Область амид-I (1600-1700 см-1) пептидной группы наиболее часто используется для исследования вторичной структуры белков. Из-за сильного поглощения легкой воды в области 1640-1650 см-1 структурные исследования в этой полосе проводятся в растворах тяжелой воды. Дело в том, что легкая вода поглощает ИК-излучение там же, где поглощают наиболее интересные группы биологических макромолекул. Эту трудность в некоторой степени можно преодолеть, используя высушенные пленки макромолекул или работая в растворе D2O, где поглощение растворителя сдвинуто область - около 1200 и 2500 см-1. Поглощение воды можно свести до приемлемых пределов и благодаря высокой точности современных ИК-инструментов, используя ячейки с длиной оптического пути в 6 мкм или работая по методу полного внутреннего отражения. Однако из-за неопределенности процессов обмена NH/ND возникает некоторая неоднозначность в интерпретации спектров. Кроме того сильное перекрывание полос, принадлежащих клубку и α-спирали в области полосы амид-I, также усложняет определение содержания α-спиралей в белке.
Область амид-II (1510 и 1570 см-1) слабо чувствительна к изменениям во вторичной структуре белка, несмотря на высокую интенсивность наблюдаемых полос в этом диапазоне. Более того, эти полосы сильно перекрываются с теми, что, возникают вследствие колебаний боковых цепей аминокислотных остатков. По этим соображениям область амид-II для анализа вторичной структуры не используется.
В спектральном диапазоне амид-III (1350-1200 см-1) полосы являются в основном результатом синфазной комбинации изгибания в плоскости связи N-H и деформационного колебания растяжения связи C-N и они крайне чувствительны к вторичной структуре. В отличие от полосы амид-I, легкая вода здесь не имеет сильного поглощения. И хотя сигналы в этом диапазоне в 5-10 раз слабее, чем в диапазоне полосы амид-I, они легко разрешаемы, что делает этот спектральный диапазон пригодным для количественного анализа вторичной структуры белка. Соотнесение спектральных полос в области амид-III следующее: полоса 1330-1295 см-1 соответствует α-спирали; полоса 1295-1270 см-1 – β-поворотам; полоса 1270-1250 см-1 – неупорядоченной структуре, а полоса 1250-1220 см-1 – β-слоям.