1.Осаждение белков. Центрифужную пробирку с внесенными в нее 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл СН3СООН прикрывают пробкой и помещают в холодную водяную баню, воду в которой доводят до кипения. Пробы прогревают в течение 5 мин (время отмечают с момента закипания воды). Затем пробирки охлаждают и приступают к фильтрованию смеси.
2.Фильтрование. К содержимому пробирок добавляют по 1 мл дистиллированной воды и после перемешивания растворов тонкой стеклянной палочкой производят их фильтрование через гладкий бумажный фильтр. Пробирку и осадок на фильтре промывают еще 2 раза, каждый раз используя для этого по 1 мл воды, после чего основной фильтрат и обе порции промывных вод объединяют в одну пробирку с меткой 10 мл.
3.Цветная реакция с нингидрином. К полученному фильтрату добавляют 0,5 мл раствора нингидрина, содержимое пробы перемешивают и на 20 мин помещают пробирку в кипящую водяную баню. По истечении срока прогревания пробирку охлаждают в токе водопроводной воды, оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре и доводят дистиллированной водой до 10 мл (по метке на пробирке).
4.Колометрия. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны – 536 нм) в кювете с толщиной слоя 5 мм. В качестве контрольной пробы используют дистиллированную воду.
5.Расчет производят по формуле путем сравнения показания экстинкций опытной и стандартной проб.
Соп. = (Еоп.• Сст.) / Ест., где
Еоп и Ест – оптическая плотность опытной и стандартной проб; Сст – содержание мкг N в 0,5 мл стандартного раствора аланина.
6.Приготовление стандартного раствора аланина. 12,86 мг аланина растворяют в 100 мл воды (готовят перед применением).
Стандартный раствор в концентрации 12,86/100 мл содержит 0,128 мг аланина в 1 мл, или 0,064 мг (64 мкг) в 0,5 мл.
Молекулярная масса аланина – 90 Д, а в одной молекуле аминокислоты находится 1 атом N (14 Д), то исходя из соотношения молекулярной и атомной масс 90/14 = 6,4 можно определить, что 64 мкг аланина будут содержать 10 мкг N.
0,5 мл приготовленного стандартного раствора аланина обрабатывают точно так же, как 0,5 ил сыворотки крови.
Формула, используемая для расчета:
N г/л = Соп.• 0,002, где
N г/л – содержание аминоазота в сыворотке крови (г/л); Соп. – содержание аминоазота в стандартной пробе.
В норме концентрация аминного азота в сыворотке крови составляет 0,020 – 0,050 г/л.