Саме козацтво після проголошення Люблінської та Брестської церковної уній залишилося єдиним виразником волі та захисником інтересів українського народу. Непослідовність польської влади, яка під час воєнної загрози заохочувала козацтво до спільних воєнних дій проти іноземних ворогів, а в мирні часи посилювала економічне та релігійне гноблення, неухильне загострення суперечностей між козаками і магнатами порубіжних земель призводили до активізації боротьби козацтва за свої вольності і православну віру. Таким чином, посилення феодального гніту, закріпачення селян, утиски православної Церкви стимулювали козацтво до рішучої протидії польським, литовським та й українським магнатам.
Якщо на початковому етапі невдоволення козацтва проявлялося в мирних методах боротьби, як-то скаргах королівському уряду на дії магнатів та утиски з боку регіональної влади, то згодом воно переросло у масові повстанські виступи.
Першим збройним виступом козацьких загонів було повстання під проводом гетьмана реєстрових козаків Криштофа Косинського. Приводом до незадоволення була сваволя білоцерківського старости, який відібрав землі, даровані польським королем козацтву в 1590 р. У відповідь К. Косинський в грудні 1591 р. захопив Білу Церкву. Поступово повстання поширилося і на інші українські території. Протягом 1592 р. козаки разом з міщанами та селянами, що приєдналися до них, успішно діяли на території Київського та Брацлавського воєводств, захопивши Переяслав, Трипілля та деякі інші населені пункти. Відбувся штурм Києва, але без успіху. На територіях, визволених повстанськими загонами, населення було приведено до присяги Війську Запорозькому і почало жити за його законами.
На початку 1592 р. за розпорядженням Сигізмунда ІІІ було створено комісію, яка на чолі польсько-шляхетського війська прибула до Трипілля, де концентрувалося козацтво. Не ризикнувши вступати у бойові дії, комісія оголосила козаків поза законом як бунтівників і ворогів держави.
Поступово повстання поширилося на нові території, в 1592—1593 рр. охопило Київське, Брацлавське, Волинське і Подільське воєводства. У відповідь київський воєвода, князь Костянтин Острозький оголосив «посполите рушення» і на чолі численної армії, до складу якої входили і загони німецьких найманців, нав’язав козаком під містечком П’яткою бій, який відбувся 23 січня 1593 р. Повстанці зазнали поразки, втративши близько 3 тис. убитими та 26 гармат разом з кількома хоругвами. Як наслідок, між повсталими та К. Острозьким було укладено угоду, яка передбачала, що К. Косинського буде позбавлено булави; козаки перебуватимуть у повному послуху королю і не нападатимуть на сусідні країни; не здійснюватимуть напади на маєтки самого князя Острозького та шляхтичів, які брали участь у битві; видадуть зі своїх лав селян-утікачів і шляхетських слуг; повернуть захоплені у шляхти зброю, майно, коней, худобу.
Однак, щойно повернувшись на Запорожжя, К. Косинський знову отримав гетьманську булаву і безуспішно спробував здобути підтримку Москви. Зібравши двохтисячне військо, К. Косинський повів боротьбу далі й у травні 1593 р. оточив Черкаси. Під час облоги гетьман загинув: за однією з версій під час бою, за другою — його підступно вбили під час переговорів із черкаським і канівським старостою Олександром Вишневецьким. Незважаючи на втрату ватажка, козаки зуміли підписати вигідну угоду, за якою їм дозволявся вільний вихід на Запорожжя і волость, поверталися захоплені шляхтою землі та визнавалося право передавати наділи у спадок. Щоправда, в травні 1593 р. на сеймі козацтво було проголошено поза законом.
Однак на початку 1590-х рр. у Європі було сформовано Священну Лігу, яка мала протидіяти агресії Туреччини. За ініціативи австрійського імператора Рудольфа ІІ, у протистоянні було використано і запорожців, які здійснили низку походів проти турків і татар. Так, навесні 1594 р. козацький загін Г. Лободи напав на Акерман, де концентрувались турецькі війська для походу на Угорщину, та зруйнував місто. А влітку 1594 р. похід на територію Молдови очолив С. Наливайко. До складу його двохтисячного загону входили селяни, путні та панцерні бояри. Вони розгромили татарські загони, що прямували на територію Австрії.
Повернувшись до України, С. Наливайко, який брав участь у придушенні повстання К. Косинського у складі війська К. Острозького, спробував налагодити стосунки з козаками Запорозької Січі. Зокрема 1 липня 1594 р. на територію Січі прибули посланці С. Наливайка з пропозицією союзу. Частина запорожців, обравши своїм гетьманом Григорія Лободу, вирушила на з’єднання з загоном С. Наливайка. У жовтні 1594 р. об’єднані козацькі загони у кількості 12 тис. чоловік під командуванням С. Наливайка та Г. Лободи вирушили в похід на територію Молдови. Протягом походу козаки розбили армію молдавського господаря та змусили його до присяги австрійському імператору. На початку 1595 р. козацькі загони, вже разом із армією молдавського господаря здійснили походи на міста Тягиню, Білгород, Кілію.
Повернувшись напровесні 1595 р., загони Г. Лободи та С. Наливайка потрапили у вир антифеодальної боротьби. Потрібно зауважити, що ще навесні 1594 р. спалахнуло повстання у м. Брацлаві, мешканці якого захопили міський замок і проголосили своє місто вільним козацьким. Цей виступ призвів до активізації селянського визвольного руху. Повстанці завдали низку ударів польським загонам та захопили Брацлав, Бар, Вінницю. Загони С. Наливайка підтримали брацлавських міщан і здійснили похід на Волинь. Надалі вістря удару було спрямовано на білоруську територію, повстанці зайняли міста Бобруйськ, Могильов, Річицю, Слуцьк, Туров. Потім війська повернулися на Волинь. Паралельно з означеними подіями, запорожці під проводом Г. Лободи захопили деякі населені пункти Київщини та надавали активну допомогу повстанцям на Правобережній Україні. Загони ж під керівництвом Матвія Шаули здійснили похід на білоруські землі.
Подальшому розгортанню повстанського руху сприяло і міжнародне становище означеного періоду. Річ Посполита, намагаючись посадити на молдавський престол свого прихильника, вивела на територію Молдови власні регулярні війська під проводом польного гетьмана Станіслава Жолкевського. У такій ситуації повстання поступово поширилося на Київщину, Брацлавщину, Волинь та Поділля.
Розуміючи всю серйозність загрози, яка виникла перед шляхетством Речі Посполитої, на придушення козацького повстання було кинуто коронне військо під керівництвом С. Жолкевського. Регулярні польські загони під проводом досвідченого та талановитого полководця поступово витіснили повстанців з Волині та Брацлавщини.
Маючи в своєму розпорядженні малочисленне (близько 1500 чол.) військо, С. Наливайко спрямував свої загони до м. Білої Церкви, де навесні 1596 р. вже об’єдналися загони Г. Лободи та М. Шаули. Після прибуття наливайківців загальна чисельність повсталих становила 5—6 тис. осіб. Маючи такі сили, козацькі ватажки зуміли розгромити авангард польсько-шляхетської армії під командуванням Ружинського, але перед основними загонами армії С. Жолкевського були змушені відступити. 23 березня 1596 р. відбулася битва в урочищі Гострий Камінь між основними силами супротивників. Попри її кровопролитність, переможця виявлено не було. С. Жолкевський відійшов до м. Білої Церкви очікуючи підкріплення. Повстанці виступили до м. Переяслава, де відбулася рада, на якій замість С. Наливайка гетьманом було обрано Г. Лободу. Також повстанці прийняли рішення відійти на територію російської держави. Проте, прийнявши до свого обозу близько 10 тис. жінок, дітей та старих, козаки втратили свої переваги. Поява такого великого обозу не лише обмежила маневреність повстанців, а й примусила виділити для його захисту близько 3 тис. боєздатних козаків.
В свою чергу, С. Жолкевський, отримавши підмогу, наздогнав козаків в урочищі Солониця, поблизу м. Лубен, та примусив їх прийняти бій. Козаки побудували укріплений похідний табір та витримали двотижневу облогу. Протягом цього часу Г. Лободу було вбито під час однієї з козацьких рад і гетьманом було обрано Кремпського. Попри мужність обложених, та втрати, яких зазнавали обидві сторони, 28 травня 1596 р. повстанці капітулювали, заарештувавши та видавши С. Жолкевському С. Наливайка, М. Шаулу та ще кількох ватажків. Керівників повсталих козаків було вивезено до Варшави, де, після майже річного ув’язнення та тортур, було страчено. Самі ж повстанці, які склали зброю, зазнали підступного нападу з боку польського коронного війська. Лише незначній частині козаків на чолі з Кремпським вдалося повернутися на Запорожжя.
Масштаб останнього повстання викликав серйозне занепокоєння владних кіл Речі Посполитої. Після його придушення вони взяли курс на ліквідацію козацького імунітету. Козацькі повстання 1590-х рр. започаткували період національно-визвольних виступів українського народу проти польсько-шляхетського панування. Після поразки цих повстань польські магнати та шляхтичі намагалися остаточно покінчити з козацтвом. Не випадково польський сейм 1597 р. визнав за доцільне оголосити козаків ворогами держави, а їхні землі та майно конфіскувати.
Проте реальні події свідчили про примарність таких рішень та ідей. Ідеться не стільки про спроможність здійснити ці плани, скільки про те, що козацтво мало невичерпні життєві сили, було невід’ємною складовою українського суспільства, важливим чинником громадсько-політичного життя Речі Посполитої.
Польські королі вже не могли без допомоги козацьких військ розв’язувати воєнні конфлікти, що виникали з різними державами в першій половині ХVІ ст. Таким чином, гостра потреба в козацтві як у військовій силі змусила уряд в 1601 р. частково задовольнити вимоги козаків щодо повернення втрачених привілеїв. І хоча право на власну юрисдикцію було визнано лише за реєстровцями, під козацьким «присудом» опинялися дедалі нові групи населення, а то й цілі міста.
Зокрема, у 1600 р. чотиритисячний козацький загін брав участь у поході польської армії на Молдову. У 1602 р. козаки на чолі з запорозьким гетьманом Самійлом Кішкою відзначились у далекому поході на Лівонію. Під час польсько-російської війни на початку ХVІІ ст. неухильно зростала кількість козаків, що брали участь у бойових діях. Якщо в 1605 р. учасниками походу Лжедмитрія на Москву були 12 тис. козаків, то в 1609 р. під Смоленськом їх зібралося вже 30 тис.
На початку ХVІІ ст., завдяки діяльності кошового отамана П. Сагайдачного, козацтво зі збройних вільних ватаг переросло у потужну військову організацію.
Водночас неухильно поглиблювався антагонізм між польсько-шляхетським режимом і козацтвом. Зростання сили останнього та його суспільних та політичних амбіцій викликало занепокоєння в офіційних колах Речі Посполитої. Охоче використовуючи козаків у численних воєнних кампаніях, у мирний час вони прагнули зменшити їхню кількість до кількох тисяч та максимально обмежити політичну ініціативу прикордонних «свавільників». Особливе занепокоєння польського уряду викликало втручання козаків у внутрішні справи Кримського ханства, де вони підтримали антитурецьку партію та здійснили кілька зухвалих походів на Константинополь.
Таким чином, наступний етап козацько-польського протистояння припадає на 20—30-ті рр. ХVІІ ст. Зокрема, незважаючи на вирішальну роль, яку козацтво відіграло в перемозі під Хотином, воно так і не дочекалося від короля виконання його обіцянок. Натомість, за умовами договору з турками поляки брали на себе зобов’язання заборонити козакам судноплавство по Дніпру і не допускати їхніх походів на турецькі володіння.
Цілком зрозуміло, що такий перебіг подій не відповідав інтересам козацтва, яке після перемоги під Хотином сподівалося як на поліпшення свого становища, так і на позитивні зрушення у долі селян та простого міщанства. Тому гасло боротьби «За віру християнську і золоті вольності наші, які ми кров’ю заслужили» стало одним із провідних у козацько-селянських повстаннях, що розгорнулися в 20—30-х рр. ХVІІ ст.
Щоб запобігти новим козацько-селянським протестам, у 1625 р. польський король направив 8-тисячне військо коронного гетьмана С. Конєцпольського в Україну. Гетьману реєстровців не вдалося швидко мобілізувати сили. А тому назустріч полякам вийшло лише 6-тисячне козацьке військо на чолі з гетьманом Марком Жмайлом. Битва біля Курукового озера склалася невдало для козаків. Однак і поляки не змогли здобути вирішальної перемоги. Як наслідок, обидві сторони змушені були піти на переговори. Під час переговорів козаки скинули з гетьманства М. Жмайла і обрали новим гетьманом Михайла Дорошенка, який уклав Куруківську угоду з поляками. Угода передбачала збільшення (удвічі порівняно з 1619 р.) козацького реєстру до шести тисяч чоловік, але всі інші, нереєстрові, мали повернутися під владу своїх панів. Також козаки зобов’язувалися не здійснювати походів проти татар і турків і не втручатися в релігійну боротьбу.
Після цього на Україні кілька років панував відносний спокій, пов’язаний з діяльністю М. Дорошенка.
М. Дорошенко провів справжню реформу Війська Запорозького. Він поділив шість тисяч реєстровиків на шість полків з центрами у Білій Церкві, Каневі, Корсуні, Переяславі, Києві та Черкасах. Кожен полк поділявся на сотні з центрами в містечках на полковій території. Адміністративна й військова влада над козаками на відповідній території належала козацькій старшині, якою управляв гетьман. Так удосконалювалася система самоврядування реєстрового козацтва.
Певний час польській владі вдавалося, розпалюючи конфлікти між реєстровими та нереєстровими козаками, забезпечувати відносний спокій на українських землях. Однак у 1630 р. спалахнуло нове козацьке повстання під проводом Тараса Федоровича (Трясила). Останнього запорожці обрали своїм старшим, відмовившись коритися реєстровому гетьману Григорію Чорному, що займав угодовську позицію щодо поляків. Повстання набуло особливого розмаху на Переяславщині. Повстанці вирушили з Запорожжя «на волость», стратили Г. Чорного, заволоділи низкою населених пунктів і зупинилися у Переяславі. Знову проти повстанців було кинуто війська С. Конєцпольського, які в боях з козаками зазнали значних втрат. У серпні 1630 р. в Переяславі було укладено нову угоду, за якою реєстр збільшувався до восьми тисяч козаків, а повстанцям дарувалася амністія. Поряд із цим, удвічі, до 2 тис. чол.., збільшувалася залога з реєстровців, яка мала постійно перебувати на Запорожжі.
Проте поляки не дуже покладалися на цю залогу, і саме тому в 1635 р. було прийняте сеймове рішення про будівництво фортеці на нижньому Дніпрі. Розташований тут гарнізон мав узяти під свій контроль шляхи на Запорожжя. Побудували фортецю біля першого, Кодацького, порога Дніпра. Однак того самого року запорожці під командуванням гетьмана Івана Сулими захопили та вщент зруйнували її. Ця подія могла стати сигналом для нового козацького повстання. Проте І. Сулиму підступно виданли реєстровці й невдовзі його було страчено.
Нової сили козацько-селянський рух набув навесні 1637 р. Козаки під проводом гетьмана Павла Бута (Павлюка) піднялися супроти поляків, що стало сигналом для масових селянських виступів проти шляхти на Лівобережжі. Повстанці діяли під гаслами боротьби з «ляхами», закликаючи до неї всіх, хто сповідує православ’я. Їх універсали спричинили масове «покозачення» селянства Наддніпрянщини. Втім, велика польська армія гетьмана М. Потоцького 6 грудня 1637 р. завдала під Кумейками поблизу Черкас нищівного удару козацьким і селянським загонам. Військо Павлюка зазнало поразки, а його самого було страчено.
Однак, уже навесні 1638 р. Лівобережну Україну знову охопило полум’я козацько-селянських виступів під керівництвом гетьманів запорозького козацтва: спочатку Якова Острянина, а згодом — Дмитра Гуні. Але перевага була не на боці повсталих, і в липні 1638 р. вони склали зброю.
Урешті-решт козацтво змушене було визнати ухвалену польським сеймом у березні — квітні 1638 р. «Ординацію Війська Запорозького реєстрового», спрямовану на скасування козацьких привілеїв. Згідно з цим документом, скасовувалася виборність старшини, ліквідовувалося козацьке судочинство. Чисельність реєстрових козаків обмежувалася шістьма тисячами, а всі вилучені з реєстру мали стати кріпаками. Замість гетьмана на чолі війська ставили польського комісара, який зосереджував у своїх руках усю повноту влади щодо реєстровців. Посади полковників та осавулів могли обіймати лише шляхтичі.
24 листопада на раді в урочищі Маслів Став козаки прийняли ці продиктовані їм умови разом із новопризначеною старшиною. Під жорстким військово-адміністративним контролем опинилася не тільки «волость», а й Запорожжя, де дислокувався постійний гарнізон. Запобігти втечам на Низ (що розглядались на рівні карного злочину) мала відбудована в 1639 р. Кодацька фортеця. Усі ці заходи на певний час поклали край козацькому «свавіллю», і наступне десятиріччя увійшло в історію Речі Посполитої як період «золотого спокою».
Так закінчилася перша хвиля козацьких виступів проти польсько-магнатського всевладдя на території України. Та нетривалий спокій був лише прелюдією до національно-визвольної війни українського народу.