На тему: ВПЛИВ НІПАЗОЛУ НА ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ МІКРОБОЦЕНОЗУ КИШЕЧНИКА ЩУРІВ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНІЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ІВАНА ФРАНКА

БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА МІКРОБІОЛОГІЇ

УДК 599.32:591.132.5:579.22:615.077

 

МАГІСТЕРСЬКА РОБОТА

 

 

на тему: ВПЛИВ НІПАЗОЛУ НА ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ

ПОКАЗНИКИ МІКРОБОЦЕНОЗУ КИШЕЧНИКА ЩУРІВ

 

Виконала

студентка V курсу, групи БЛБ-52

спеціальності 8.04010202 – мікробіологія

Онишко Марія Іванівна

Керівник:канд. біол. наук.,

доц. Я.І. Колісник

Рецензент:д. мед. наук.,

проф. О. П. Корнійчук

 

 

Львів-2013

ЗМІСТ

ВСТУП…………………………………………………………………………………..4

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ………….....………………………………………….……..6

1.1. Сучасне уявлення про мікробоценоз кишечника людини...............................8

1.2. Коротколанцюгові жирні кислоти як продукти метаболізму мікрофлори кишечника ….......................................................................................................11

1.3. Загальна характеристика консервантів.....…………………………….….......16

1.4. Механізми дії консервантів...............................................................................19

1.5. Спектр дії консервантів......................................................................................21

1.6. Виникнення резистентності мікроорганізмів до консервантів.....................24

1.7. Ефіри n-оксибензойної кислоти (парабени) як консерванти.........................25

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ………………………………..........29

2.1. Об’єкт дослідження…………………………………...………………….…...29

2.2. Загальна характеристика консервантів…………...……………………….....29

2.3. Підготовка матеріалу для проведення мікробіологічного дослідження...30

2.4. Поживні середовища, які використовували для дослідження………...….32

2.5. Виділення грамнегативних неспороутворюючих облігатно анаеробних бактерій ...............................................................................................................33

2.6. Ізоляція та ідентифікація грампозитивних облігатно анаеробних бактерій………....................................................................................................35

2.7. Виділення факультативно анаеробних мікроорганізмів.…………….…...36

2.8. Визначення абсолютного вмісту КЖК у вмістимому товстого кишечника………………………………………………………………………40

2.9. Статистичні методи………....…………………………………………….......43

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ………………......44

3.1. Видовий склад та популяційний рівень мікроорганізмів порожнини товстої кишки білих щурів за перорального введення ніпазолу....…………….........45

3.2. Вплив пропілпарагідроксибензоату на склад коротколанцюгових жирних кислот у вмістимому товстої кишки білих щурів..…………………………..50

4. ОХОРОНА ПРАЦІ ТА БЕЗПЕКА В НАДЗВИЧАЙНИХ СИТУАЦІЯХ..............56

4.1. Аналіз стану виробничих умов ......................................................................56

4. 1. 1. Характеристика лабораторії....................................................................56

4. 1. 2. Аналіз методів дослідження та характеристика обладнання...............57

4.1.3. Характеристика об’єкту дослідження, речовин, їхні небезпечні властивості................................................................................................58

4. 2. Організаційно-технічні заходи ........................................................................60

4. 2. 1. Організація робочого місця і роботи .....................................................60

4. 2. 2. Санітарно-гігієнічні вимоги до умов праці ..........................................60

4. 2. 3. Заходи щодо безпеки під час роботи з обладнаннями, об' єктом дослідження і речовинами......................................................................61

4. 3. Безпека в надзвичайних ситуаціях .................................................................65

4. 3. 1. Протипожежні заходи у виробничих приміщеннях............................65

4. 3. 2. Організація евакуації працівників .........................................................66

ВИСНОВКИ ……………………………………………………………………......68

ЛІТЕРАТУРА ……………………………………………………………………....70

 

ВСТУП

Актуальність теми.

Мікробоценоз кишечника є важливим чинником у формуванні й встановленні імунної системи і визначає опірність організму до кишкових інфекцій. Зокрема,… Також однією з основних функцій нормальної мікрофлори кишечника є участь в… Порушення якісного та кількісного складу нормальної мікрофлори травного тракту супроводжують різні за етіологією…

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

 

Сучасне уявлення про мікробоценоз кишечника людини

У будь-якому мікробоценозі завжди є постійноживучі види бактерій (головна, автохтонна, резидентна мікрофлора) ─ 90%, а також додаткові… Аналізуючи видовий, чисельний склад та інфраструктуру мікробного ценозу, можна… Фізіологічний вплив мікробіоти, тобто усієї сукупності живих мікроорганізмів (бактерій, вірусів, найпростіших та ін.),…

Коротколанцюгові жирні кислоти як продукти метаболізму мікрофлори кишечника

Із них в кількісному відношенні переважають коротколанцюгові жирні кислоти (КЖК) з довжиною ланцюга С2-С6, що можна пояснити низьким вмістом кисню в… Вперше КЖК були виявлені у фекаліях людини в 1878 році. У 1912 році висловлено… В даний час КЖК відносять до біохімічних маркерів симбіозу мікроорганізмів, що населяють кишечник, і організм людини…

Загальна характеристика консервантів

Щоб готові лікарські засоби відповідали вимогам нормативних документів необхідні заходи по забезпеченню норм "мікробіологічної чистоти"… Консерванти – це природні або синтетичні речовини, які додають до різних… Консерванти поділяють на два основні класи: антимікробні консерванти, які пригнічують ріст бактерій і грибів, та…

Механізми дії консервантів

Загибель всіх мікроорганізмів при використанні звичайних концентрацій консерванту відбувається протягом кількох днів або тижнів. У цьому полягає… Фармацевтичним критерієм оцінки ефективності консерванту служить зниження… Залежність швидкості загибелі мікроорганізмів під дією консервантів від часу описується рівнянням:

Спектр дії консервантів

  Таблиця 1.2 Ефективність деяких консервантів щодо мікроорганізмів Консервант Бактерії Дріжджі …

Виникнення резистентності мікроорганізмів до консервантів

Не слід ототожнювати поняття стійкості мікроорганізму з відсутністю (або наявністю лише слабкої) інгібуючої дії речовини або зі здатністю… Вивчено виникнення резистентності бактерій і грибів до харчових консервантів,… Можливість формування швидкої стійкості до антибіотиків є однією з причин, чому їх не використовують як харчові…

Ефіри n-оксибензойної кислоти (парабени) як консерванти

Ефіри n-гідроксибензойної кислоти були запропоновані як консерванти в якості замінників саліцилової і бензойної кислот, недолік яких полягав в тому,… Парабени ─ білі кристалічні порошки, погано розчинні у воді, добре… Ефіри n-гідроксибензойної кислоти синтезують етерифікацією n-гідроксибензойної кислоти відповідним спиртом.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкт дослідження

Об’єктом дослідження були мікроорганізми, виділені із слизових оболонок тонкої та товстої кишок і порожнини товстої кишки білих щурів. Статевозрілі білі безпородні щурі обох статей утримували у стандартних умовах віварію. Раціон складав повноцінний гранульований комбікорм. Всі тварини відповідали 4 класу чистоти за мікробіологічним статусом. Мікробіологічними методами контролювали відсутність специфічних мікроорганізмів (бактерій родів Salmonella, Listeria, Yersinia, Mycobacterium, Streptobacillus, Leptospira).

Загальна характеристика консервантів

Пропілпарагідроксибензоат є ефіром n-оксибензойної кислоти, яка була запропонована як консервант у якості замінника саліцилової та бензойної кислот,… Пропілпарагідроксибензоат (C10H12O3): § Кристалічний порошок білого кольору.

Підготовка матеріалу для проведення мікробіологічного дослідження

Нами проведено вивчення змін видового складу та популяційного рівня мікрофлори кишечника щурів за комплексної дії ніпагіну та ніпазолу. Тваринам металевим зондом щоденно впродовж 14 днів вводили відповідні дози консервантів безпосередньо в шлунок. Контрольна група тварин отримувала водно-гліцериновий розчин (розчинник консерванту). Динаміку зміни мікрофлори кишечника під впливом консерванту оцінювали через 4, 7, 11, 14 діб з моменту його введення, після чого проводили евтаназію тварин [23].

Тваринам обробляли операційне поле, стерильними ножицями по білій лінії живота робили розтин черевної порожнини та ізолювали відрізки тонкої (клубової) та товстої (попереково-ободової) кишок.

Для вивчення складу мікрофлори, яка формує колонізаційну резистентність слизових оболонок травного каналу, після розтину тварин брали відрізки (1–1,5 см) тонкої та товстої кишок, з яких пінцетом видавлювали вміст і розрізали їх вздовж кишки стерильними ножицями. Отримували пасма, які 3 рази промивали у стерильній дистильованій воді з метою елімінації з поверхні слизових оболонок кишки порожнинної мікрофлори та її вмісту. Відмиті таким чином пасма зважували і ретельно гомогенізували у ступці. З гомогенату стінок товстої та тонкої кишок готували серію десятикратних розведень (10^-2–10^-8) у стерильному фізіологічному розчині. З кожної пробірки титраційного ряду (10^-2–10^-12) відбирали 0,1 мл суміші і вносили її на поверхню селективних для кожного виду бактерій поживних середовищ. Після цього стерильним скляним шпателем ретельно розтирали краплю суміші по всій поверхні твердого середовища, підсушували чашки та інкубували у термостаті або анаеростаті залежно від відношення досліджуваних мікроорганізмів до кисню. Після інкубації підраховували кількість колоній (колонієутворюючих одиниць – КУО) мікроорганізмів.

Для вивчення змін складу мікробоценозу товстої кишки білих щурів досліджували порожнинну та мукозну мікрофлору цього біотопу. Для дослідження порожнинної мікрофлори товстої кишки брали її відрізок розміром 2–2,5 см, з якого стерильним пінцетом у стерильних умовах видавлювали вміст, зважували його на торзійній вазі. Наважку вносили у стерильну пробірку і додавали десятикратний об’єм стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію (розведення 1:10=10^-1). Суміш ретельно розтирали скляною стерильною паличкою до утворення гомогенної маси. З гомогенату в подальшому готували ряд десятикратних розведень (від 10^-2–10^-12) у стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію. З кожного розведення робили висіви мірних об’ємів (0,1 мл) на відповідні для кожної групи мікроорганізмів тверді поживні середовища.

Поживні середовища, які використовували для дослідження

фірми "Меrck" та фірми "Scharlau", які є валідовані та не відрізняються за ростовими і селективними властивостями щодо тих… 1. Колумбія агар (основа) з додаванням 100 мг/л канаміцину, 7,5 мг/мл… 2. Колумбія агар (основа), в яке у якості селективних компонентів вносили 3,2 мг/л кристалічного фіолетового, 5 мг/л…

Виділення грамнегативних неспороутворюючих облігатно анаеробних бактерій

Грамнегативні неспороутворюючі облігатно анаеробні бактерії виділяли на Колумбія агарі (основа) з додаванням 100 мг/л канаміцину, 7,5 мг/мл… Бактерії роду Fusobacterium ізолювали на середовищі Колумбія агар (основа), в… Ідентифікацію строго анаеробних грамнегативних бактерій проводили за наступними характеристиками: ріст у присутності…

Ізоляція та ідентифікація грампозитивних облігатно анаеробних бактерій

Бактерії роду Bifidobacterium – анаеробні, грампозитивні поліморфні палички, не утворюють спор, нерухомі. У мазках клітини даних бактерій мали… Бактерії родів Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus виділяли на агарі… Для виділення бактерій роду Clostridium використовували тверде середовище RCM. У пробірки, що містили по 9 мл…

Виділення факультативно анаеробних мікроорганізмів

З метою виявлення бактерій родів Salmonella та Shigella досліджуваний вихідний матеріал висівали на Salmonella Shigella агар (SS). Це середовище… Також проводили пересів штамів на середовище для виділення бактерій родини… Для диференціації бактерій родини Enterobacteriaceae від інших родин грамнегативних бактерій проводили основні тести…

Визначення абсолютного вмісту КЖК у вмістимому товстого кишечника

Дослідним тваринам, з допомогою зонда перорально вводили водно-гліцериновий розчин досліджуваного консерванту у розрахунку 10 мг/кг маси тіла тварин… Визначення жирних кислот проводили за методом Й. Ф. Рівіса і співр. [47] Для… До 1 г рідкого вмістимого товстого кишечника у скляній пробірці додають 0,5 мл 33% - ного водного розчину…

Статистичні методи

Отримані цифрові значення дослідів піддавали статистичній обробці, використовуючи критерій Стьюдента [27].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

У фармацевтичній та косметичній промисловості з метою попередження або інгібування росту мікроорганізмів, які можуть становити небезпеку для… Метою нашої роботи було вивчити вплив антимікробного консерванту ніпазолу в…  

Видовий склад та популяційний рівень мікроорганізмів порожнини товстої кишки білих щурів за перорального введення ніпазолу

За індексом сталості (С%) та показником частоти виявлення (Рі) виділені мікроорганізми порожнини товстої кишки можна розташувати в такому порядку:… Таблиця 3.1 Видовий склад та показники мікрофлори порожнини товстої кишки

Вплив пропілпарагідроксибензоату на склад коротколанцюгових жирних кислот у вмістимому товстої кишки білих щурів

Важливе значення у взаємовідносинах макроорганізм - мікробоценоз має обмін низькомолекулярними метаболітами, що утворюються представниками… В даний час проводять дослідження ролі КЖК у розвитку та прогресуванні… Широкого поширення набув метод газохроматографічного дослідження КЖК у різних біологічних субстратах [46, 70], що має…

ОХОРОНА ПРАЦІ ТА БЕЗПЕКА В НАДЗВИЧАЙНИХ СИТУАЦІЯХ

 

Аналіз стану виробничих умов

Характеристика лабораторії

Мікробіологічна лабораторія включає ряд приміщень, де проводять роботу з мікроорганізмами чи підготовку до неї. Під лабораторні кімнати відведені… Температура повітря у лабораторії в літній період становить 20-25 оС, у… Основне лабораторне приміщення обладнане столами лабораторного типу, висотою 0,7 м, шафами і полицями для зберігання…

Аналіз методів дослідження та характеристика обладнання

Принцип його роботи базується на збільшенні температури при підвищенні тиску. Використовують автоклав для стерилізації посуду і поживних середовищ… 2. Газові пальники. Небезпека при роботі з газовим пальником виникає при несправності сітки газопроводу, гумового шланга чи самого…

Характеристика об’єкту дослідження, речовин, їхні небезпечні властивості

При виконанні дипломної роботи використовувались такі речовини: солі для виготовлення поживних середовищ, хромова суміш, етиловий спирт, натрій… Пропіллпарагідроксибензоат (ніпазол) є ефіром n-оксибензойної кислоти… Ніпазол є у вигляді кристалічного порошку білого кольору. Температура плавлення від 96°С до 99°С. Молекулярна маса:…

Організаційно-технічні заходи

Організація робочого місця і роботи

Після отримання теми дипломної роботи ознайомились з методикою, розробили чіткий план виконання роботи, підібрали потрібну літературу і матеріали,… Важливе значення для виконання експериментів має підготовка робочого місця. На… Перед виконанням роботи слід перевірити справність приладів і цілісність обладнання. Найбільш вживані і нешкідливі…

Санітарно-гігієнічні вимоги до умов праці

Температуру повітря в лабораторії необхідно підтримувати в межах 18-21 оС. Повітря в лабораторії найчастіше очищують провітрюванням. Тривала… Робоче місце, де безпосередньо проводиться робота з культурами мікроорганізмів… В лабораторії не дозволяється їсти, пити, курити.

Заходи безпеки під час роботи з обладнанням, об’єктом дослідження і речовинами

1. Для виключення можливості пошкодження електричним струмом, автоклав повинен бути заземленим з опором 4 Ом. 2. Забороняється приступати до експлуатації автоклаву при несправному… 3. Не можна доливати воду у водопарову камеру під час стерилізації, а також при наявності тиску у камері.

Безпека в надзвичайних ситуаціях

Протипожежні заходи у виробничих приміщеннях

· не захаращувати робочі місця і проходи · слідкувати за закриттям газових кранів · при виявленні запаху газу не можна користуватись вогнем і електроприладами, які можуть дати іскру. Необхідно…

Організація евакуації працівників

У лабораторії розроблені інструкції про плани евакуації. З даними інструкціями повинен бути ознайомлений весь персонал.

Кожного дня проводиться контроль стану всіх евакуаційних виходів, коридорів, сходових кліток. У разі пожежної небезпеки евакуацію персоналу потрібно починати проводити з приміщень близьких до вогнища.

Основним орієнтуючим знаком при евакуації є знак «Виходити тут» (фон зелений, зображення біле). Встановлений на дверях евакуаційних виходів, на шляхах евакуації. На шляхах евакуації використовується з додатковою табличкою з вказівною стрілкою (знак виконаний у прямому та дзеркальному зображеннях, напрямок стрілки на табличці збігається з напрямком евакуації та напрямком руху людей).

 

ВИСНОВКИ

1. Резидентними бактеріями, які персистують у порожнині товстої кишки інтактних білих щурів, є представники родів Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, Enterococcus, Staphylococcus, Eubacterium, Prevotella, Fusobacterium. Бактерії родів Peptococcus, Peptostreptococcus та гриби роду Candida можна віднести до факультативної мікрофлори порожнини кишечника тварин. Бактерії роду Proteus, Clostridium та Streptococcus зустрічаються рідко.

2. Константними представниками мікрофлори даного біотопу за впливу консерванту ніпазолу, порівняно з такими в інтактних тварин, стають мікроорганізми родів Clostridium, Prevotella, Proteus, Klebsiella і лактозонегативні представники роду Escherichia.

3. Введення тваринам 10 мг/кг ніпазолу призводить до змін кількісного складу порожнинної мікрофлори товстого кишечника: зменшується чисельність бактерій родів Bifidobacterium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Peptostreptococcus, Peptococcus, Lactobacillus та грибів роду Candida. За даних умов збільшується кількість представників родів Proteus, Staphylococcus, Clostridium та Fusobacterium. Відбувається контамінація порожнини товстої кишки лактозонегативними представниками роду Escherichia та бактеріями Klebsiella sp.

4. За дії ніпазолу спостерігаються зміни складу коротколанцюгових жирних кислот у вмістимому товстої кишки: знижується кількість оцтової та капронової кислот і зростає рівень пропіонової, масляної, ізовалеріанової та валеріанової кислот.

5. При роботі з небезпечними і шкідливими речовинами дотримувались правил техніки безпеки, використовували засоби індивідуального захисту. Чітко дотримувались правил безпеки при роботі в лабораторії, виконували вимоги техніки експлуатації приладів і методики досліджень, нормативних вимог роботи з об’єктом дослідження.

 

ЛІТЕРАТУРА

1. Аксель Е.М., Давыдов М.М., Ушакова Т.И. Злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта: основные статистические показатели и… 2. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Дубинин А.В. Дисбактериоз кишечника:… 3. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Иконников Н.С Дисбактериоз кишечника: понятие, диагностические подходы и пути…