Дослідження впливу пропілпарагідроксибензоату проводилось на статевозрілих нелінійних білих лабораторних щурах, яких утримували в стандартних умовах.
Дослідним тваринам, з допомогою зонда перорально вводили водно-гліцериновий розчин досліджуваного консерванту у розрахунку 10 мг/кг маси тіла тварин (допустиме добове споживання) – протягом 14 днів. Зразки вмістимого товстої кишки відбирали на 7й, 14й та 21й день експерименту.
Визначення жирних кислот проводили за методом Й. Ф. Рівіса і співр. [47] Для досліджень використовували газовий хроматограф CHROM-5 (Praha).
До 1 г рідкого вмістимого товстого кишечника у скляній пробірці додають 0,5 мл 33% - ного водного розчину метафосфорної кислоти та 1 мкл бутанолу (останній в якості внутрішнього стандарту).
Перед введенням бутанолу до досліджуваного зразка, останній розчиняють в метанолі (1:10 за об'ємом). Метанол у цій суміші виконує декілька функцій. По-перше, він у 10 разів підвищує точність введення бутанолу до досліджуваного зразка. По-друге, є носієм наведеного вище внутрішнього стандарту при газохроматографічному аналізі досліджуваного біологічного матеріалу. Пробірки закривають притертим поліетиленовим корком та інтенсивно струшують. Після добової витримки за допомогою мікрошприца з пробірки відбирають 1 мкл надосадової рідини та вводять у випаровувач газорідинного хроматографічного апарату, який має колонку, селективну до коротколанцюгових жирних кислот. На хроматограмі отримують піки коротколанцюгових жирних кислот. Результати газохроматографічних досліджень калібрують [47].
Калібрування проводять методом внутрішнього нормування. За норму (одиницю) приймають параметри піка (площу або висоту) пропіонової кислоти. До неї прирівнюють параметри піків (площі або висоти) оцтової, ізомасляної, масляної, ізовалеріанової та валеріанової кислот. Для цього готують калібрувальні суміші хімічно чистих оцтової, пропіонової, ізомасляної, масляної, ізовалеріанової та валеріанової кислот у масових співвідношеннях наведених у таблиці 2.1 Пробірки закривають притертими поліетиленовими корками [36].
Таблиця 2.1
Маса окремих коротколанцюгових (летких) жирних кислот
у досліджуваних сумішах, мг
| Коротколанцюгові (леткі) жирні кислоти та їх код | суміші | ||||||
| №1 | №2 | №3 | №4 | №5 | №6 | №7 | |
| Оцтова, 2:0 | |||||||
| Пропіонова, 3:0 | |||||||
| Масляна, 4:0 | |||||||
| Ізовалеріанова, 5:0 ізо | |||||||
| Валеріанова, 5:0 |
Кількісну концентрацію досліджуваної коротколанцюгової (леткої) жирної кислоти в абсолютних одиницях визначають за наступною формулою:
X, г/кг або л = [(П*К*С) / Пст] * 1000 * Розв. / Р
де X ─ кількісна концентрація досліджуваної коротколанцюгової жирної кислоти в абсолютних одиницях, г/кг або л;
П ─ параметри піка (площа або висота) досліджуваної коротколанцюгової жирної кислоти, мм2 або мм;
К ─ поправочний коефіцієнт для досліджуваної коротколанцюгової жирної кислоти;
С ─ кількість добавленого внутрішнього стандарту (пропанолу), мкл;
Пст ─ параметри піка (площа або висота) внутрішнього стандарту (пропанолу), мм2 або мм;
1000 ─ коефіцієнт перерахунку в абсолютні одиниці (в кг або л);
Розв. ─ розведення досліджуваного зразка реактивами;
Р ─ наважка досліджуваного матеріалу, г або мл.
Виходячи з наведеної вище формули для кожної хроматограми насамперед визначають уточнені параметри піків коротколанцюгових жирних кислот, мм2 або мм:
П1= П*К
Далі визначають коефіцієнт перерахунку в кількісні абсолютні одиниці (в г/кг або л):
К1=1000/Р
Потім розраховують кількість внутрішнього стандарту (добавленого пропанолу), яка повинна бути в 1000 г або мл досліджуваного матеріалу:
С2, мкл = К1*С
Після цього визначають коефіцієнт переводу уточнених параметрів піків окремих коротколанцюгових жирних кислот у кількісні абсолютні одиниці (в г/кг або л):
К2= С2/Пст
Розраховують кількісний абсолютний вміст окремих коротколанцюгових жирних кислот у досліджуваному біологічному матеріалі:
X, г/кг або л = К2*П1