Инфракрасная дифференциальная спектроскопия

 

ИК-спектры крайне чувствительны к небольшим смещениям координат отдельного атома. К примеру, изменение длины водородной связи всего лишь на 0,002 Å приводит к сдвигу частоты в полосе амид-А (растяжение N-H колебания пептидной группы) на 1 см^-1, что лежит в пределах чувствительности большинства современных ИК-спектрометров. В то время как рентгеноструктурный анализ белков редко имеет разрешение лучше 1 Å. Однако на практике с помощью ИК-спектроскопии очень трудно увидеть небольшие локализованные структурные изменения в биологических макромолекулах. Все группы в молекуле обладают, как правило, ИК-активными колебаниями, что приводит к возникновению большого числа перекрывающихся спектральных полос. Например, бактериородопсин, мембранный белок, состоящий из 248 аминокислот (26 кДа) и содержащий простетическую группу, состоит примерно из 1900 “тяжелых” (не водородных) атомов, которые имеют около 5700 различных скелетных колебательных мод.

Один из способов обнаружения небольших структурных изменений в биологических макромолекулах основан на принципе дифференциальной спектроскопии. На рисунке (см. ниже) показана молекула бактериородопсина, претерпевающая структурный переход из состояния А в состояние Б. ИК-спектр белка в состоянии А состоит из суммы вкладов всех скелетных вибраций. Напротив, дифференциальный спектр поглощения, рассчитанный путем вычитания спектра состояния А из спектра состояния Б, показывает сигналы только тех частей белка, которые претерпевают структурные изменения. Как видно из рисунка, эти изменения сравнительно небольшие, поэтому и интенсивность пиков в дифференциальном спектре сравнительно мала.

 

 

 

 

Рис. Дифференциальный ИК- спектр мембранного белка бактериородпсина. Справа – упрощенная структура ретиналя в активном центре в двух состояниях. Слева – спектр ИК-поглощения в состоянии A (вверху), дифференциальный спектр между состояниями A и B (в середине) и он же (Б-А) в увеличенном масштабе (внизу) (Braiman and Rothschild, 1988)

 

Для идентификации ИК-полос в спектрах белков часто используются методы генетической инженерии. Дифференциальные спектры белков-мутантов должны давать относительно простые спектры с пиками, соответствующими замененным аминокислотам. Однако, в таких случаях, необходимо очень аккуратно интерпретировать полученные результаты, поскольку мутация сама по себе способна приводить к структурным эффектам за пределами изменяемого аминокислотного остатка.

 

Оптическая активность

 

Оптической активностью называют способность некоторых материалов менять угол поляризации проходящего через них света в зависимости от длины его волны, в этом случае явление носит название дисперсии оптического вращения (ДОВ), или по-разному поглощать свет в зависимости от длины волны и состояния его поляризации, и тогда явление называют круговым дихроизмом (КД). Термин дихроизм происходит от греческого «относящийся к двум цветам».