Спектры поглощения белков в видимой области

Наличие в белках простетических групп (хромофоров) с сильным поглощением в УФ и видимой области значительно облегчает их спектральные исследования. Зачастую хромофоры сами являются частью активного центра, и их электронная конфигурация, отраженная в полосах поглощения и коэффициентах экстинкции, позволяет наблюдать за протеканием биологических реакций. Светопоглощающие свойства некоторых хромофоров как, таких как ретиналь (зрение) или хлорофилл (фотосинтез) напрямую связаны с их биологической функцией.

Хромофор может быть ионом металла, изменяющим свой цвет в соответствии с его окислительно-восстановительным состоянием, таким как медь в белке азурине с полосами поглощения при 781 и 625 нм, или органической молекулой, такой как ретиналь в родопсине, чья основная полоса поглощения смещается в пределах 400 до 600 нм, в зависимости от локального окружения. Связанные с белком хромофоры могут быть достаточно сложными, как, например, медные кластеры в церулоплазмине (полоса поглощения при 793 нм), железо-серные кластеры в ферредоксинах, порфирин, связанный с железом, в гемовых группах миоглобина, гемоглобина и цитохромов (различные полосы между 200 и 800 нм, придающие белкам красный цвет), порфирин, связанный с магнием в хлорофилле (три полосы: полоса при 360-400, 580-590 и около 780 нм, придающие белку зеленый цвет), или флавин (витамин В2) и флавин-производные группы в составе ферментов, участвующих в реакциях переноса электрона (полосы около 450 нм).

Белки, отвечающие за сложный, строго упорядоченный электронный транспорт, такие как фотореакционные центры фотосинтеза или различные цитохромы в дыхательных цепях, могут заключать в одной структуре множество разных хромофорных простетических групп (Рис. З1.12).

Рис. З1.12 Димер комплекса цитохрома b6f из Chlamydomonas reinhardtii. Белковые субъединицы изображены светлыми цветными лентами. Светло-оранжевый прямоугольник указывает положение мембраны. С комплексом связано несколько хромофорных простетических групп: гем (красный), бета- каротин (оранжевый), хлорофилл (зеленый); атомы железа железо-серных групп изображены красными точками. Субстрат комплекса тридецилстигмателлин (аналог хинона) показан голубым. Мы благодарны Даниел Пико за этот рисунок. Структура комплекса цитохрома b6f описана в Stroebel et al. 2003

 

Реакции и связанные с ними изменения в спектральных свойствах хромофора можно очень быстро запускать с помощью лазерного импульса. Ниже мы вкратце опишем два примера таких реакций, оказавших существенное влияние на молекулярную биофизику: повторное связывание окиси углерода гемовой группой миоглобина после флэш-фотолиза и индуцируемый светом фотоцикл протонного насоса в бактериородопсине.

 

Флэш-фотолиз СО-миоглобина

Результаты экспериментов по флэш-фотолизу СО-миоглобина являются основанием для развития современных идей о связи белковой динамики с биологической функцией, особенно о соотношении последней с конформационными подсостояниями и моделями динамических переходов. Спектры поглощения гемоглобина и кислород-связанного гемоглобина приведены на рис. З1.13.

Рис. З1.13. Спектры поглощения нативного гемоглобина и связанного с кислородом

 

Спектр поглощения белка, связанного с гемом, содержит полосу Соре между 325 и 500 нм, полосы а и б между 500 и 600 нм и полосу «переноса заряда» (полоса III) в ближней ИК-области с 650 нм и далее. Молекула СО связывается с атомом железа гемовой группы гораздо прочнее молекулы О₂, что и объясняет ядовитые свойства угарного газа. Связывание СО с миоглобином приводит к сдвигу в полосе Соре, слиянию полос а и б и исчезновению полосы III. В экспериментах по флэш-фотолизу связь Fe-CO разрывается с помощью лазерного импульса (фотодиссоциация), после чего наблюдается кинетика обратного связывания, которое регистрируется благодаря изменениям в спектре поглощения в наносекундном временном интервале (Рис. З1.14). Кинетики временной зависимости сдвига полосы Соре и полосы III чрезвычайно схожи (Рис. З1.15).

 

Рис. З1.14. Разрешенные во времени спектры в полосе III отражают восстановление CO-миоглобина после флэш-фотолиза. Положение максимума деокси-миоглобина показано пунктиром. Первое измерение проведено через 60 нсек (верхняя кривая), последнее измерение получено через 1 мсек (нижняя кривая). Эксперименты проведены в растворе 75%-го глицерина при 250 K. Временные спектры для наглядности сдвинуты по вертикали (Franzen and Boxer, 1997)

 

Рис. З1.15. Зависимость смещения максимумов поглощения полос Соре и полосы III от времени для двух температур. Условия эксперимента те же, что для рис. З1.14 (Franzen and Boxer, 1997)

 

Из неэкспоненциальных кинетик была получена информация о важной роли, которую играет белковая динамика в конкуренции между процессом повторного связывания лиганда (парная рекомбинация, от латинского geminus, близнец) и его уходом из гемового кармана через белковую структуру.

Изменения полос поглощения обусловлены влиянием порфирина и белкового окружения на электронные орбитали атома железа.