Рівень середніх молекул у сироватці крові визначають методами гель-хроматографії на сефадексі, високовольтного електрофорезу, іонообмінної хроматографії і спектрофотометрії.
Спектрофотометричний метод належить до експрес-методів.
Принцип методу. Полягає у вимірюванні на спектрофотометрі при λ=254 і λ=280нм оптичної густини сироватки крові, звільненої від високомолекулярних білків, ліпідів. Визначають дві фракції середніх молекул (СМ): ті, що містять ароматичні амінокислоти (виявляють при λ=280 нм), і ті, що не містять ароматичних амінокислот (виявляють при λ=254 нм).
Матеріальне забезпечення:сироватка крові, 10 % розчин трихлорацетатної кислоти, 10 % розчин натрію гідроксиду, мікропіпетки, піпетки, спектрофотометр.
Хід роботи:У центрифужну пробірку вміщують 1 мл сироватки крові, додають 0,5 мл 10 % розчину трихлорацетатної кислоти. Після перемішування проводять осадження білків на центрифузі при 3000 об/хв протягом 30 хв. До 0,5 мл центрифугату добавляють 4,5 мл дистильованої води, перемішують, вимірюють оптичну густину на СФ при λ=254 нм і 280 нм у кюветі з товщиною шару 1 см порівняно з контролем (контроль: 0,25 мл 10 % розчину трихлорацетатної кислоти змішують з 4,75 мл дистильованої води).
Рівень середніх молекул виражають у одиницях, що кількісно дорівнюють показникам екстинкції. Нормальним рівнем СМ у сироватці крові можна вважати значення до 0,246 ум.од. при λ=254 і до 0,296 ум.од. при λ=280.
Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.
Клініко-діагностичне значення. Рівень СМ у сироватці крові хворих є одним з критеріїв клінічного перебігу і оцінки ефективності лікування цілого ряду захворювань. Кількість їх у крові значно збільшується при таких патологічних станах, як опікові хвороби, недостатність функції печінки і нирок, запальні процеси, ендогенна інтоксикація, злоякісні утворення тощо. Проведення ряду детоксикаційних заходів (гемодіаліз, гемосорбція тощо) впливає на рівень СМ, тому визначення їх рівня в динаміці захворювань і лікуванні необхідно використовувати тільки з метою оцінки ступеня тяжкості патології та ефективності лікувальних заходів, а не з метою діагностичного тесту.