Ионизация электрораспылением

Серьезную конкуренцию MALDI сегодня составляет метод ионизации, получивший название электрораспыления ЕSI (от английского Electrospray Ionization). Этот метод ионизации часто называют электродинамическим. Ионизация происходит при взаимодействии сильного электростатического поля с поверхностью жидкости на конце капиллярной трубки (рис. 7.13).

 

 

Рис. 7.13. Схематическое изображение траекторий ионов от иглы электрораспылителя до детектора масс-спектрометра. Раствор белка, обычно 1-2 мкл с концентрацией 5 мкМ, помещается в очень тонкий капилляр с диаметром примерно 10 мкм. К позолоченной игле прикладывается напряжение в несколько кВ, вызывая электрораспыление маленьких капель. Положительно заряженные капли десольватируются и фокусируются в масс-спектрометре для детектирования

ESI дает возможность получать интактные ионы из молекул образца, находящихся в растворе при атмосферном давлении. Ионы образуются при подаче напряжения в 1-5 кВ к раствору образца, выходящего через капилляр с низкой скоростью. Большой электрический потенциал, приложенный между концом капилляра и противоположным электродом, расположенным на небольшом расстоянии, вызывает превращение жидкости, выходящей из кончика капиллярной трубочки, в аэрозоль, состоящий из заряженных капель. На выходе образуется совокупность микрокапель раствора, обладающих высоким поверхностным зарядом. Пучок заряженных микрокапель, уменьшающихся в размере за счет потери молекул растворителя, движется к противоэлектроду. Достигая критического размера, при котором силы поверхностного натяжения не могут противостоять силам кулоновского отталкивания, капли взрываются с образованием более мелких капель. Этот процесс повторяется несколько раз. В итоге возникают микрокапли, содержащие всего одну заряженную частицу вещества. Раствор испаряется по мере того, как капли перемещаются из области ионизации с атмосферным давлением в вакуумную камеру, где располагается масс-анализатор. Испарению способствует встречный ток осушающего инертного газа, либо нагрев трубки, через которую капли из источника ионов попадают в вакуумную камеру анализатора. Заряд полученных ионов определяется полярностью приложенного к капилляру напряжения.

В исследуемой жидкости должны быть ионы. Для этого обычно добавляют небольшие количества ионных солей или другие соединения, которые могут привести к образованию ионов. Как правило, максимальное число протонов, которое может присоединить пептид или белок в условиях ESI, хорошо коррелирует с количеством основных аминокислот (Арг, Лиз, Гис) с учетом N-концевой аминогруппы, если, конечно, она не ацилирована. Однако важным фактором в этом процессе является еще и доступность этих протон-связывающих участков. Поэтому распределение зарядов зависит от pH, температуры и присутствия денатурирующих агентов в растворе. Такое распределение можно использовать для исследования конформационных изменений в белке.

Например, во время электрораспыления наиболее распространенный ион бычьего цитохрома c несет 10 положительных зарядов при pH 5.2 и 16 зарядов при pH 2.6. Похожий эффект наблюдается при восстановлении дисульфидных связей. Максимум распределения зарядов ионов лизоцима куриного яйца с четырьмя дисульфидными связями находится в области 12 положительных зарядов (12⁺), но после восстановления при помощи дитиотрейтола этот максимум смещается в область 15⁺ .

Привлекательным свойством методики ESI является образование молекулярных ионов, несущих множественный заряд, при условии, что данные молекулы могут принимать более одного заряда. Это свойство позволяет детектировать ионы с большой массой в низком диапазоне величин m/z. Сдвиг шкалы делает возможным детектирование тяжелых ионов с высоким разрешением, поскольку разрешение обратно пропорционально отношению m/z. Точность определения молекулярной массы с помощью техники ESI и масс-спектрометрии с фурье-преобразованием достигает примерно 0.001-0.005%. В благоприятных условиях можно разрешать индивидуальные пики изотопов углерода.