Лекция 14. Масс-спектрометрия

Лекция 14. Масс-спектрометрия

Что такое масс-спектрометрия?

Джон Фенн, изобретатель метода ионизации электрораспылением для биомолекул, лауреат Нобелевской премии по Химии 2002 годa, возможно, дал наиболее точный ответ на этот вопрос:

«Масс-спектрометрия – это искусство измерения молекулярного веса атомов и молекул. Информации о массе или весе всегда полезна, часто необходима, а иногда и достаточна для идентификации частицы. На практике, интересующие нас молекулы ионизируются, а затем траектории полученных ионов анализируются как функция различных комбинаций электрических и магнитных полей. Несомненно, ключевым моментом метода является переход молекул нейтрального вещества в ионы».

Ионы в электрическом и магнитном полях

 

Масса и заряд

Существенное отличие масс-спектрометрии (MS) от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение, поглощение или рассеяние энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет их массы, вернее соотношение массы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц в магнитном или электрическом полях. Масс-спектр – это просто сортировка заряженных частиц по их массам (точнее отношениям массы к заряду).

Ионы в электромагнитном поле. Закон Лоренца

Ускоряющийся ион, покидая источник, приобретает кинетическую энергию (7.1) гдеz – это заряд иона, Vуск – ускоряющая разность потенциалов, m – масса иона, а u – его скорость. В однородном…

Разрешающая способность масс-спектрометрии

Рис. 7.3. Два определения разрешающей способности в масс-спектрометрии…  

Точность измерения массы

Обычно для точного измерения массы не требуется максимального разрешения, если наблюдаемый сигнал для данной массы связан только с одним типом…  

Методы ионизации

Получение заряженных частиц в процессе того или иного воздействия на нейтральные частицы называется ионизацией. Именно получение ионов и является… Сахариды и олигонуклеотиды имеет функциональные группы, которые легко отдают…

От ионов в растворе к ионам в газовой фазе

Перенос ионов из раствора в газовую фазу представляет собой процесс десольватации, требующий затрат энергии (эндотермические процесс), и поэтому он… Ионы можно получать тремя разными способами. Во-первых, отрывая электрон от… Большинство стабильных органических соединений имеют четное число суммарных электронов, отражая тот факт, что…

Электронная ионизация

1 эВ = 1.6´10–19 Дж Джоуль (Дж) – стандартная единица энергии в системе СИ. 1 Дж = 1 Н · м-1

Бомбардировка быстрыми атомами

Для этого образец помещается в жидкую матрицу (обычно глицерин или н-нитробензол этиловый спирт) для поддержания относительно постоянной… В FAB-ионизации капли образца бомбардируются атомами аргона, ксенона или… Основной недостаток техники FAB (очень высокая концентрация органической жидкой матрицы) преодолевается за счет…

Плазменная десорбция

Деление ядра – это дискретное событие, происходящее с частотой (1-5)´103 сек-1, результатом которого является поток ионов, пульсирующий с той…  

Ионизация лазерной десорбцией при помощи матрицы

MALDI отличается от прямой лазерной десорбции использованием специального материала (матрица), смешанного с образцом. С этой точки зрения такая… Детальные механизмы превращения энергии (десорбция образца и ионизация) до сих…

Химическая ионизация при атмосферном давлении

Фотонная ионизация при атмосферном давлении

Рис. 7.11. Схематическое представление техники фотонной ионизации под… Фотоионизация при атмосферном давлении генерирует ионы непосредственно из раствора с относительно малым фоновым…

Ионизация лазерной десорбцией с поверхности кремния

  Рис. 7.12. Лазерная десорбция с поверхности кремния

Ионизация электрораспылением

   

Наноэлектрораспыление

 

Наноэлектрораспыление (nanoESI) является разновидностью электрораспыления, при котором игла распылителя делается очень тонкой и располагается максимально близко ко входу в масс-анализатор. Скорость потока при таком распылении составляет от 10 до 100 нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, в методе nanoESI используются иглы из металлизированного стекла или плавленого кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворенный образец вводится в иглу, к концу которой прикладывается давление в несколько атомосфер. Вытекание образца с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Например, анализ 5 мM раствора пептида с помощью nanoESI занимает всего 1 минуту и требует ~50 фемтомолей образца. Этот же эксперимент с использованием обычной техники ESI за это время требует 5 пикомолей, т.е. в 100 раз больше образца.

Сравнение возможностей различных методов образования ионов

Из неё видно, что nanoESI, DIOS, с одной стороны, и MALDI, с другой стороны, фактически являются рекордсменами. Первые имеют самую высокую… Кроме того, не стоит забывать, что для определения количества компонентов… Таблица 7.2. Сравнительные характеристики различных типов ионизации биологических макромолекул Тип…

Масс-спектрометры

Общая архитектура масс-спектрометра

   

Чувствительность

  Таблица 8.1. Доли молей веществ, которые используются в сегодняшней… Наилучшие масс-спектрометры сегодня работают в диапазоне всего сотен йоктомолей вещества. Введению в практику такой…

Динамический диапазон

Если мы анализируем смесь, содержащую 99.99 % одного соединения или какого-либо элемента и 0.01% какой-либо примеси, мы должны быть уверены, что правильно определяем и то и другое. Чтобы быть уверенным в определении компонентов в этом примере, нужно иметь диапазон линейности в 4 порядка. Современные масс-спектрометры для органического анализа характеризуются динамическим диапазоном в 5-6 порядков, а масс-спектрометры для элементного анализа 9-12 порядков. Динамический диапазон в 10 порядков означает, что примесь в пробе будет видна даже тогда, когда она составляет 1 млгр·м^-3.

Скорость сканирования

Вакуумирование

1 Торр = 133.322 Паскалей Паскаль (Па) является стандартной единицей давления в системе СИ. 1 Па = 1 кг· м-1 ·с-2

Различные типы масс-анализаторов

В настоящее время используются пять типов масс-анализаторов: магнитный сектор, квадрупольный масс-фильтр, квадрупольная ионная ловушка, время-пролетные и ионно-циклотронные резонансные устройства. В 2005 году появился коммерческий прибор, в котором используется принцип орбитальной ловушки, обладающий по многим параметрам рекордными показателями. Детектирование ионов после масс-анализа может осуществляться с помощью деструктивных и не деструктивных методик (см. ниже). Современные масс-спектрометры полностью управляются компьютерами, а для обработки и интерпретации данных используются специальные программы. Напомним читателю, что магнитным анализатором природного происхождения является магнитное поле Земли, являющееся ловушкой огромного количества космических заряженных частиц высоких энергий.

Масс-спектрометры с одиночной и двойной фокусировкой

  а) б)

Квадрупольный масс-фильтр

  Рис. 8.4. Схема линейного квадрупольного масс-фильтра. Для сканирования значений m/z от 1 до 500, постоянное…

Kвадрупольная ионная ловушка

Рис. 8.5. Продольное сечение квадрупольной ионной ловушки. Ионы образуются… В основе QIT лежит тот же принцип, что и квадрупольном масс-фильтре, за тем исключением, что квадрупольное поле здесь…

Масс-спектрометрия с фурье-преобразованием

  Рис. 8.8. a) Общая схема движения возбужденных ионов в ICR-FT ячейке. б) Полученный временной сигнал в результате…

Времяпролетная масс-спектрометрия

(8.3)   и для времени t, необходимого для преодоления базового расстояния L

Детекторы

Конечным элементом масс-спектрометра является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрографы использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод (электрод в фотоумножителе), выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него еще большее количество электронов и т.д. Другой вариант – фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея). Заинтересованный читатель может обратиться за подробностями детектирования ионов к специальной литературе.

Тандемная масс-спектрометрия

   

Орбитальная ловушка ионов

Рис. 8.13. Схематическое представление орбитальной ловушки ионов  

МАСС-СПЕКТРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

Представление масс-спектра вещества и его интерпретация

Рис. 9.1. Пример масс-спектра простого соединения в графическом виде  

Масс-спектры простых соединений

  Рис. 9.2. Масс-спектры углекислого газа, пропана и циклопропана

Масс-спектры биологических макромолекул

Применение масс-спектрометрии к исследованию сложных белковых молекул стало ключевым в протеомике. Ионизация электрораспылением и ионизация лазерной десорбцией в матрице находят все большее применение в масс-спектрометрии белков. Однако надо иметь в виду всегда одно принципиальное различие в масс-спектрах, полученных этими двумя типами ионизации. ESI масс-спектр дает, как правило, многозарядный спектр, тогда как спектр MALDI – однозарядный. Последнее означает, что MALDI-спектры всегда проще интерпретировать, поскольку по оси абсцисс откладывается масса иона.

Белки

MALDI-спектры

MALDI обладает высокой чувствительностью (уровень аттомолей, 10^{-18 М), не требует сложной подготовки и позволяет работать с гетерогенными образцами. Метод позволяет определять молекулярную массу пептида или белка в сотни тысяч дальтон с точностью 0,5-0,01%. В качестве матриц наиболее часто используют 2,5-дигидроксибензойную и альфа-циано-4-гидроксикоричную кислоты. Первая особенно успешно применяется для легких соединений с молекулярной массой до 1000 Да, поскольку характеризуется незначительными фоновыми пиками в области низких масс. К недостаткам метода можно отнести тот факт, что некоторые компоненты неочищенных смесей могут давать очень интенсивные пики в спектрах. Эти пики могут маскировать наличие действительно важных для исследователя компонентов, т.е.} MALDI не является методом количественного анализа.

На рисунке 9.6 приведен MALDI-масс-спектр [Arg⁸]-вазопрессина (C₄₆H₆₅N₁₅O₁₂S₂), c высоким разрешением. Его номинальная масса 1083 Да, a М=1084.23 Да. Основной пик при m/z=1084.446 – это «моноизотопный» пик интактного протонированного пептида. Три других пика, каждый из которых отличается от соседнего на одну атомную единицу массы (1 Да), соответствуют природным редким изотопам углерода, присутствующим в молекуле в количестве одного или нескольких, среди которых наибольший вклад вносит ¹³C с содержанием 1.108%.

а) б)

Рис. 9.6. MALDI-масс-спектр [Arg⁸]-вазопрессина, полученный с высоким разрешением a) узкие пики в диапазоне m/z от 1083 до 1088 и б) один из пиков в масштабе, с тем чтобы продемонстрировать высокое разрешение (1/ 100 000)

 

Этот рисунок наглядно показывает возможности метода MS: природное изотопное содержание ¹³C легко можно определить в белке небольшой молекулярной массы с высокой точностью (10 ppm).

 

ESI-спектры

 

На рисунке 9.7 показан масс-спектр цитохрома с, полученный ионизацией распылением. Как видно масс-спектр белка состоит из восьми пиков, с базовым пиком располагающимся при m/z=884.3. Он выглядит намного сложнее, чем спектры MALDI из-за многозарядности получаемых ионов. При расчете его массы следует помнить, что значения z всегда целые. Подразумевается, что ионы представляют собой продукт взаимодействия нейтральной молекулы и протонов.

 

Рис. 9.7. Масс-спектр цитохрома c (номинальная масса 12366 Да), несущего множественный заряд от +12 до +18, полученный при помощи ионизации электрораспылением

 

Молекулярная масса нейтральной молекулы M может быть найдена из значений регистрируемых масс m₁ и m₂ (что эквивалентно значениям m/z) и числа добавленных зарядов или протонов n₁ и n₂:

(9.1)

где и .

Можно рассчитать n₂ и, следовательно, M, если брать пики регистрируемых масс попарно.

Применяя формулу 9.1 для расчета молекулярной массы цитохрома c с использованием двух соседних пиков с m₁ = 952.3 и m₂ = 1031.3, получим для n₂ следующее значение:

или Z = 12.

Это означает, что 12 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой, равной 1031.3.

Молекулярная масса в этом случае рассчитывается, как и равна 12363.6.

Рассматривая следующие два других рядом расположенных пика с относительными массами = 884.3 и = 952.3, мы получаем:

или Z = 13, т.е. 13 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой 952.3. Рассчитанная из этих пиков молекулярная масса равна 12366.9.

Продолжая нашу процедуру для других пар пиков, получаем:

Из двух пиков с относительными массами = 825.5 и = 884.3, молекулярную массу 12366.2.

Из двух пиков с относительными массами = 773.9 и = 825.5, молекулярную массу 12367.5.

Из двух пиков с относительными массами = 825.5 и = 884.3, молекулярную массу 12366.4.

Отсюда мы можем заключить, что наблюдаемая средняя молекулярная масса, рассчитанная из пяти пиков, равна 12366.1. Теоретическая масса цитохрома c равна 12 366.

Напомним, что современная масс-спектрометрия работает с очень маленьким числом молекул. В качестве примера на рисунке 9.8 приведен участок масс-спектра цитохрома c и миоглобина лошади, полученных с помощью ESI-ICR-масс-спектрометрии при высоком разрешении. Концентрация образца составляла 0.4 нМ. Общее число исследованных молекул равнялось всего 135 зептомолей, что составляет примерно 80 000 молекул.

а) б)

 

Рис. 9.8. Участки масс-спектра а) цитохрома c и б) миоглобина лошади, полученные с помощью ESI-ICR-FT-масс-спектрометрии. Изображение спектров взято из статьи Belov et al., 2000

Секвенирование белков

Отсутствие фрагментации белков при мягкой ионизации очень полезно для точного определения молекулярной массы, но не дает структурной информации, что является ее большим недостатком. Сначала эту проблему решали с помощью техники FAB, которая, к сожалению, применима для исследования относительно коротких пептидов и требует большого количества образца (2-50 нМ).

Наиболее подходящей техникой для секвенирования белков оказалась тандемная масс-спектрометрия. С помощью MS-МS можно определять не только все 20 основных аминокислот, но и неизвестные модифицированные аминокислоты в соответствии с их массой. MS-МS характеризуется высокой скоростью и чувствительностью, что позволяет напрямую анализировать смеси пептидов.

Для секвенирования больших пептидов и белков разработаны разнообразные масс-спектрометрические подходы. К ним относится тандемная масс-спектрометрия, комбинируемая с энзиматической и химической деградацией по Эдману. Напоминаем, что деградацией по Эдману называется химический метод последовательного отщепления аминокислотных остатков от N-конца полипептида или белка. Серия таких химических реакций до сих пор остается наиболее эффективной техникой секвенирования полипептидов. Для ее применения необходимо наличие свободной аминогруппы на N-конце. Пептиды, чья концевая аминогруппа блокирована (например, формилирована или ацилирована), должны быть расщеплены энзиматически, либо химически. Деградация по Эдману проводится в автоматическом анализаторе. Сегодня для определения аминокислотной последовательности требуется небольшое количество белка – от 10 до 100 нанограмм.

Вычисление аминокислотной последовательности белка

Для получения структурной информации с помощью масс-спектрометрии изучаемая молекула должна претерпеть фрагментацию одной или более связей с образованием ионов. Полученные в результате этого пептиды обладают следующими характеристиками: их линейный скелет образован только повторяющимися связями α- аминокислота-амид, и замещающие группы каждого α-углерода представляют собой 20 естественных аминокислот. При использовании методов «мягкой» ионизации образуются одно- или полипротонированные молекулярные ионы, у которых недостаточно энергии для фрагментации. Однако фрагментация достижима, если воспользоваться специальной камерой столкновений в тандемной масс-спектрометрии или прибегнуть к бомбардировке образца быстрыми атомами Ar или Ne.

Несмотря на то, что фрагментация может происходить по-разному, существуют зоны предпочтительного расщепления пептидной связи. Единовременная потеря одного аминокислотного остатка сопровождается образованием пиков в спектре, которые отличаются друг от друга на массу одной аминокислоты минус H₂O (так называемая масса остатка – Таблица 9.1). Это различие в массе каждых последующих пиков является точным отражением первичной структуры пептида.

Таблица 9.1. Массы аминокислотных остатков [–NH–CHR–CO–]

Обозначение	Элементный состав	Масса (Да)
Ala A	–NH–CH– CH3–CO–	71.0
Arg R	–NH–CH–[(CH2)3–NH–C(NH)–NH2]–CO–	156.1
Asn N	–NH–CH–(CH2CONH2)–CO–	114.0
Asp D	–NH–CH–(CH2COOH)–CO–	115.0
Cys C	–NH–CH–(CH2SH)–CO–	103.0
Gln Q	–NH–CH–(CH2CH2CONH2)–CO–	128.1
Glu E	–NH–CH–(CH2CH2COOH)–CO–	129.0
Gly G	–NH–CH2–CO–	57.0
His H	–NH–CH–(CH2C3H3N2)–CO–	137.1
Ile I	–NH–CH– [CH–(CH3)CH2–CH3]–CO–	113.1
Leu	–NH–CH– [CH2CH(CH3)2]–CO–	113.1
Lys K	–NH–CH–[(CH2)4NH2]–CO–	128.1
Met M	–NH–CH–[(CH2)2–SCH3]–CO–	131.0
Phe F	–NH–CH–(CH2Ph)–CO–	147.1
Pro P	–NH–(CH2)3–CH–CO–	97.1
Ser S	–NH–CH–(CH2OH)–CO–	87.0
Thr T	–NH–CH–[CH(OH)CH3)–CO–	101.0
Trp W	–NH–CH–[CH2–C8H6N]–CO–	186.1
Tyr Y	–NH–CH–[(CH2) –C6H4–OH]–CO–	163.1
Val V	–NH–CH–[CH(CH3)2]–CO–	99.1

 

Отметим, что одинаковые массы имеют остатки лейцина и изолейцина (М= 113.1), а также глутамина и лизина (М = 128.1).

Фрагментация идеального пептида представлена на рисунке 9.9. Расщепление связей, указанных на рисунке, приводит к образованию фрагментов с массами a_n, b_n, и c_n, если заряд остается на N-концевом фрагменте. Исключение составляет ион c_n , к массе которого нужно добавить два Дальтона, поскольку он сохраняет исходный протон и присоединяет еще один с другой стороны пептидной связи.

 

Рис. 9.9. Фрагментация идеально протонированного пептида

 

Ионы x_n, y_n, и z_n образуются, когда заряд остается на C-конце с двумя атомами водорода, добавленными к иону y_n, аналогично случаю с ионом c_n. Имея одну последовательность ионных фрагментов, мы можем рассчитать аминокислотную последовательность пептида, за исключением лейцина и изолейцина, а также лизина и глутамина, которые нельзя отличить таким образом. Обычно получается не одна серия ионов, а набор перекрывающихся N- и C-концевых ионов. Они и используются для определения полной последовательности.

Процесс фрагментации протонированных пептидов в настоящее время настолько понятен и воспроизводим, что выработан набор следующих эмпирических правил:

1) Пик с наибольшей массой в спектре представляет (M + H)⁺

2) Разность масс (Δ) между последовательными ионами отражает массу аминокислотного остатка (а.о.)

3) Сумма всех аминокислотных остатков должна давать полную молекулярную массу.

 

Ниже показано приложение этих правил для пептида, полученного методом FAB-МSсо значениями m/z, равными 128; 185; 299; 396 и 528.

Самый большой пик в спектре имеет m/z = 528, отсюда M = 527. С помощью набора m/z данных можно получить пептидную последовательность следующим образом:

m/z 128 185 299 396 527

Δ 57 114 97 131

a.o. Gly Asn Pro Met

Ион с наименьшей массой m/z = 128 является лизином (Lys), отсюда последовательность пептида с N-конца будет следующая:

Met-Pro-Asn-Gly-Lys.

Совокупная масса аминокислотных остатков равна 527 Да, что соответствует масс-спектрометрическому значению.

Нуклеиновые кислоты

Эффективность исследования нуклеиновых кислот с помощью масс-спектрометрии отстает от изучения белков. Основная причина заключается в высоком… Рис. 9.10. Масс-спектры трех оснований ДНК, полученные методом ТОF-спектрометрии. Цитозин в этих экспериментах…

Карбогидраты

Моносахариды В исследовании полисахаридов возникает первый главный вопрос: из каких… Установление строения моносахарида требует решения двух задач. Прежде всего, надо выяснить массу углеродной цепи, а…

Липиды

 

Несмотря на то, что липиды были одними из первых биологических макромолекул, исследованных методом масс-спектрометрии, их рутинный структурный анализ стал возможен только после развития «мягких» способов ионизации, таких как MALDI и ESI. Практическое полное отсутствие фрагментации при таких способах ионизации привело к тому, что все фосфолипидные составляющие могли быть идентифицированы в масс-спектре. Идентификация и структурная информация о некоторых пиках требует применения тандемной масс спектроскопии, когда выделенный ион подвергается фрагментации в камере столкновений, а затем анализируется вторым масс-анализатором с тем, чтобы разделить фрагменты на основе их m/z величин. На рисунке 9.16 приведены результаты масс-спектрометрического анализа, полученные для нескольких липидов.

 

а) б)

Рис. 9. 16. Примеры спектров некоторых фосфолипидов (смотри текст), полученных а) в отрицательной и б) положительной модах. Масс-спектры в интервале m/z от 400 до 1200 получены с помощью тройной квадрупольной ловушки и с использованием ESI, как источника ионов

Из рисунке 9.16 а видно, что при отрицательной моде регистрации в спектре присутствуют три липида: GPCho – глицерофосфохолин, GPEtn – глицерофосфоэтаноламин, GPSer – глицерофосфосерин, а при положительной моде (рис. 9.16 б) кроме первых трех выявляются еще и GPA – глицерофосфотидильная кислота, GPCho(Cl⁺) – глицеролфософотидилхолин, GPGro – глицерофосфоглицерол и GPIns – глицерофосфоинозитолгликан. Полный анализ спектров требует знания всех получающихся при этом фрагментов и в этом курсе лекций не рассматривается. Их подробное описание читатель может найти на специализированных сайтах LIPID MAPS.