Лекция 10. Абсорбционная спектроскопия

Лекция 10. Абсорбционная спектроскопия

  ВВЕДЕНИЕ В БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ  

Ультрафиолетовая и видимая спектральная область

   

Спектрофотометры для измерений в УФ- и видимой области

   

Абсорбционная спектроскопия белков в УФ-области

С первых лет существования молекулярной биологии поглощение ультрафиолетового излучения белками использовалось для изучения конформации…  

Спектры поглощения белков в видимой области

Хромофор может быть ионом металла, изменяющим свой цвет в соответствии с его окислительно-восстановительным состоянием, таким как медь в белке… Белки, отвечающие за сложный, строго упорядоченный электронный транспорт,…

Спектры поглощения нуклеиновых кислот

   

АБСОРБЦИОННАЯ спектроскопия в Инфракрасной области

Линейная инфракрасная спектроскопия стала одним из классических инструментов для изучения структуры молекул и их взаимодействия. Сначала казалось,… Совсем недавно была предложена двумерная инфракрасная спектроскопия как…  

Спектрометры инфракрасного диапазона

В ИК-спектроскопии частота полосы для удобства выражается в волновых числах (волновое число – это обратная величина длины волны). Поскольку скорость… ИК-спектр разделяют на ближний, средний и дальний диапазоны и их примерные…  

Дисперсионные спектрометры ближнего инфракрасного диапазона

Методологии измерений, связанные с каждым из трех ИК-диапазонов, сильно различаются. Измерения в ближней ИК-области осуществляются с помощью… Все ИК-спектрометры содержат широкополосный источник (обычно раскаленный… Около 30 лет назад конструкция приборов для инфракрасной спектроскопии претерпела большие изменения. В основе…

Спектрометры среднего и дальнего инфракрасного диапазона с фурье-преобразованием

Если источник света содержит одну частоту, то интерферограмма будет содержать только одну косинусоиду, как показано на рисунке 57.1. Если источник… Типичная интерферограмма показана на рисунке 57.2(а). Отметим, что сигнал…  

Измерения поглощения в тонких слоях

 

Измерение инфракрасных спектров биологических молекул сильно затруднено интенсивным поглощением легкой воды в области 1650 и 3300 см^-1. По этой причине большинство измерений делаются с очень тонкими образцами (10 мкм и менее) в D₂O или в условиях частичного обезвоживания (измерения в пленках). Использование явления полного внутреннего отражения позволяет обойти многие трудности путем уменьшения эффективной толщины образца вблизи поверхности, разделяющей две среды с разными показателями преломления. Эти условия особенно удобны для изучения плоских биомембран, образцы которых в этом случае располагаются на границе двух сред.

 

КРАТКОЕ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ

Колебания молекул

Относительные положения атомов в молекулах постоянно меняются вследствие различных типов колебаний и вращений вокруг своих связей. При… Все колебания делятся на две основные категории: валентные и деформационные.…  

Активные и неактивные моды

Постоянным дипольным моментом обладают двухатомные молекулы с центрами положительного и отрицательного зарядов. Если связь колеблется с частотой нормальной моды ν_m, тогда дипольный момент осциллирует с той же частотой. Согласно классической теории электромагнетизма, колеблющийся диполь поглощает электромагнитное излучение той же частоты. Нормальная мода колебания, производящего осциллирующий диполь в ИК-диапазоне, называется ИК-активной. И наоборот, нормальная мода колебания, не производящего осциллирующий дипольный момент (например, растяжение двухатомной молекулы), не вызвает ИК-поглощение и называется ИК-неактивной.

Отсюда возникает основное правило отбора для активных мод в инфракрасных спектрах: колебания атомов должны вызывать изменения дипольного момента молекулы.

 

Колебательные моды многоатомных молекул

На практике, частоты колебаний многоатомных молекул определяются массой и геометрическим положением соответствующих атомов, а также межатомными… искажающими равновесную конфигурацию. Частоты и смещения атомов можно…  

Методы повышения разрешения

Aнализ вторичной структуры белков с помощью ИК-спектров далеко не однозначен, поскольку полосы в областях амид-I и амид-III довольно широки и не… Для выявления отдельных компонентов предложено два метода, называемых…  

Полосы амид-I, амид-II, амид-III

Область амид-II (1510 и 1570 см-1) слабо чувствительна к изменениям во вторичной структуре белка, несмотря на высокую интенсивность наблюдаемых… В спектральном диапазоне амид-III (1350-1200 см-1) полосы являются в основном…  

Сравнение вторичной структуры белков с помощью ИК-, КД-спектров и рентгеновских кристаллографических данных.

В таблице (см. ниже) приводится сравнение содержания элементов вторичной структуры белков, определённое методами ИК-спектроскопии в области полос…   Таблица. Сравнение содержания элементоввторичной структуры белков с помощью ИК-спектров в области полос амид-I и…

ИК-спектроскопия ДНК

Поскольку колебания в нуклеиновых кислотах возникают в разных частях макромолекулы, их полосы поглощения можно обнаружить в нескольких спектральных… ИК-спектр ДНК, полученный в растворе H2O, представлен на рисунке 57.11(а). На…  

Инфракрасная дифференциальная спектроскопия

ИК-спектры крайне чувствительны к небольшим смещениям координат отдельного атома. К примеру, изменение длины водородной связи всего лишь на 0,002… Один из способов обнаружения небольших структурных изменений в биологических…  

Круговой дихроизм, эллиптичность и дисперсия оптического вращения

Поглощение света с определенной поляризацией p веществом выражается через коэффициент экстинкции ep: (З5.1) где Ip0 и Ip – интенсивности поляризации p, соответственно, падающего и прошедшего света, C – молярная концентрация…

Спектрометры кругового дихроизма

Белки

КД стал одним из подходящих методов для оценки вторичной структуры белков в растворах, поскольку он требует относительно малого количества образца, экспериментальная процедура простота. Сигнал КД очень интенсивен в области поглощения пептидной связи в дальнем УФ, что позволяет использовать довольно разбавленные растворы с концентрацией порядка десятых долей миллиграмма на миллилитр. Измерение КД особенно полезно для наблюдения за структурными и конформационными изменениями в молекуле. Однако, вследствие сложности белковой структуры и зависимости спектра от локального окружения в молекуле, интерпретация в терминах структуры основывается на эмпирических критериях. Из анализа базы данных белковых структур известно, что наиболее распространенными вторичными структурами являются a-спирали и b-листы, поэтому белки классифицируют в соответствии с их топологической организацией. Благодаря наличию в белках триптофана и тирозина, КД в ближнем УФ (где поглощают эти аминокислотные остатки) чувствителен к их третичной структуре. КД также играет важную роль в изучении процесса сворачивания белков, поскольку сигнал неструктурированного полипептида существенно отличается от сигнала структурированного полипептида, имеющего вторичную и третичную структуру.

Вторичные структуры

Рис. З5.5. Спектры КД: (а) a-белков, (б) b-белков, (в) a+b- белков, (г) a/b- белков и (г) неупорядоченных…

Базовые спектры белков

Если бы в первом приближении в спектре КД белка можно было пренебречь сопряжением между различными вторичными структурами в нем, то спектр можно…   КД-спектры β-структур в белках

Мембранные белки

Были предложены различные методы интерпретации КД-спектров мембранных белков в терминах вторичных структур, основанные как на эмпирических, так и на…    

Нуклеиновые кислоты и их взаимдоействия с белками

Мы помним, что нуклеотид – строительная единица нуклеиновых кислот - состоит из фосфата, сахарного кольца (рибозы в РНК и дезоксирибозы в ДНК) и одного из ароматических оснований (аденина, гуаниниа, цитозина, и либо тимина - в ДНК, либо урацила – в РНК). Сами основания плоские и поэтому не обладают оптической активностью. Сигнал КД оснований нуклеиновых кислот в наибольшей степени обусловлен гидрофобным стэкингом пар оснований в спирали и лишь в незначительной степени асимметрией сахара. Метод КД, особенно чувствителен к вторичной структуре, формируемой в зависимости от растворителя и нуклеотидного состава. Он стал основой исследований нуклеиновых кислот с неизвестными конформациями путем сравнения их КД со спектрами нуклеиновых кислот известной структуры.

РНК

В качестве примера на рис. З5.12 показан КД-спектр РНК ПK5. Молекула представляет собой цепочку из 26 нуклеотидов, которая принимает различную конформацию в зависимости от температуры. Спектры КД и поглощения в УФ-области измерялись при различных температурах и сравнивались с базовым набором из 58 молекул РНК с известной структурой. Анализ дал структуру псевдоузла при самой низкой температуре и структуру шпильки при 30ºC этой РНК в A форме. Cпираль разворачивалась (плавилась) при 70ºC. Обратите внимание на зависимость спектра от типа стэкинга.

 

Рис. З5.12 КД-спектры РНК ПК5 при различной температуре: 0^оС (линия), 30^оС (точки) и 70^оС (пунктир) (Johnson and Gray,1992)

ДНК

Хорошо известно, что двуспиральная ДНК способна принимать различные правосторонние конформации в зависимости от растворителя и величины гидратации. Изучение КД-спектров ДНК привело к открытию Z-DNA – левосторонней спиральной структуры, принимаемой молекулой поли d(GC)·поли d(GC) в высокосолевых условиях или в присутствии этанола (Рис. З5.13).

 

Рис. З5.13 КД-спектры молекулы поли d(GC)·поли d(GC). B-форма в 0,1M NaCl (линия) и Z-форма в 4M NaCl или в 60% -м этаноле (пунктир) (Pohl and Jovin, 1972)

 

КД-спектры B- и Z-ДНК разительно отличаются. B-форма имеет положительную полосу около 280 нм и отрицательную вблизи 255 нм, тогда как Z-форма продуцирует отрицательную полосу при 290 нм и положительную при 265 нм. В коротковолновой области спектра можно увидеть еще одну положительную полосу около 190 нм для B-ДНК и отрицательную при 200 нм, а для Z-ДНК положительную полосу возле 180 нм. КД-спектр последней может служить ориентиром в поиске Z-форм в природных ДНК (Рис. З5.14). Такие эксперименты основаны на свойствах сложной суперспирали (когда двойная спираль закручивается вокруг себя) кольцевой плазмидной ДНК. КД релаксированной плазмиды соответствует B-форме. Ассоциация двух комплементарных цепей плазмиды при определенных топологических ограничениях приводила к появлению в ее КД-спектре характерных черт Z-формы (Рис. З5.14). Судя по спектру, содержание Z-формы составляло около 40%.

Следует отметить, что нити РНК с чередующимися пурин-пиримидиновыми основаниями, такие как поли r(GC)·поли r(GC), также могут принимать Z-форму в определенных условиях.

 

Рис. З5.14. КД-спектры релаксированной (прерывистой) плазмиды и той же плазмиды при некоторых топологических ограничениях Z-формы (сплошной). Спектр, описываемый прерывистой линией, напоминает спектр В-формы ДНК, тогда как спектр, представленный сплошнoй линией, содержит черты, свойственные Z-форме (Johnson, 1985)

 

Белок-нуклеиновые взаимодействия