містили білкові продукти людини, наприклад, пшениці з гена­ми інтерферону. Продуктами генної інженерії можуть бути і сільськогосподарські тварини (корови, вівці), які з молоком будуть віддавати гормони,' імуномоду-лятори або інші білки людини для замісної терапії Садкових вад.

Ефективність вдалого перенесення генів з одних ге-ійомів до інших далеко не стовідсоткова. У різних екс­периментах на різних модельних системах вона стано­вить від 2 до 10%. Тому постає таке завдання: розмно­ження трансгенних організмів для одержання їх у до­статній кількості. Це стосується, головним чином, організмів із статевим розмноженням, бо саме у них при розмноженні спрацьовують закони Менделя — розщеплення у потомстві. Обійти ці закони можливо шляхом клонування нащадків із соматичної клітини трансгенного організму. З 1995 р. Ян Уїльмат (Едін-бург, Шотландія) із співробітниками працювали над клонуванням вівці (277 спроб) і таки одержали одну

вівцю (Доллі) з денуклейованої яйцеклітини та ядра клітини молочної залози однієї вівці-донора. Матір'ю її вже не можна назвати (бо не було батька), хоч вона і народила Доллі. Вся хромосомна і цитоплазматична ДНК у цього клонованого нащадка має єдине поход­ження, тому нащадок мусить бути повною копією доно­ра. Денуклейована яйцеклітина з введеним у неї дип-лоїдним соматичним ядром одержала певний енерге­тичний поштовх до ділення і за генетичною програмою утворила вівцю Доллі. У Великобританії у 1997 р. ме­тодом клонування одержали ще одну вівцю — Поллі, яка відрізняється від Доллі тим, що вона — копія транс-генної вівці. У генотипі донора, а отже і у Поллі, містить­ся ген певного білка людини.

Молоко таких тварин — ліки (непряма генна тера­пія) при певній генетичній патології. Зараз вирішуєть­ся питання одержання якомога більше ідентичних емб­ріонів (тобто «монозиготних» близнюків, якщо яйцек­літину з соматичним ядром можна назвати «зигота»}. У цьому напрямку плідно працюють вчені Австралії. Вони ділять бластоцисту на відповідній стадії розвит­ку на ЗО окремих зародків. Потім знову вирощують з кожної клітини бластоцисти і розділяють їх ще до стадії диференціації окремих клітин-зародків на ЗО частин. Розмноженння йтиме в геометричній прогресії. До цього часу ніхто з дослідників не отримував більше як 100 ембріонів від однієї бластоцисти. Австралійські вчені вже отримали біля 500 зародків корів (Jan Anderson, 1997). Тепер ще треба з таких зародків одер­жати здорових корів. Така технологія має бути значно ефективнішою ніж штучне запліднення для розмножен­ня сільськогосподарських тварин.

Нові досягнення науки, як завжди, намагаються ви­користати (негативно) в інтересах меншості і впрова­дити пряму генну терапію та клонування в роботу з людьми. Знову відроджуються євгенічні мрії та зав­дання, пов'язані з цим, але всі антиєвгенічні доводи та

міркування зостаються такими ж, як наведено у розділі «Медико-генетичне консультування» даного посібника.

Непряму генну терапію, тобто лікування продуктом, неможна вважати цілком ідеальною. Спадкові дефекти являють собою серйозну патологію, що триває протягом усього життя, тому й корекція має бути пожиттєвою.

Вбудовування неушкоджених генів у генотип клітин хворої людини дало б змогу відкорегувати генетич­ний дефект і обійти трансплантаційний імунітет, який утруднює трансплантацію органів та тканин. Принцип генної терапії спадкової патології людини той самий, що й при генно-інженерному конструюванні мікробів-продуцентів біологічно важливих речовин. У цих ви­падках ген, що кодує необхідний хворому білок, вво­диться в клітини пацієнта. Для цього необхідно мати сам ген, транспортуючий засіб та клітини-реципієнти. Всі три завдання вирішені і теоретично, і практично. Ген виділяють з ДНК інших організмів, або синтезу­ють хімічно, або, що простіше, ДНК синтезують на мат­риці інформаційної РНК, яку виділяють з компетент­них диференційованих клітин здорового організму. ДНК треба захистити від ушкодження ферментами та донести її до місця вбудовування в генотип необхі­дних клітин. Це досягається шляхом створення реком-бінантних кільцевих молекул, в які, окрім необхідного гена, додаються частки геному деяких вірусів. Перева­га надається онковірусам, бо вони легко входять в кліти­ни та їх ядра і здатні інтегрувати з ДНК клітин-ре-ципієнтів. Існують різні методи введення рекомбінант-них молекул: на ДНК-носіях (крім вірусів, найчастіше використовується ДНК сперми лосося) після осаджу­вання кальцій-фосфатом або включення в тіні еритро­цитів чи в ліпосоми. Можливим є введення ДНК в ядра клітин під візуальним контролем за допомогою автоматичних апаратів для мікроін'єкцій. Останньому надають перевагу при генно-інженерних маніпуляці­ях зі статевими клітинами, зиготами та ембріонами.

Саме таким методом одержують трансгенних тва­рин, які мають у всіх клітинах тіла вбудовані чужі гени, наприклад, миші з геном соматотропіну щура або лю­дини, вівця з геном білка людини, від якої клонуванням отримана вівця Поллі в Англії у 1997 р. У той же чає вчені всього світу занепокоєні ризиком негативних наслідків втручання в геном клітин людини з мето­дичного та етичного погляду: ушкодження генетичної інформації, виникнення небажаних мутацій, неочікува-них регуляторних змін, експресія небезпечних вірусів, які були до того німими. Виникають питання — на­томість відповідей лише гіпотези, здогадки. Чи не є епідемія коров'ячого сказу, що вибухнула в Англії у 1997 p., наслідком генно-інженерних експериментів?

Японські вчені провели роботи по внесенню до яй­цеклітин мишей гена одного з мембранних білків кролів. З 28 трансгенних мишей тільки 3 мали експресію цього гена. Інші були з відхиленнями, а у однієї трансгенної миші (гомозиготи) розвинувся синдром раннього поста­ріння в комплексі з хворобами, залежними від віку: без­пліддя, атеросклероз, атрофія шкіри, остеопороз, емфізе­ма легенів, скорочення терміну життя. Цей новий ген з описаним фенотиповим проявом автори назвали klotho. Мутантний алель успадковується за законами Менделя за аутосомно-рецесивним типом (Makoto Kuro-O, 1997).

У наших дослідженнях була показана мутагенність рекомбінантних молекул для клітин ссавців на хромо­сомному та генному рівнях, частота якої на порядок вища за частоту генної трансформації.

Враховуючи біологічні, медичні та моральні пробле­ми прямої генної терапії людей, більшість лікарів, со­ціологів, релігійних діячів, юристів та медичних гене­тиків вважають за необхідне додати до Європейської конвенції прав людини право на недоторканість гено­типу та засоби, які б це право забезпечували. Більшість розвинених країн вже за прийнятими законами забо­ронили клонування людей.