Лекция 10. Абсорбционная спектроскопия

 

 

ВВЕДЕНИЕ В БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

 

Белки и нуклеиновые кислоты имеют характерные полосы поглощения в УФ-области. Биологические макромолекулы сами по себе бесцветны, однако они зачастую ассоциированы с простетическими группами, такими как ретиналь в зрительных белках или гемовая группа в миоглобине, гемоглобине и цитохромах, которые поглощают видимый свет. Абсорбционные спектры таких хромофоров (от греческого «chroma» цвет и «phoros» несущий) зависят от локального окружения и могут использоваться для изучения конформационных изменений и динамики макромолекул во время их биологического цикла. Активность ферментов можно измерять с высокой чувствительностью, наблюдая за характерными спектрами поглощения субстратов, кофакторов и продуктов реакции.

 

КРАТКОЕ ВВЕДЕНИЕ

Квантово-химическая теория абсорбционной спектроскопии описывается в терминах взаимодействий между электромагнитными волнами и электронами атомов в молекулах. Подчеркнем, однако, что применимость абсорбционной спектроскопии в лаборатории основана на количественной интерпретации кривых поглощения в терминах точно определенных коэффициентов. Полосы поглощения большинства биологических молекул достоверно идентифицированы благодаря исследованию модельных веществ. Например, величина и характер поглощения пептидной связи при 190 нм установлены из исследований простых амидов, аминокислот и полипептидов в твердых пленках и водных растворах.

В абсорбционной спектроскопии анализируют электромагнитное излучение заданной длины волны после его прохождения через образец, измеряя величину поглощенного излучения. Характерная особенность данного подхода заключается в том, что молекулы и световое излучение обмениваются определенными порциями энергии, зависящими от молекулярного состояния и динамики образца. Квантовая механика утверждает, что для перехода из одного молекулярного состояния в другое должно произойти поглощение энергии излучения. В то время как классическое описание взаимодействия электромагнитной волны с веществом ведется в терминах индуцированных диполей. Электромагнитная волна состоит из взаимно-перпендикулярных электрических и магнитных полей. Поля поперечны по отношению к волне, то есть они располагаются перпендикулярно к направлению распространения. По мере прохождения через молекулу волна вынуждает положительные и отрицательные заряды осциллировать в противоположных фазах в плоскости электрического поля. Данный эффект зависит от частоты излучения и от поляризуемости молекулы, т. е. от того, насколько заряды смещаются под действием поля. В результате взаимодействия возникают диполи с осциллирующим дипольным моментом, который равен суммарному заряду, помноженному на расстояние между двумя отдельными зарядами. Электромагнитная волна представляет собой квант определенной энергии hn , где h – константа Планка, а n – частота волны. Точно так же, ввиду свойств атомов и характера связей, электроны в молекулах могут образовывать осциллирующие диполи со строго определенными энергиями и в определенном направлении по отношению к лучу.

Абсорбционная спектроскопия используется для изучения биологических макромолекул во всем диапазоне спектра электромагнитного излучения (Таблица З1.1). Наиболее широко в биологии используют поглощение в ультрафиолетовой и видимой спектральных областях.

Ближний ультрафиолет с длинами волн в районе 300 нм и энергиями около 4 эВ или 400 кДж∙моль^-1 и видимое излучение между 400 и 800 нм м энергиями около 2 эВ или 200 кДж∙моль^-1 соответствуют переходам между электронными орбитальными уровнями и могут быть использованы для изучения различных типов связей в молекулах.

 

Таблица З1.1 Разновидности абсорбционной спектроскопии

λ (м)	ν (Гц или∙сек-1)	Е (кДж∙моль-1)	Метод
~3	~108	~10-4	Радиочастотный ЯМР
~0.1-0.01	~109-1010	~10-1-10-2	Микроволновая вращательная и ЭПР-спектроскопия
~10-4-10-5	~1012-1013	~1-10	ИК колебательная спектроскопия
~8×10-7-4×10-7	~5×1014-1015	~200	Электронная спектроскопия в видимой области
~10-7	~4×1015	~103	Электронная спектроскопия в УФ- области
~10-10	~1018	~106	Рентгеновская электронная спектроскопия
~10-13	~1021	~109	Мессбауэровская спектроскопия γ-излучения

 

 

Коэффициенты экстинкции (поглощения)

 

Рассмотрим простейший случай прохождения света через вещество. Интенсивность поглощенного света -dI молекулами в тонком слое образца dl на единицу площади пропорциональна количеству молекул в образце Cdl, и интенсивности падающего света I:

(З1.1)

где e' – константа пропорциональности, зависящая от длины волны и типа молекулы, называемая коэффициентом молярной экстинкции и имеющая размерность M^-1·см^-1. Интегрируя уравнение З1.1 по длине оптического пути, получаем:

(З1.2)

где I_f – интенсивность света, пропущенного образцом (Рис. З1.1).

Уравнение З1.2 обычно выражается через десятичный логарифм:

(З1.3)

Уравнение З1.3 описывает закон Бэра-Ламберта. Безразмерная величина A(l) называется поглощением, или оптической плотностью (ОП) образца. Современные спектрофотометры способны измерять ОП с высокой точностью в интервале от 0.1 до 3. Заметим, что при значении ОП, равном 3, лишь 1/1000 доля интенсивности падающего света пропускается образцом. Коэффициенты молярной экстинкции e' и e в формулах З1.1 и З1.2 соотносятся друг с другом как e = e' / e, где e = 2.303. Публикуемые значения коэффициента обычно указываются для e.

 

 

 

Рис. З1.1. Схема эксперимента для измерения поглощения. Луч с длиной волны l, интенсивностью I_o падает на кювету толщиной l, содержащую раствор с концентрацией C (моль∙литр^-1). Конечная интенсивность прошедшего света I_f, измеряется детектором D