Спектры поглощения нуклеиновых кислот
Электронные переходы в сахарных остатках и фосфатных группах нуклеотидов лежат в дальней ультрафиолетовой области (до 200 нм), тогда как ароматические основания поглощают в ближней ультрафиолетовой области (220-300 нм). Химические производные пуринов и пиримидинов проявляют сильное поглощение в области 260-290 нм, благодаря электронным состояниям структуры сопряженных двойных связей. Пуриновые и пиримидиновые основания в водных растворах имеют индивидуальные спектры поглощения, изменяющиеся в зависимости от рН.
Рис. З1.19. Кривые поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований при рН 7 в ультрафиолетовой области (Davidson, 1972)
Несмотря на различия между спектрами отдельных оснований, все они имеют максимум вблизи 260 нм и минимум около 230 нм. Этим обусловлены практически неразличимые спектры нуклеиновых кислот с пиком поглощения при 260 нм и минимумом, близким к 230 нм. Из них практически невозможно извлечь информацию о нуклеотидном составе.
Коэффициенты молярной экстинкции нуклеотидов при 260 нм составляют величины порядка 104 М-1·см-1. УФ-спектр поглощения нуклеиновых кислот поддается измерению даже при таких низких концентрациях, как несколько микрограмм на миллилитр. Таким образом, существует чувствительный способ фотодететектирования для целого ряда методов от хроматографии до аналитического ультрацентрифугирования. Значения экстинкции нуклеиновых кислот намного больше значений экстинкции боковых цепей аминокислот при 280 нм, за исключением триптофана (5600 М-1·см-1) и тирозина (1460 М-1·см-1). Однако белки содержат сравнительно небольшие количества ароматических аминокислотных остатков, тогда как в нуклеиновых кислотах все нуклеотиды проявляют сильное поглощение в УФ-области. В связи с этим в УФ-спектрах поглощения комплексов белков и нуклеотидов доминирует поглощение нуклеиновых кислот. Поэтому соотношение поглощения при 280 к 260 нм в УФ-спектрофотометрии служит чувствительным тестом на наличие в белковых растворах нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, кофакторы многих ферментов представляют собой нуклеотидные производные).
Коэффициенты экстинкции нуклеиновых кислот, в расчете на нуклеотид, меньше таковых у свободных нуклеотидов, и потому значительно увеличиваются при денатурации, деградации или гидролизе. Спектры денатурированного (не имеющего третичной структуры) и ферментативно расщепленного (состоящего в основном из мононуклеотидов) образцов очень схожи. Уменьшение коэффициента экстинкции (гипохромизм) при образовании третичной структуры происходит в результате сильных электронных взаимодействий между расположенными друг над другом основаниями. Повышение коэффициента экстинкции носит название эффекта гиперхромизма. Явления гипо- и гиперхромизма используются для оценки стабильности нуклеиновых кислот и в первую очередь для изучения перехода спираль-клубок в двухцепочечной ДНК. Поглощение ДНК в области 260 нм (Д260) возрастает при её нагревании в определенном температурном интервале (Рис. З3.20а). Это возрастание является прямой мерой денатурации и возникает в результате нарушения стэкинга оснований ДНК при разделении полинуклеотидных цепей. С помощью такого простого оптического метода были установлены важнейшие свойства ДНК, некоторые из которых мы продемонстрируем ниже. На рис. З3.20(б) показан процесс денатурации-ренатурации ДНК. Если температуру повысить (но не до величины, соответствующей максимальному поглощению), а затем понизить до значения, ниже которого Д260 не изменяется, то Д260 сразу падает до своей первоначальной величины, свидетельствуя о быстром восстановлении структуры. Однако, если область температурного перехода пройдена (78-80oC) и, следовательно, структура разрушена, то при понижении температуры Д260 не падает до своего первоначального значения, поскольку образуются беспорядочные водородные связи и ДНК агрегирует. Но если эти связи разрушить повышением температуры (до 76оС), и выдержать ДНК при высокой ионной силе (от 0.5 до 1.0) в течение нескольких часов, то ДНК ренатурирует и возвращается к исходной двухцепочечной структуре. Такой процесс называется отжигом ДНК.
Рис. З3.20(в) демонстрирует, что тепловая устойчивость ДНК сильно возрастает с увеличением содержания Г-Ц- пары, что свидетельствует о том, что эта пара связана более прочными водородными связями, чем пара А-Т.
Рис. З1.20. а) Увеличение поглощения при 260 нм Т7 ДНК по мере плавления с повышением температуры. Температура, при которой изменение поглощения составляет 50% от максимального называется температурой плавления (Тпл). б) Ренатурация ДНК фага Т7 (смотри текст). в) Температурная зависимость оптической плотности для двух образцов ДНК, отличающихся по содержанию Г-Ц пары: 1) ДНК Е. coli (50%), 2) ДНК P. aeroginosa (68%). Кривые 1 и 3 отличаются ионной силой: кривая 1 соответствует 0.01 М, а кривая 2 − 0.1 М NaCl.
Метод спектральных производных
Большинство спектров поглощения представляют собой суперпозицию довольно широких линий. Для идентификации количества полос поглощения, а также их количественного описания используется метод, обычно называемый производной спектроскопии высокого порядка. Метод основан на одновременной аппроксимации исходного спектра и ряда его неискаженных производных набором модельных полос. Заметим, что простое прогрессивное дифференцирование спектральных кривых сильно ухудшает отношение сигнал-фон, поэтому требуются специальные алгоритмы сохранения.