Результаты микробиологического исследования при инфекционных осложнениях в значительной степени зависят от вида патологического материала, времени и способа его взятия. Эти факторы нередко имеют определяющее значение для правильной трактовки результатов исследования. Микроорганизмы развиваются и погибают, они чувствительны ко многим химическим веществам и могут обнаруживаться в разных биологических жидкостях и тканях при естественном течении большинства инфекционных болезней. Поэтому материал необходимо брать в тех местах, где на данной стадии заболевания наиболее вероятно присутствие возбудителей, а с собранным материалом следует обращаться так, чтобы в максимальной степени обеспечить сохранение жизнеспособности и размножения возбудителей.
Микробы – это живые организмы, которые для выживания в условиях окружающей среды должны питаться, дышать, расти и размножаться. Все эти сложные процессы не только взаимосвязаны, но и всецело зависят от среды, в которой они находятся. Рост – это упорядоченное увеличение всех составных частей организма. Размножение микробной клетки является следствием ее роста и ведет к увеличению числа индивидуумов, составляющих популяцию или культуру. Для этого микробной клетке необходимы факторы роста. Это различные необходимые для жизнедеятельности микроба вещества, которые он не синтезирует или синтезирует недостаточно быстро и должен извлекать из среды обитания (аминокислоты, витамины группы В, железопорфирины, пуриновые и пиримидиновые основания и их производные, некоторые ди- и полиамины, а также ряд разнообразных факторов, относящихся к различным классам химических соединений).
Скорость роста микробной клетки изменяется во времени. На скорость роста популяции влияет ряд факторов, основными из которых являются вид микробной культуры, ее возраст, состав питательной среды, активная кислотность питательной среды (pH), температура выращивания, степень аэрации, чистота микробной культуры (может иметь место угнетение роста одних видов микроорганизмов в присутствии других). Одна из особенностей микроорганизмов – их необычайная зависимость от условий окружающей среды. Малые размеры клеток определяют тесный контакт микроорганизмов со средой, поэтому они реагируют на изменение условий обитания в большей степени, чем другие живые существа. Решающее значение для жизнедеятельности микроорганизмов имеют набор и соотношение компонентов питательной среды. Различают микроорганизмы, которые растут очень быстро, причем в условиях, исключающих богатый состав питательных веществ. Например, стафилококк начинает активно размножаться в пробирке с обыкновенным физиологическим раствором (0,9% раствор NaCl) уже через час даже при комнатной температуре, а синегнойная палочка может размножаться в растворе фурациллина, но крайне плохо или вовсе не растет в условиях пониженного содержания кислорода. Для роста некоторых микроорганизмов (так называемые «привередливые» микроорганизмы) необходимы особенные условия. Например, для стрептококков необходим богатый состав питательной среды и отсутствие или пониженное содержание кислорода в среде обитания. Гонококк быстро погибает при высыхании и очень требователен к составу питательной среды. Некоторые микробы просто не растут на искусственных питательных средах, вне макроорганизма (человека или животного).
Одним из важнейших условий для проявления жизнедеятельности микроорганизмов является активная кислотность среды, которую выражают величиной pH (отрицательный логарифм концентрации водородных ионов). Значение pH от 0 до 14 характеризует степень кислотности или щелочности раствора. Микроорганизмы по-разному относятся к активной кислотности среды. Некоторые могут развиваться в широких пределах pH, развитие других должно происходить в более низкой зоне.
Наконец, микробы по-разному ведут себя в присутствии особей другого вида. Например, стрептококки группы “viridans” (зеленящие стрептококки), которые являются нормальными обитателями полости рта человека, угнетают рост грибов рода Candida.
Различают несколько фаз роста популяции микроорганизмов:
начальная (лаг-) фаза;
фаза положительного ускорения;
логарифмическая фаза;
фаза отрицательного ускорения;
стационарная фаза;
фаза отмирания популяции.
Начальная фаза (лаг-фаза, фаза задержки размножения): микробные клетки, находившиеся в неблагоприятных условиях в конце их предыдущего культивирования (уменьшение количества питательных веществ), адаптируются к новым условиям. В это время образуются ферменты и промежуточные вещества, которые накапливаются до тех пор, пока не достигнут концентрации, необходимой для возобновления роста. Начальная фаза сменяется фазой положительного ускорения: начинается деление клеток. Когда скорость роста клеток всей популяции достигает постоянной величины, начинается логарифмическая фаза размножения (лог-фаза, экспоненциальная фаза). Она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции. Этот процесс продолжается до тех пор, пока: 1) либо одно, либо несколько питательных веществ не исчерпаются; 2) накапливающиеся токсические продукты метаболизма не будут тормозить рост клеток. Далее следует фаза отрицательного ускорения, затем наступает стационарная фаза, когда количество жизнеспособных клеток в данной фазе постоянно. Фаза отмирания (логарифмической гибели) характеризуется прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции и преобладанием в популяции числа погибших клеток.
Таким образом, неправильность сбора и несвоевременность доставки материала в лабораторию может способствовать низкой частоте высеваемости из него возбудителя болезни, поскольку развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора. Для представителей различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы. Изменение того или иного фактора в границах, допускающих развитие микроорганизмов, существенно влияет на их рост и обмен веществ.
При подозрении на развитие у больного инфекционного осложнения вид материала для исследования определяется клиническими особенностями заболевания. При симптомах поражения одного органа или системы материал следует брать в соответствующей локализации. При отсутствии очаговых симптомов вначале повторно собирают образцы крови. Затем в определенной последовательности берут образцы из различных мест с учетом клинических особенностей заболевания у конкретного больного и доступности материала для исследования. Наиболее важно выделение микроорганизмов из тех мест, которые обычно не содержат микробов. Большое диагностическое значение имеют любые микроорганизмы, выделенные из крови, спинномозговой жидкости, плевральной или синовиальной жидкостей. В противоположность этому во многих участках организма человека имеется нормальная микрофлора, которая может изменяться под влиянием различных эндогенных или экзогенных факторов. При микробиологическом исследовании материала, полученного из дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы, а также с раневой поверхности и с кожи, следует определить, является ли выделенный микроорганизм (или их ассоциация) возбудителем инфекционного осложнения или нормальной микрофлорой каждой отдельной локализации.
При сборе и доставке материала для микробиологического исследования необходимо независимо от вида исследуемого образца соблюдать следующие требования:
достаточное количество материала;
соответствие материала инфекционному процессу (например, мокрота, а не слюна; отделяемое из глубины раны, а не с ее поверхности);
сбор материала только в стерильные контейнеры;
строгое соблюдение правил асептики при заборе материала;
доставка материала в лабораторию в максимально сжатые сроки;
материал для исследования берется до начала лечения антимикробными препаратами.
Далее будут рассмотрены некоторые особенности сбора и доставки материала для исследования в зависимости от его вида.
Кровь. Микробиологическое исследование крови проводят с целью диагностики бактериемии. В 2004 г. было издано пособие для врачей «Микробиологическая диагностика бактериемии» (МЗ РФ, ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН). В этом пособии изложены все необходимые современные требования по сбору и доставке крови для микробиологического исследования. Основные требования при посеве крови: соответствующая обработка места венопункции (см. ниже); достаточный объем исследуемого образца (взрослые – 10-20 мл, дети – 1-5 мл); соотношение кровь/питательная среда во флаконе - от 1:5 до 1:10; посев проводится не менее двух раз в течение суток; немедленная доставка образцов в лабораторию.
Материал, полученный при пункции. Перед пункцией необходимо обработать кожу 70% спиртом (экспозиция не менее 30 сек.); нанести 1-2% настойку йода в виде круга O 1,5-2 см (экспозиция не менее 30 сек.). Для пациентов с аллергией на йод можно использовать только 70% спирт (экспозиция не менее 60 сек.). Предпочтительна доставка материала в шприце, которым проводилась пункция с целью снижения риска контаминации (загрязнения) исследуемого образца.
Спинномозговую жидкость обычно собирают посредством люмбальной пункции в стерильный контейнер (например, пробирку). При этом очень важно помнить, что пробирка должна быть теплой, так как наиболее частый в нашей стране возбудитель менингита – Neisseria meningitidis – весьма нестоек в условиях внешней среды. Пробирка доставляется в течение 20 мин., при этом температура ликвора не должна быть ниже 35-37°С (контейнер с ликвором обернуть ватой, чтобы избежать его охлаждения). Для исследования достаточно 2-5 мл спинномозговой жидкости; оптимально использовать не первую порцию, чтобы избежать попадания в исследуемый материал анестезирующего вещества и снизить риск контаминации.
Раны, биопсийный материал, инфекции костей и суставов, абсцессы. Наилучший способ взятия жидких материалов – объемно шприцем. В закрытых абсцессах чаще всего обнаруживается микроорганизм одного вида, что облегчает трактовку результатов исследования. В открытых ранах может присутствовать ассоциация микроорганизмов. В случае свищей (фистул) перед забором материала предварительно следует провести очистку места выхода свища на поверхность кожи или слизистой оболочки от первоначального отделяемого, материал забирают из глубины дефекта. При доставке материала в достаточном количестве можно приготовить мазок на стекле, что дает возможность получить ценную информацию, определяющую и тактику микробиологического исследования, и тактику антимикробной терапии инфекционного осложнения.
Материалы, собранные на тампон, укрепленный на стержне (мазок). Обычно таким способом собирают материал, когда инфекционный процесс локализуется в полости рта (миндалины, подъязычная область, задняя стенка глотки, язык, десны, слизистая щеки). Часто исследуются мазки из области мочеполовых органов (уретра, влагалище, цервикальный канал и проч.). Из гнойных мест (послеоперационные раны, пролежни и проч.) материал следует собирать на тампон только в том случае, когда объемный метод невозможен. При сборе материала на тампон желательно дополнительно из того же места сделать мазок на стекле (только не тем же тампоном, которым собирался материал!).
Мокрота. Полость рта в норме содержит огромное количество разнообразных микроорганизмов, попадание которых в мокроту необходимо снизить до минимума. С этой целью необходим тщательный предварительный туалет полости рта (почистить зубы, прополоскать рот). Мокроту следует собирать утром, непосредственно в стерильный контейнер. Материал немедленно доставляется в лабораторию (за исключением исследования на туберкулез, когда допускается сбор мокроты в течение всего дня).
Моча. Следует избегать сбора мочи посредством катетера, чтобы не спровоцировать развитие восходящей инфекции. Необходима предварительная обработка наружных мочеполовых органов водой с мылом. При естественном процессе мочеиспускания собирается средняя порция утренней мочи в количестве не менее 5 мл. Доставка в лабораторию в условиях стационара осуществляется немедленно, а в амбулаторных условиях – в течение 1-1,5 ч. Образцы мочи из правой, левой почек, из мочеточников могут быть собраны урологом раздельно с помощью катетера при цистоскопии. Когда соответствующий закрытый катетер введен в мочевой пузырь, сбор мочи лучше производить с помощью шприца с иглой. Достаточно 0,5-1 мл мочи из мочеточника или до 5 мл обычной мочи. В сложных для диагностики случаях моча может быть взята асептично непосредственно из наполненного мочевого пузыря путем пункции передней стенки живота.
Исследование испражнений. Кал для исследования следует отбирать в специально предназначенный для этих целей стерильный контейнер с ложечкой. Материал забирается из предварительно подготовленной емкости (судно, горшок), которую необходимо обработать дезинфицирующим раствором, ополоснуть кипяченой водой для удаления дезинфицирующего средства. Доставка в условиях стационара осуществляется немедленно, а в амбулаторных условиях учитывается время, необходимое для транспортировки, которое не должно превышать 1,5-2 ч.
Исследование внутрисосудистых катетеров у онкологических больных имеет большое значение. Инвазивные процедуры приводят к нарушению анатомических барьеров, что и провоцирует возникновение инфекций. Развитие катетер-ассоциированных инфекций зависит от нескольких факторов, и первостепенное значение среди них имеет нейтропения. Часто имеет место только колонизация места контакта катетера с кожей или наружной поверхности катетера, или его просвета. Длительность катетеризации влияет на возможность инфицирования и развитие диссеминированных инфекций.
Виды материалов для исследования при катетер-ассоциированной инфекции (ВСУ - внутрисосудистые устройства):
мазок из области гиперемии (с гнойным отделяемым или без него) в зоне стояния ВСУ;
мазок с поверхности удаленного катетера;
дистальный конец удаленного катетера (не более 5-6 см);
биопленка просвета катетера (забор посредством специальных щеточек).
Наиболее эффективен метод одновременного посева крови из катетера и из вены, позволяющий не удалять катетер для исследования. Доказательством катетер-ассоциированной инфекции при применении этого метода является тот факт, что рост микроорганизмов регистрируется на 2-2,5 ч раньше в тех флаконах, куда вносится кровь, полученная из катетера, так как концентрация микроорганизмов при посеве крови из инфицированного катетера значительно выше, чем в образце крови, засеянной непосредственно из вены. Этот метод демонстрирует, насколько важна полнота информации о направляемом в лабораторию материале для исследования, в частности точное фиксирование времени сбора материала, а также своевременность его доставки в лабораторию.
Транспортировка любого материала в лабораторию микробиологии для исследования должна осуществляться в максимально сжатые сроки (в стационаре – практически сразу после сбора материала). Доставка материала в условиях стационара производится только медицинским персоналом (пациенты ни в коем случае не должны привлекаться к этому процессу!). Материал следует транспортировать в специально предназначенном для этих целей контейнере (например, бикс) с сопроводительным документом, заполненным лечащим врачом в соответствии с принятыми в конкретном лечебном учреждении правилами.