Абсорбционная спектроскопия белков в УФ-области
С первых лет существования молекулярной биологии поглощение ультрафиолетового излучения белками использовалось для изучения конформации полипептидной цепи. Спектр поглощения белков в этом спектральном диапазоне обусловлен в основном электронными полосами пептидной группы при 170-220 нм, боковыми цепями ароматических аминокислот при 280 нм, а также простетическими группами, кофакторами, ферментными субстратами или ингибиторами, которые могут поглощать и в видимом диапазоне в зависимости от конкретной группы. Цвет белка всегда определяется поглощением простетической группой в видимой области.
Рис. З1.7 УФ-спектр поглощения поли-L-лизин гидрохлорида в водном растворе: неупорядоченный клубок - при pH 6.0, 25ºC; спираль - при pH 10.8, 25ºC; b-форма - при pH 10.8, 52ºC. По оси x отложена длина волны в нанометрах (или в «миллимикронах» в старых единицах) (Rosenheck и Doty, 1961)
Спектры амидных групп в кристаллах демонстрируют электронное сопряжение, указывающее на то, что пептидная организация вторичной структуры отражена в спектрах поглощения. Коэффициент молярной экстинкции полипептида лизина как функция длины волны в области поглощения пептидной группы, отнесенный к одному аминокислотному
остатку, показан на рис. З1.7. Очевидна зависимость спектра от конформации, которая позволяет оценить содержание α-спиралей в белках, исходя из значений молярной экстинкции при 190 нм путем интерполяции между значениями для неупорядоченного клубка и спирали. Такие оценки, однако, не могут быть достаточно надежными в силу возможных вкладов других конформаций и боковых цепей аминокислот (Рис. З1.8). Оценки вторичной структуры белков гораздо надежнее проводить с помощью метода инфракрасной спектроскопии и метода кругового дихроизма.
Рис. З1.8. Спектры поглощения аминокислот в дальней УФ-области в водном растворе при pH 5, кроме цистеина, который измерен при pH 3.0. Вклад ионов хлора был вычтен для основных аминокислот, измеренных в виде гидрохлоридов. TRY – устаревшая аббревиатура триптофана. CYS (-SH) - цистеин. CYS - цистин. Остальные аббревиатуры имеют свои ныне принятые значения (Sussman and Gratzer, 1962, из обзора Wetlaufer, 1962)
Боковые цепи гистидина, триптофана, тирозина и фенилаланина обладают коэффициентами экстинкции свыше 5000 в области поглощения пептидной связи (190-210 нм).
Для точных измерений профиля поглощения ближний ультрафиолет технически более доступен, чем дальний. Основной вклад в поглощение белков свыше 230 нм вносит триптофан, за ним следует тирозин, далее – фенилаланин и цистеин. Для триптофана величина e при 279.8 нм достигает максимального значения 5600, максимальное значение e для тирозина при 274.6 нм составляет 1429 (Рис. З1.9). На рисунке показана также кривая поглощения боковой группы фенилаланина с максимальным значением e, равным 197 при 257.4 нм. Этими тремя ароматическими аминокислотами и обусловлено, в основном, поглощение белков в ближней ультрафиолетовой области. Поглощение аминокислот обладает свойством аддитивности, когда каждая аминокислота вносит вклад пропорционально своему количеству в составе белка. Так, вклад остатков фенилаланина в поглощение может быть довольно значительным в белках, содержащих очень малые количества остатков триптофана и тирозина.
Рис. З1.9. Спектры ароматических аминокислот в ближней УФ-области в водном растворе, pH 6. Триптофан обозначен как TRY. По оси х отложена длина волны в ангстремах (Malik, 1961, из обзора Wetlaufer, 1962)
Молярные коэффициенты поглощения на рис. З1.9 отложены на логарифмической шкале, чтобы подчеркнуть их качественное сходство. На кривых в районе максимума нетрудно разглядеть тонкую структуру, которая особенно заметна в спектре фенилаланина. Она является результатом электронных переходов между различными колебательными уровнями. Эти черты проявляются еще резче при низких температурах, когда влияния вращательных мод ослабевает и уширение линий снижается.
Кривая поглощения тирозина в УФ-области зависит от ионных условий и особенно чувствительна к рН. Между рН 6 и рН 13 максимум в ближнем ультрафиолете при 274.6 нм смещается в сторону более длинных волн примерно на 20 нм, а интенсивность возрастает примерно вдвое (Рис. З1.10). Такая высокая восприимчивость используется для точного титрования остатков тирозина в белках, а также для того, чтобы отделить вклад тирозина от вклада триптофана в наблюдаемые спектры поглощения (поглощение триптофана гораздо менее чувствительно к рН).
Рис. З1.10. Спектр поглощения и дифференциальный спектр тирозина, измеренные при разных значениях pH. По оси х отложена длина волны в Å. Дифференциальный спектр тирозина при двух значениях рН (панель В) показан в разных масштабах. Значения ∆ε по оси у с правой стороны нижней панели относится к области выше 2430 Å. Ниже этой длины волны значения ∆ε разделены на 10 (Malik, 1961, из обзора Wetlaufer, 1962)
Измерение концентрации белков
Измерения концентрации белков обычно проводят путем определения поглощения раствора при длине волны, близкой к 280 нм. Чтобы точно измерить величину пика поглощения около 280 нм, необходимо измерить кривую поглощения белка в широком интервале длин волн. Такие кривые показаны на рис. З.11. Иногда биологические макромолекулы не только поглощают свет, но и рассеивают (по разным причинам), как это имеет место в случае рибосомного белка S13. Так как рассеяние пропорционально λ-4, то можно построить зависимость измеряемого поглощения от λ-4 и, экстраполируя линейную часть этой кривой (где то, что выглядит поглощением, на самом деле обусловлено рассеянием) к λмакс, внести поправку в измеряемое поглощение, обусловленную рассеянием. Пример такой поправки приведен на рис. З.11а.
Рис. З.11. (а) Кривая поглощения рибосомного белка S13. В растворе наблюдается значительное молекулярное рассеяние, что, скорее всего, вызвано присутствием белковых агрегатов. В данном случае трудно оценить точное значение абсолютной концентрации по поглощению при 280 нм. б) Кривая поглощения рибосомного белка S6. В отличие от предыдущего примера поглощение выше 320 нм близко к нулю. Поэтому значение поглощения при 280 нм можно использовать непосредственно для измерения концентрации данного рибосомного белка. Низкое поглощение при 260 нм указывает на отсутствие примеси рибосомной 16S РНК
Однако до тех пор, пока не установлен коэффициент молярной экстинкции данного белка, такие измерения дают лишь относительное значение концентрации. Коэффициенты молярной экстинкции при 280 нм, рассчитанные на основе аминокислотного состава белка (особенно учитывая, содержание тирозина, триптофана и фенилаланина), достаточно хорошо согласуются с экспериментально измеренным поглощением развернутых белковых молекул в гуанидингидрохлориде. Однако значения для нативных молекул могут сильно (до 15%) различаться вследствие обсуждавшегося выше влияния окружения на поглощение аминокислот.
Наиболее точным измерением коэффициентов молярной экстинкции является сочетание записи спектров поглощения с независимым определением концентрации по азоту или аминокислотным анализом содержания нескольких аминокислотных остатков.
Коэффициенты молярной экстинкции некоторых белков приведены в Таблице З1.2.
Таблица З1.2 Коэффициенты экстинкции различных белков
Длина волны (l, нм), коэффициент молярной экстинкции e (M-1·см-1) и молекулярная масса (M, Да) рибонуклеазы (A), карбоксипептидазы A (Б) и бычьего сывороточного альбумина (В)
Белок l e M
A 277.5 9 800 13 680
Б 278 66 700 34 400
В 280 43 600 66 000
Соответствующие величины поглощения раствора с концентрацией 1 мг∙мл-1 в кювете с длиной оптического пути 1 см равны: 0.72 для рибонуклеазы, 1.94 для карбоксипептидазы A, и 0.66 для бычьего сывороточного альбумина. Обратите внимание на то, что значения поглощения для растворов с концентрацией 1 мг∙мл-1 и длиной оптического пути 1 см составляют величины порядка 1. Более высокие значения для карбоксипептидазы A обусловлены наличием в этом белке 6 остатков триптофана. Рибонуклеаза вообще не содержит триптофана, а в бычьем сывороточном альбумине 2 остатка триптофана (Из обзора Wetlaufer, 1962)